Summary
このプロトコルは研究者が脊髄を分け、細胞生存率を同時に維持することの彼らの技術を改善するのを助けることができる高い時空間決断の脊髄の刺激(SCS)への運動ニューロンの電気応答を調査するのにパッチ・クランプを使用して方法を記述する。
Abstract
脊髄刺激(SCS)は、脊髄損傷(SCI)後の自発運動機能を効果的に回復させることができます。運動ニューロンは感覚運動行動を実行する最後のユニットであるため、SCSによる運動ニューロンの電気的応答を直接研究することは、脊髄運動調節の根底にあるロジックを理解するのに役立ちます。多様な刺激特性と細胞応答を同時に記録するには、パッチクランプが単一細胞スケールで電気生理学的特性を研究するのに適した方法です。しかし、この目標を達成するには、細胞の生存率を維持すること、脊髄を骨構造から迅速に分離すること、SCSを使用して活動電位をうまく誘導することなど、まだいくつかの複雑な困難があります。本稿では、運動ニューロンのSCSに対する電気的応答を高い時空間分解能で研究し、脊髄の分離と細胞生存率の維持を同時に行う技術を向上させ、運動ニューロン上のSCSの電気的メカニズムを円滑に研究し、無駄な試行錯誤を避けるための詳細なプロトコールを提示する。
Introduction
脊髄刺激(SCS)は、脊髄損傷(SCI)後の自発運動機能を効果的に回復させることができます。Andreas Rowaldらは、SCSが下肢の自発運動と体幹機能を1日で可能にすることを報告しました1。自発運動回復のためのSCSの生物学的メカニズムを探ることは、より正確なSCS戦略を開発するための重要かつトレンドの研究分野です。例えば、Grégoire Courtineのチームは、脊髄の興奮性Vsx2介在ニューロンとHoxa10ニューロンがSCSに応答する重要なニューロンであり、細胞特異的なニューロモデュレーションがSCI2後のラットの歩行能力を回復するために実行可能であることを実証しました。しかし、単一細胞スケールでのSCSの電気的メカニズムに焦点を当てた研究はほとんどありません。古典的なイカ実験3,4,5では、閾値超の直流刺激が活動電位(AP)を誘発できることはよく知られていますが、SCSなどのパルス交流電気刺激が運動信号の生成にどのように影響するかはまだ不明です。
脊髄内神経回路の複雑さを考えると、SCSの電気的メカニズムを調べるためには、細胞集団の適切な選択が重要です。SCSは固有受容経路6を活性化することによって運動機能を回復させるが、運動ニューロンは、固有受容感覚情報の求心性入力7の統合から導かれる運動指令を実行する最後の単位である。したがって、SCSで運動ニューロンの電気的特性を直接研究することは、脊髄運動調節の根底にある論理を理解するのに役立ちます。
周知のように、パッチクランプは、極めて高い時空間分解能を有する細胞電気生理学的記録のゴールデンスタンダードな方法である8。そこで、本研究では、SCSに対する運動ニューロンの電気的応答を研究するためにパッチクランプを用いて方法を検討する。脳パッチクランプ9と比較して、脊髄パッチクランプは、以下の理由により、より困難である:(1)脊髄は、より優れた細胞生存率を得るために、非常に細かいマイクロマニピュレーションと厳密な氷冷メンテナンスを必要とする、小さな体積の脊柱管によって保護されている。(2)脊髄は細すぎて切断トレイに固定できないため、低融点アガロースに浸漬し、固化後にトリミングする必要があります。
したがって、この方法は、脊髄を解剖し、同時に細胞の生存率を維持するための技術的な詳細を提供し、運動ニューロン上のSCSの電気的メカニズムをスムーズに研究し、不必要な試行錯誤を回避します。
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Protocol
施設動物実験委員会は、すべての動物実験を承認し、研究は関連する動物福祉規則に従って実施されました。
1.動物の調製
- 動物
- 住居情報:特定の病原体のない環境での雄のSprague-Dawleyラット(出生後10〜14日、P10〜P14)を飼育します。
注:室内条件は20°C±2°C、湿度:50%〜60%、12時間の明暗サイクルで維持されました。動物は食べ物と水を自由に入手できました。 - 運動ニューロンを逆行性に標識する:フルオロゴールド(FG)を両側脛骨筋前部および腓腹筋に注射して(滅菌生理食塩水で2%、筋肉あたり50μL)、犠牲の2日前に運動ニューロンを逆行性標識します。
- 住居情報:特定の病原体のない環境での雄のSprague-Dawleyラット(出生後10〜14日、P10〜P14)を飼育します。
- ソリューション
- 切断液を調製する:120 mM 塩化コリン、2.6 mM KCl、26 mM NaHCO 3、1.25 mM NaH 2 PO4、0.5 mM CaCl 2、7 mM MgCl2、1.3 mM アスコルビン酸、15 mM グルコースを混合します。解剖およびスライスの前に、95% O 2および5% CO2で溶液を30分間プレバブル化します(KOHでpH 7.4に調整します)。砕いた氷で溶液を冷やします。
- 人工脳脊髄液(ACSF)の調製:126 mM NaCl、3 mM KCl、1.2 mM NaH2PO4を混合します。1.3 mM MgCl 2、2.4 mM CaCl2、26 mM NaHCO3、および 10 mM グルコース。インキュベーションの前に、溶液を95%O 2および5%CO2で30分間プレバブル化します。
- 細胞内溶液の調製:126 mM K-グルコン酸、2 mM KCl、2 mM MgCl 2、0.2 mM EGTA、10 mM HEPES、4 mM Na 2 ATP、0.4 mM Na2GTP、10 mM K-クレアチン、および0.5%ニューロビオチン(pH 7.25および305 mOsm/Kg)を混合します。砕いた氷で溶液を冷やします。
- 低融点アガロースゲルの調製:4gのアガロースを100mLの切断液に溶解し、磁気攪拌ローターを使用して完全に溶解します。包埋の30分前に、低融点アガロースを電子レンジで高出力で1分間加熱した後、39°Cのウォーターバスに移して液体状態を維持します。
- 装置の準備
- 灌流の10分前に砕いた氷を灌流トレイ(補足図1A)に置きます。解剖学的トレイ(補足図1B)とカッティングトレイ(補足図1C)を水バンