Summary
Этот протокол описывает метод с использованием патч-зажима для изучения электрических реакций двигательных нейронов на стимуляцию спинного мозга (SCS) с высоким пространственно-временным разрешением, который может помочь исследователям улучшить свои навыки в разделении спинного мозга и поддержании жизнеспособности клеток одновременно.
Abstract
Стимуляция спинного мозга (СКС) может эффективно восстановить локомоторную функцию после травмы спинного мозга (ТСМ). Поскольку двигательные нейроны являются конечной единицей для выполнения сенсомоторного поведения, непосредственное изучение электрических реакций двигательных нейронов с помощью SCS может помочь нам понять логику, лежащую в основе спинномозговой моторной модуляции. Для одновременной регистрации различных характеристик стимулов и клеточных реакций патч-зажим является хорошим методом изучения электрофизиологических характеристик в масштабе одной клетки. Тем не менее, все еще существуют некоторые сложные трудности в достижении этой цели, включая поддержание жизнеспособности клеток, быстрое отделение спинного мозга от костной структуры и использование SCS для успешного индуцирования потенциалов действия. В данной работе мы представляем подробный протокол с использованием патч-зажима для изучения электрических реакций двигательных нейронов на СКС с высоким пространственно-временным разрешением, который может помочь исследователю улучшить свои навыки по разделению спинного мозга и поддержанию жизнеспособности клеток, чтобы беспрепятственно изучить электрический механизм СКС на двигательном нейроне и избежать ненужных проб и ошибок.
Introduction
Стимуляция спинного мозга (СКС) может эффективно восстановить локомоторную функцию после травмы спинного мозга (ТСМ). Andreas Rowald et al. сообщили, что SCS обеспечивает функцию опорно-двигательного аппарата и туловища нижних конечностей в течение одного дня1. Изучение биологического механизма СКС для восстановления опорно-двигательного аппарата является важной и актуальной областью исследований для разработки более точной стратегии СКС. Например, команда Грегуара Куртина продемонстрировала, что возбуждающий интернейрон Vsx2 и нейроны Hoxa10 в спинном мозге являются ключевыми нейронами для ответа на SCS, а клеточно-специфическая нейромодуляция возможна для восстановления способности крыс ходить после ТСМ2. Тем не менее, лишь немногие исследования сосредоточены на электрическом механизме СКС в масштабе одной клетки. Хотя хорошо известно, что надпороговый стимул постоянным током может вызывать потенциалы действия (ОП) в классическом эксперименте с кальмарами 3,4,5, до сих пор неясно, как импульсная переменная электрическая стимуляция, такая как СКС, влияет на генерацию двигательного сигнала.
Учитывая сложность интраспинальных нейронных цепей, для исследования электрического механизма СКС важен соответствующий отбор клеточной популяции. Несмотря на то, что СКС восстанавливает двигательную функцию, активируя проприоцептивный путь6, двигательные нейроны являются последней единицей для выполнения двигательной команды, полученной путем интеграции афферентного входа7 проприоцептивной информации. Таким образом, непосредственное изучение электрических характеристик двигательных нейронов с помощью СКС может помочь нам понять логику, лежащую в основе спинальной моторной модуляции.
Как известно, патч-клам является золотым стандартом клеточной электрофизиологической регистрации с чрезвычайно высоким пространственно-временным разрешением8. Поэтому в данной работе описан метод с использованием патч-зажима для изучения электрических реакций двигательных нейронов на СКС. По сравнению с головным мозгом, патч-зажим9 является более сложным по следующим причинам: (1) Спинной мозг защищен позвоночным каналом с крошечным объемом, который требует очень тонких микроманипуляций и строгого ледяного поддержания для достижения лучшей жизнеспособности клеток. (2) Поскольку спинной мозг слишком тонкий, чтобы его можно было закрепить на лотке для резки, его следует погрузить в агарозу с низкой температурой плавления и обрезать после затвердевания.
Таким образом, этот метод дает технические возможности в рассечении спинного мозга и одновременном поддержании жизнеспособности клеток, чтобы плавно изучить электрический механизм СКС на двигательных нейронах и избежать ненужных проб и ошибок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию одобрил все эксперименты на животных, и исследования были проведены в соответствии с соответствующими правилами защиты животных.
1. Подготовка животных
- Животные
- Информация о содержании: Домашние крысы-самцы Спрэга-Доули (послеродовой период 10-14 дней, P10-P14) в специфической среде, свободной от патогенов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия в помещении поддерживались на уровне 20 °C ± 2 °C, влажность: 50%-60%, с 12-часовым циклом света/темноты. Животные имели свободный доступ к пище и воде. - Ретроградная маркировка двигательных нейронов: инъекция фторзолота (FG) в двустороннюю переднюю большеберцовую мышцу и икроножную мышцу (2% в стерильном физиологическом растворе, 50 мкл на мышцу), чтобы ретроградно пометить двигательные нейроны за 2 дня до жертвоприношения.
- Информация о содержании: Домашние крысы-самцы Спрэга-Доули (послеродовой период 10-14 дней, P10-P14) в специфической среде, свободной от патогенов.
- Решения
- Приготовьте режущий раствор: смешайте 120 мМ холина хлорида, 2,6 мМ KCl, 26 мМ NaHCO 3, 1,25 мМ 2 PO4, 0,5 мМ CaCl 2, 7 мМ MgCl2, 1,3 мМ аскорбиновой кислоты, 15 мМ глюкозы. Предварительно взбалтывают раствор с 95% О2 и 5%СО2 (доведите до рН 7,4 с КОН) в течение 30 мин перед вскрытием и нарезкой. Остудите раствор колотым льдом.
- Приготовление искусственной спинномозговой жидкости (ОКСФ): смешать 126 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 1,2 мМ2PO4; 1,3 мМ MgCl 2, 2,4 мМ CaCl2, 26 мМ NaHCO3 и 10 мМ глюкозы. Предварительно взбалтывайте раствор с 95% О2 и 5%СО2 за 30 мин до инкубации.
- Приготовьте внутриклеточный раствор: смешайте 126 мМ К-глюконат, 2 мМ KCl, 2 мМ MgCl 2, 0,2 мМ EGTA, 10 мМ HEPES, 4 мМNa2АТФ, 0,4 мМ Na2ГТФ, 10 мМ К-фосфокреатина и 0,5% нейробиотина (рН 7,25 и 305 мОсм/кг). Остудите раствор колотым льдом.
- Приготовьте легкоплавкий агарозный гель: растворите 4 г агарозы в 100 мл режущего раствора и используйте магнитный ротор для перемешивания, чтобы полностью растворить его. За 30 мин до заделки нагрейте агарозу с низкой температурой плавления в микроволновой печи на высокой мощности в течение 1 мин, а затем переложите ее на водяную баню с температурой 39 °C для поддержания жидкого состояния.
- Подготовка инструмента
- Поместите колотый лед на перфузионный лоток (дополнительный рисунок 1A) за 10 минут до перфузии. Заранее поместите анатомический лоток (дополнительный рисунок 1B) и лоток для резки (дополнительный рисунок 1C) с водяной лентой при температуре -80 °C на ночь.
- Заранее поместите инкубационную камеру с нейлоновой сеткой в духовку при температуре 45 °C на ночь.
- Используйте агарозу с низкой температурой плавления для изготовления платформы с уклоном 35° и толщиной 2 мм (дополнительный рисунок 1D). После затвердевания геля поместите их в центр 35-миллиметровой чашки Петри, чтобы поддержать спинной мозг в следующих предстоящих процедурах.
- Интракардиальная перфузия
- Обезболивайте крыс 2,5% трибромэтанолом (160 мкл/10 г) путем внутрибрюшинной инъекции. Убедитесь, что крысы находятся под полным наркозом, проверив отсутствие реакции на внешние раздражители, такие как легкое пощипывание пальца ноги.
- Когда надлежащая анестезия будет подтверждена, уложите крыс на спину и обездвижьте их в чашке Петри, наполненной силикагелем.
- Вырезают 5-миллиметровый продольный разрез кожи каудально к мечевидному отростку, затем полностью расширяют подкожное пространство. Сделайте 2-сантиметровый продольный разрез кожи вдоль вентральной средней линии, чтобы полностью обнажить наружную грудную стенку, начиная с вышеупомянутого разреза и заканчивая верхней частью грудной клетки.
- Используйте зубчатый пинцет, чтобы поднять мечевидный узел (дополнительный рисунок 2A), а затем используйте тонкие ножницы, чтобы разрезать диафрагму. Разрежьте грудину по обеим сторонам мечевидного отростка, чтобы открыть грудную клетку и обнажить сердце (дополнительный рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы сохранить внутренние грудные сосуды с обеих сторон; В противном случае это может вызвать массивное кровотечение. - Используйте беззубый пинцет, чтобы поднять левый желудочек. Введите иглу 22 G в верхушку левого желудочка вдоль продольной оси левого желудочка (дополнительный рисунок 2C). При этом наблюдайте за ритмичной пульсацией крови в перфузионной трубке, иначе игла может проколоться в правый желудочек, что может привести к плохому перфузионному эффекту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует использовать зубчатый пинцет; В противном случае это может привести к дополнительному вытеканию крови из места удержания пинцета. - Тонкими ножницами разрежьте правое предсердие (дополнительный рисунок 2C), затем вручную введите 100 мл ледяной перфузионной жидкости со скоростью около 2 мл/с в течение 1 минуты.
Примечание: Когда печень и лапы крыс бледнеют, а кровь не вытекает из правого предсердия, можно добиться хорошей перфузии.
- Рассечение спинного мозга (рис. 1)
- Поместите крысу в положение лежа на животе и перережьте позвоночник в передней верхней подвздошной кости (примерно на уровне позвонка L4) и в точке смещения кривизны грудного столба (около уровня позвонка Т6) соответственно (рис. 1А). Затем немедленно поместите изолированный позвоночник в насыщенный кислородом ледяной перфузионный раствор, чтобы смыть остатки крови и жировой ткани; Эта процедура полезна для поддержания чистоты операционного поля в последующих процедурах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параспинальные мышцы должны быть зарезервированы, что способствует последующей фиксации позвоночника с помощью штифта в виде насекомых. - Немедленно переместите изолированный позвоночник в анатомическую лопатку (рис. 1B) тыльной стороной вверх и ростральным концом ближе к оператору. Наполните анатомический лоток 50 мл непрерывно насыщенного кислородом ледяного режущего раствора (Рисунок 1B).
- Используйте четыре штифта в виде насекомых, чтобы зафиксировать позвоночник, проникнув в параспинальные мышцы (рис. 1B).
- Под диссекционным микроскопом микроножницами разрезают ножки позвонков с обеих сторон от рострального конца, что можно назвать «ламинэктомией» (рис. 1С). Обратите внимание, чтобы не повредить спинной мозг. Тем временем используйте пинцет с микрозубьями, чтобы приподнять разрезанное тело позвонка.
- После ламинэктомии не следует сразу отделять спинной мозг от спинномозгового канала. Вместо этого используйте микроножницы, чтобы разрезать твердую мозговую оболочку вдоль дорсальной средней линии, что способствует поглощению питательных веществ между клетками и насыщенной кислородом ACSF (рис. 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не разрывайте твердую мозговую оболочку. Разрешается разрезать твердую мозговую оболочку микроножницами; В противном случае нервный корешок и паренхима позвоночника будут серьезно повреждены! - Приподнимите ростральную часть спинного мозга, затем осторожно отрежьте нервный корешок с запасом около 1 мм (рис. 1E). Отделив спинной мозг от позвоночного канала, используйте 2 штифта в виде насекомых, чтобы зафиксировать спинной мозг вентральной стороной вверх (рис. 1F).
- С помощью микроножниц разрежьте твердую мозговую оболочку вдоль вентральной срединной линии (рис. 1F). Отрежьте лишние нервные корешки, оставив около 1 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нерв гораздо более цепкий, чем спинной мозг. Если зарезервированный нервный корешок слишком длинный (>1 мм), вибратом не может отрезать нервный корешок, что может привести к серьезному разрыву паренхимы позвоночника. - С помощью микроножниц отделите поясничное увеличение до длины 6-7 мм (рис. 1G).
- Поместите крысу в положение лежа на животе и перережьте позвоночник в передней верхней подвздошной кости (примерно на уровне позвонка L4) и в точке смещения кривизны грудного столба (около уровня позвонка Т6) соответственно (рис. 1А). Затем немедленно поместите изолированный позвоночник в насыщенный кислородом ледяной перфузионный раствор, чтобы смыть остатки крови и жировой ткани; Эта процедура полезна для поддержания чистоты операционного поля в последующих процедурах.
- Встраивание в легкоплавкую агарозу
- Расположите поясничное расширение на склоне 35° (рис. 1H) тыльной стороной вверх и хвостовым концом вниз. Используйте впитывающую фильтровальную бумагу, чтобы удалить обильную воду с поверхности ткани (Рисунок 1H).
- Медленно влейте расплавленный агарозный гель в чашку Петри, содержащую поясничное увеличение (Рисунок 1I).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не наливайте слишком быстро, иначе в геле будут скапливаться пузырьки. - Поместите вышеуказанную чашку Петри в смесь льда и воды, чтобы гель как можно скорее охладился, что способствует поддержанию активности клеток.
- Обрежьте гель в кубик размером 15 мм x 10 мм x 10 мм и закрепите его на диске с образцом с помощью суперклея (рис. 1J).
- Разрезание на ломтики
- Поместите диск для образцов в предварительно замороженный режущий лоток, затем залейте ледяным режущим раствором (Рисунок 1K). Непрерывно пузырько с 95% CO 2 и 5% O2 в лоток для резки.
- Задайте параметры вибратома: толщина: 350 мкм; скорость: 0,14-0,16 мм/с, амплитуда: 1,0 мм, частота вибрации: 85 Гц.
- Заготавливают по 2-3 подходящих ломтика на одно животное. Запишите 1-2 здоровых двигательных нейрона FG+ на срез, с диапазоном 5-6 клеток на животное.
- Инкубация
- С помощью пинцета для крышки зафиксируйте ломтик (Рисунок 1L) и поместите его в инкубационную камеру, заполненную непрерывно насыщенным кислородом ACSF. Поместите инкубационную камеру на водяную баню при температуре 32 °C на 30 минут, а затем продолжайте инкубировать ее при комнатной температуре (RT) еще 30 минут перед записью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные процедуры, от анестезии до получения первого среза, должны быть завершены в течение 20-30 минут, чтобы максимально сохранить жизнеспособность клеток. Двигательные нейроны в каждом срезе могут сохранять свою жизнеспособность в течение примерно 6-7 часов.
- С помощью пинцета для крышки зафиксируйте ломтик (Рисунок 1L) и поместите его в инкубационную камеру, заполненную непрерывно насыщенным кислородом ACSF. Поместите инкубационную камеру на водяную баню при температуре 32 °C на 30 минут, а затем продолжайте инкубировать ее при комнатной температуре (RT) еще 30 минут перед записью.
2. Запись патч-зажимов с помощью СКС (рис. 2)
- Препараты
- Перфузируйте регистрирующую камеру непрерывно пузырчатым ACSF со скоростью около 1-2 мл/мин. Регулируйте расход индивидуально с помощью панели управления на перистальтическом насосе.
- Поместите срез в камеру записи. Используйте U-образную платиновую проволоку с нейлоновыми нитями, чтобы надежно стабилизировать срез на месте.
- Используйте инфракрасный дифференциально-интерференционный контрастный микроскоп (IR-DIC) для наблюдения за срезом. Под линзой объектива 4x убедитесь, что длина дорсального корня составляет около 1 мм. Найдите область, где дорсальный корешок входит в паренхиму, затем переместите центральное поле зрения в эту область.
- Соедините генератор импульсов с электродами, изготовленными по индивидуальному заказу (рис. 2А).
- Конфигурация СКС
- Расположите анод СКС рядом с дорсальной срединной линией с помощью системы микроманипуляций (рис. 2Б).
- Разместите катод СКС рядом с зоной входа дорсального корня (DREZ) с помощью микроманипуляционной системы (рис. 2B).
- Нацеливание на клетки и визуализация
- С помощью ИК-DIC с объективом с 10-кратным увеличением найдите дорсолатеральную область двигательной колонки, где расположено большинство двигательных нейронов. Затем переместите центральное поле зрения в эту область.
- Переключитесь на объектив с 60-кратным увеличением, чтобы найти здоровый нейрон с гладкой и яркой поверхностью и невидимыми ядрами (рис. 2C, F).
- Немного уменьшите интенсивность ИК-излучения и включите флуоресцентный источник света. Переключите светофильтр на широкополосный ультрафиолетовый возбуждающий фильтр (рис. 2D, G), чтобы выбрать соответствующий FG-положительный (FG+) двигательный нейрон (рис. 2E, H).
- Используйте отсасывающие электроды, чтобы применить стимуляцию 1x двигательного порога к дорсальному корешку. Если вызванный потенциал действия обнаруживается в двигательных нейронах (дополнительный рисунок 3), это подтверждает, что активность дорсального корешка не нарушена. Если нет, этот кусочек следует выбросить.
- Запись с помощью патч-зажимов
- Наполните микропипетку внутриклеточным раствором и вставьте ее в электрододержатель. Используйте систему микроманипуляций, чтобы опустить пипетку в ванну ACSF. Сопротивление пипетки колеблется в пределах 5-8 МОм.
- Приложите небольшое положительное давление к пипетке, чтобы сдуть пыль и клеточный мусор.
- Опустите электрод, чтобы приблизиться к элементу. При соприкосновении пипетки с поверхностью нейрона FG+ на уровне наконечника становится видно небольшое углубление мембраны. Отпустите положительное давление.
- Затем приложите небольшое отрицательное давление к пипетке с помощью шприца. При этом создается небольшое количество всасывания, которое втягивает клеточную мембрану в контакт со стеклянной пипеткой. Всегда обращайте внимание на общее сопротивление в программном интерфейсе до тех пор, пока значение сопротивления не увеличится до гигаомов (>1 ГОм). Затем образуется гигазеаль.
- Зажмите мембранный потенциал при -70 мВ, затем нажмите кнопку быстрой компенсации емкости на программном интерфейсе усилителя. Осторожно примените кратковременное отрицательное давление, чтобы разорвать клеточную мембрану, затем нажмите кнопку компенсации медленной емкости на программном интерфейсе усилителя. На этом этапе получается хорошая цельноклеточная конфигурация.
- Переключитесь в режим токоизмерительных клещей, нажав кнопку IC в интерфейсе программного обеспечения, и запишите мембранный потенциал покоя (RMP).
- Применяют СКС в течение 1-2 с амплитудой 1-10 мА, при этом ширина и частота импульсов фиксируются на уровне 210 мкс и 40 Гц соответственно. Определите двигательный порог, медленно увеличивая амплитуду стимуляции до тех пор, пока не будет наблюдаться первое АД.
- Различают замедленное и немедленное возбуждение мотонейронов с помощью 5-секундной инжекции деполяризационного тока вокруг реобазы в режиме токо-клещей10,11,12. Немедленное возбуждение двигательных нейронов: низкое реооснование может индуцировать немедленное и повторяющееся возбуждение со стабильной частотой возбуждения; Замедленное возбуждение двигательных нейронов: Высокое реооснование может индуцировать отсроченное начало повторяющегося возбуждения с ускорением частоты возбуждения (рис. 3).
- Когда SCS выключена, продолжайте записывать мембранный потенциал для захвата самопроизвольного срабатывания ТД.
- Выполнение записей с помощью поклещи напряжения для возбуждающего постсинаптического тока (EPSC) при включенном и выключенном SCS. Параметр стимуляции составляет 1x двигательный порог, 210 мкс, 2 Гц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Благодаря строгому низкотемпературному поддержанию во время тонкой работы (дополнительный рисунок 1, дополнительный рисунок 2 и рисунок 1) жизнеспособность ячейки была достаточно хорошей, чтобы выполнять последующие электрофизиологические записи. Чтобы максимально смоделировать клинический сценарий, мы использовали микроманипуляции для размещения катода и анода SCS рядом с дорсальной срединной линией и DREZ соответственно (рис. 2), что могло инициировать нейронный сигнал в дорсальном роге для распространения к двигательным нейронам в дорсолатеральной области двигательной колонки. В данном исследовании мы использовали FG для локализации двигательных нейронов диаметром 20-50 мкм. Как показано на рисунке 2D,G, мы уверенно подтвердили наличие здорового нейрона FG+ в качестве двигательного нейрона – терминала спинномозговой цепи. Этот метод маркировки проложил путь к изучению того, как SCS влияет на схему стрельбы. Электрофизиологические свойства моторных нейронов замедленного и немедленного возбуждения приведены в Дополнительной таблице 1 и Дополнительной таблице 2. Методы расчета активных и пассивных свойств приведены в Дополнительном файле 1.
Когда СКС доставлял импульсное переменное электрическое поле в спинномозговой срез, мы впервые использовали режим тококоизмерительных клещей для регистрации отклика мембранного потенциала (рис. 4). По мере того, как мы постепенно увеличивали амплитуду стимуляции с шагом в 1/3 двигательного порога (рис. 4B, C), мембранный потенциал также увеличивался вместе с ним, но только 1-кратный двигательный порог мог вызвать Aps (рис. 4D). На рисунке 4D показано, что примерно каждые 10-20 импульсов могут вызывать АР, что указывает на то, что может существовать определенная регулярность ответа АР на амплитуду СКС.
После отключения СКС мы продолжили регистрацию мембранного потенциала. На рисунке 5 видно, что мембранный потенциал незначительно увеличился до -60 мВ, и нейрон инициировал серию спонтанных АФ. Эти спонтанные АП длятся в течение короткого промежутка времени (30-40 с), затем мембранный потенциал возвращается к -65 мВ, что указывает на то, что СКС может временно повышать возбудимость клетки.
Затем мы использовали записи напряжения для EPSC при включении и выключении SCS (рис. 6). После каждого импульса SCS можно было обнаружить вызванный EPSC. Латентность между артефактом стимула и EPSC составила 2,64 ± 0,38 мс (дополнительный рисунок 4). Амплитуда вызванных ЭПСК составила 35,14 ± 12,73 пА (дополнительный рисунок 4). Частота вызванных ЭПСК согласуется с частотой СКС. После вычитания пассивной балансировки заряда вызванный EPSC можно наблюдать в жизнеспособном двигательном нейроне после 1-кратной стимуляции двигательного порога (дополнительный рисунок 5A). Полярность стимуляции менялась на противоположную после остановки перфузии в течение 2 ч в той же клетке. Стимуляция не индуцировала ЭПСК, что подтверждает, что вызванный ЭПСК не является артефактом (дополнительный рисунок 5В).
Рисунок 1: Рассечение и срез спинного мозга . (A) Разрезать позвоночник в передней верхней подвздошной кости (примерно на уровне позвонка L4) и в точке смещения кривизны грудного столба (около уровня позвонка Т6), соответственно. (B) Немедленно переместите изолированный позвоночник в анатомическую лопатку тыльной стороной вверх, а ростральным концом ближе к оператору. Наполните анатомический лоток постоянно насыщенным кислородом ледяным режущим раствором. (C) Выполните ламинэктомию с обеих сторон от рострального конца. (D) Разрезать дорсальную твердую мозговую оболочку, которая способствует поглощению питательных веществ между клетками и насыщенной кислородом искусственной спинномозговой жидкостью (ACSF). (E) Осторожно разрежьте нервный корешок. (F) Разрезать брюшную твердую мозговую оболочку. (Г) Отделите поясничное расширение до длины 6-7 мм. (H) Расположите поясничное расширение на наклоне 35° дорсальной стороной вверх и хвостовым концом вниз. Используйте впитывающую фильтровальную бумагу, чтобы удалить обильную воду с поверхности ткани. (I) Медленно влейте расплавленный агарозный гель в чашку Петри. (J) Обрежьте гель в куб и закрепите его на диске с образцом с помощью суперклея. (К) Поместите диск для образцов в лоток для резки, затем залейте ледяным режущим раствором. (Л) Пример среза позвоночника при увеличении поясничного отдела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Конфигурация стимуляции спинного мозга (SCS) и визуализация двигательных нейронов . (A) Генератор импульсов со специально изготовленными электродами может отдельно регулировать амплитуду, ширину импульса и частоту. Входное отверстие показало, что размерная спецификация электродного контакта составляет 800 мкм x 500 мкм x 300 мкм. (B) Разместите анод и катод рядом со средней линией дорсальной стороны и зоной входа дорсального корня (DREZ) с помощью системы микроманипуляций, соответственно. Поместите записывающую пипетку в дорсолатеральную область двигательной колонки, чтобы зажать фтор-золотые (FG+) двигательные нейроны. (C) Здоровый двигательный нейрон немедленного возбуждения с инфракрасным дифференциально-интерференционным контрастным микроскопом (IR-DIC) (60x). (D) Тот же самый нейрон с флуоресцентной визуализацией (60x), сияющие частицы фторзолота (FG) представляют собой то, что этот нейрон является моторным нейроном. (Д) Объединенное изображение ИК-ДВС-излучения и флуоресценции в мотонейроне FG+. (Ф-Х) Здоровый двигательный нейрон замедленного возбуждения с ИК-ДВС-визуализацией (60x). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Различение моторных нейронов с замедленным и немедленным возбуждением с помощью инжекции деполяризационного тока в течение 5 с. (A) Немедленное возбуждение двигательных нейронов: низкое реооснование может индуцировать немедленное и повторяющееся возбуждение со стабильной частотой возбуждения; (Б) Замедленное возбуждение двигательных нейронов: Высокое содержание реобазы может вызвать отсроченное начало повторяющегося возбуждения с ускорением частоты возбуждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Стимуляция спинного мозга (СКС) вызвала срабатывание потенциалов действия (ОП) в двигательных нейронах . (А) Когда стимуляция не применялась, мембранный потенциал покоя (RMP) составлял -65 мВ. (Б) 1/3-кратный стимул двигательного порога не может вызвать АП. (В) 2/3-кратный двигательный пороговый стимул не может вызвать АП. (D) 1-кратный двигательный пороговый стимул может вызвать АД, а каждые 10-20 импульсов могут вызвать АД. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Срабатывание потенциалов спонтанного действия (ОП) после стимуляции спинного мозга (СКС). После выключения СКС нейрон в течение короткого промежутка времени (30-40 с) запускал серию спонтанных АР, после чего мембранный потенциал покоя (RMP) возвращался к -65 мВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Иллюстрация параметра стимуляции спинного мозга (СКС) и вызванного возбуждающего постсинаптического тока (ЭПСК). (А) Иллюстрация параметра СКС; (В,В) После одного импульса стимуляции (1x стимуляция двигательного порога) можно наблюдать вызванный EPSC; (D) После вычитания пассивной балансировки заряда можно рассчитать задержку и амплитуду EPSC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Подготовка прибора. (A) Перфузионный лоток: за 10 минут до перфузии поместите колотый лед в 10-сантиметровую чашку Петри, наполненную силикагелем. (B) Анатомический лоток: в ночь перед жертвоприношением поместите самодельный анатомический лоток, наполненный силикагелем, в холодильник с температурой -80 °C. (C) Противень для резки: в ночь перед жертвоприношением поместите противень для резки с лентой для воды в холодильник с температурой -80 °C. (D) Наклон агарозы: за 30 мин до перфузии поместите агарозный наклон 35° с опорными пластинами в центр чашки Петри диаметром 35 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Интракардиальная перфузия. (А) Поднимите мечевидный отросток. (B) Разрежьте грудину по обеим сторонам мечевидного отростка, чтобы открыть грудную клетку и обнажить сердце. Будьте осторожны, чтобы не повредить внутренние грудные сосуды, иначе массивное кровотечение заполнит все операционное поле и затруднит оператору идентификацию верхушки желудочка или правого предсердия. (C) Введите иглу 22 G в верхушку левого желудочка для перфузии и разрежьте правое предсердие для выхода жидкости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Подтверждение активности дорсального корня. Используйте отсасывающие электроды, чтобы применить стимуляцию 1x двигательного порога к дорсальному корешку. Если в двигательных нейронах обнаружен вызванный потенциал действия, мы можем подтвердить, что активность дорсального корешка не нарушена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 4: Задержка и амплитуда вызванных EPSC при включенном SCS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 5: Демонстрация действительности вызванного EPSC. (А) После 1-кратной стимуляции двигательного порога после вычитания пассивной балансировки заряда в жизнеспособном мотонейроне можно наблюдать вызванный EPSC; (Б) После остановки перфузии на 2 ч в той же клетке полярность стимуляции менялась на противоположную, стимуляция 1x двигательного порога не индуцировала ЭПСК, что подтвердило, что вызванный ЭПСК не был артефактом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 1: Методы расчета активных и пассивных свойств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица 1: Пассивные свойства двигательных нейронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица 2: Активные свойства двигательных нейронов Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Информация о движении, модулированная СКС, наконец, конвергентна к двигательным нейронам. Таким образом, использование двигательных нейронов в качестве объекта исследования может упростить дизайн исследования и более непосредственно раскрыть механизм нейромодуляции СКС. Для одновременной регистрации различных характеристик стимулов и клеточных реакций патч-зажим является хорошим методом изучения электрофизиологических характеристик в масштабе одной клетки. Тем не менее, все еще существуют некоторые трудности, в том числе как поддерживать жизнеспособность клеток, как быстро отделить спинной мозг от костной структуры и как использовать SCS для успешного индуцирования АП. Таким образом, это исследование направлено на то, чтобы помочь исследователям быстро овладеть основными операционными навыками, избежать некоторых возможных ловушек и как можно раньше сосредоточиться на дизайне исследования, а не на методологии.
Для получения хорошей жизнеспособности клеток всегда следует обращать внимание на следующие детали: (1) Поддержание температуры спинного мозга при ледяной температуре очень важно, потому что низкая температура может ингибировать гибель клеток и замедлять скорость метаболизма, что может защитить нейрон от механических повреждений во время перфузии, диссекции и разрезания13; (2) Деликатное удаление твердой мозговой оболочки микроножницами может улучшить поглощение нейронами питательных веществ из окружающих растворов. Никогда не снимайте твердую мозговую оболочку напрямую; В противном случае спинной мозг будет серьезно поврежден. Кроме того, если вы забудете очистить твердую мозговую оболочку, последующий процесс нарезки может быть затруднен, потому что лезвие может не полностью срезать твердую мозговую оболочку, а затем вырвать оставшийся спинной мозг из агарозы, что может привести к неудаче нарезки. (3) По сравнению с обычным поперечным срезом, косые срезы увеличивают площадь серого вещества, и вы можете найти больше двигательных нейронов FG+ в одном срезе9. (4) Поскольку спинной мозг сам по себе не может быть прочно закреплен на диске образца, как головной мозг, встраивание его в агарозный гель эффективно для решения этой проблемы без снижения жизнеспособности клеток. Мы рекомендуем использовать легкоплавкую агарозу (гелевая точка 26-30 °C), а не обычную агарозу (гелевая точка 38-43 °C), поскольку высокая температура может повредить жизнеспособность клетки. (5) Мы рекомендуем, чтобы расстояние между двумя нейлоновыми нитями U-образной платиновой проволоки составляло от 1 до 1,5 мм, потому что свободные нити не могут прочно обездвижить спинной мозг, а плотные нити могут раздавить клетку.
По сравнению с обычными устройствами стимуляции, такими как биполярные крюковые электроды, широко используемые в фундаментальных исследованиях, электрод SCS в этом исследовании основан на нашей предыдущей клинической работе14 и фундаментальном исследовании15. СКС обеспечивает импульсную переменную электростимуляцию, которая обеспечивает различные параметры регулировки размеров. Это устройство SCS также имеет функцию баланса заряда, чтобы избежать электролиза тканей, и не контактирует напрямую с нервной тканью; Таким образом, этот SCS обладает хорошей безопасностью для применения in vivo .
После лечения ГКС спонтанные АФ мотонейронов могут быть связаны со следующими причинами: (1) ГКС индуцирует накопление заряда в теле клетки и аксональном колликулусе нейронов, что приводит к увеличению RMP16. Это явление указывает на то, что ГКС может улучшать возбудимость нейронов, что может быть связано с изменением проводимости ионных каналов после СКС, таких как Na v 1.117, K v 2.1 18 или Ca v 2.3 19. (2) SCS может активировать дорсальные ГАМКергические нейроны, чтобы облегчить проприоцептивную обратную связь с двигательными нейронами. Мы предполагаем, что между сенсорными нейронами и мотонейронами может непрерывно существовать нейронная передача, приводящая к спонтанным АП в мотонейронах после СКС. Спонтанные АП могут поддерживать внутреннее состояние готовности к выполнению сенсомоторного поведения20. Таким образом, активация или ингибирование спонтанных АП может быть полезным для лечения неврологических заболеваний позвоночника.
Как известно, электрофизиологическая регистрация in vivo лучше подходит для выявления электрофизиологической реакции при естественном распределении электрического поля и размещении электродов. Кроме того, записи мотонейронов in vivo позволяют идентифицировать идентичность мотонейронов. Это может быть достигнуто с помощью антидромной идентификации моторных аксонов в сочетании с измерением силы мышечных волокон21. Но записи спинного мозга in vivo имеют и следующие недостатки: (1) Двигательный нейрон находится на расстоянии 2-3 мм от дорсальной поверхности спинного мозга, даже при использовании самой совершенной двухфотонной конфокальной визуализации глубина наблюдения составляет всего 500-800 мкм, поэтому оптически наблюдать их in vivo существующими методами сложно. Поэтому, если мы хотим точно зажать один двигательный нейрон in vivo, стеклянная пипетка должна пройти через дорсальную колонку, чтобы добраться до невидимого двигательного нейрона; Патч-зажим in vivo может быть выполнен только «слепым» способом, что приводит к значительной неопределенности и частоте отказов. (2) За исключением патч-зажима in vivo , альтернативным методом может быть запись с помощью кремниевых электродов, таких как матрица Юта или электрод Neuropixels. Тем не менее, сигналы, регистрируемые кремниевыми электродами, в основном представляют собой потенциал сложного действия, а не потенциала одиночного действия. Несмотря на то, что активность одиночных нейронов была решена с помощью алгоритмов сортировки спайков, точность и надежность алгоритмов сортировки все еще нуждаются в улучшении.
По сравнению с записями in vivo, наибольшим преимуществом in vitro по сравнению с in vivo является использование зажима напряжения, который позволяет получить уникальное понимание синаптических путей, активируемых SCS. Кроме того, это также позволит использовать инструменты визуализации в реальном времени. Мы предполагаем, что SCS индуцирует высвобождение нейротрансмиттеров, таких как ГАМК и глутамат, из нейронов верхнего уровня на двигательные нейроны, что приводит к общему возбуждающему ответу EPSC7. Таким образом, в нашем предстоящем исследовании мы включим обнаружение IPSC, мини-EPSC (mEPSC) и вызванного EPSC, индуцированного SCS, чтобы прояснить паттерны ингибирующего и возбуждающего высвобождения нейротрансмиттеров из премоторных нейронов или интернейронов. Мы полностью признали, что стимуляция in vitro также имеет некоторые ограничения: (1) нарушается дальняя продольная цепь спинного мозга, что приводит к потере поступающей информации от моторной коры или нижней конечности; (2) Распределение электрических полей при стимуляции in vitro может отличаться от такового при стимуляции in vivo. В этом исследовании порог активации (примерно в миллиамперах) для АФ был значительно выше, чем в эксперименте in vivo (примерно в микроамперах)15; Это было связано с тем, что объемная емкость раствора ACSF в регистрирующей камере была намного выше, чем у спинномозговой жидкости в естественном состоянии, а математическая теория подтверждает, что электрическое поле затухает быстрее в материалах с высокой проводимостью22. Таким образом, большая часть тока была поглощена раствором ванны, и мы предполагаем, что только небольшая часть электрического поля может диффундировать к нервным корешкам.
Таким образом, рассматривая преимущества и недостатки стимуляции in vivo и стимуляции in vitro , можно сделать вывод, что in vitro пластырь-зажим является выгодным методом изучения синаптической природы и/или клеточных эффектов ГКС у неонатальных грызунов.
В клинической практике электрод не сжимает непосредственно поверхность спинного мозга или нервного корешка23. Вместо этого он полагается на излучение электрического поля, генерируемое электродом, чтобы косвенно влиять на активность нервов1. Многочисленные исследования 1,23,24 подтвердили, что катодный контакт ГКС должен быть расположен как можно ближе к дорсальному корешку или входной зоне (DREZ) для достижения оптимальной селективности стимуляции конкретной мышцы. Увеличение расстояния между электродом и нервным корешком ослабит специфичность стимуляции. Таким образом, мы размещаем катод непосредственно рядом с DREZ, а не непосредственно контактируем с нервным корешком или спинным мозгом.
Афферентные волокна дорсального корешка сначала проецируются на сенсорные нейроны, затем на интернейроны и двигательные нейроны. Помимо поперечных проекционных контуров, существуют также цепи, которые проецируются к ростральному и каудальному концам. Например, двигательные нейроны, соответствующие передней большеберцовой мышце, могут быть обнаружены на нескольких уровнях25. Таким образом, несмотря на то, что косая подготовка может разорвать поперечные проекционные цепи, она все же сохранит непоперечные проецирующие волокна, что позволит изучать премоторные сенсорные схемы. В дополнение к косому и поперечному препарированию, продольная препарация имеет явные преимущества для лучшего сохранения цепей от дорсального корешка до двигательных нейронов и позволяет эффективно удерживать цепи спинного мозга в нескольких сегментах26, что обеспечивает более точное представление о реальных физиологических условиях.
Согласно симуляционным исследованиям 6,27,28, ГКС в основном активирует проприоцептивные афферентные волокна для восстановления движения нижних конечностей, включая афферентные волокна Ia, Ib и II. Тем не менее, в этом исследовании мы не можем с уверенностью подтвердить, какие виды волокон были специфически активированы SCS. Мы предполагаем, что аналогичная картина может существовать и в зажиме пластыря in vitro. Мы будем решать эту проблему, проводя математическое моделирование и внедряя их в нашу текущую работу.
В заключение, этот протокол может помочь исследователям улучшить свои оперативные навыки и понять основы объединения записей с патч-зажимами и SCS для исследования электрического механизма SCS в масштабе одной клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никакой
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая для молодых ученых (52207254 и 82301657) и Китайским фондом постдокторантуры (2022M711833).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
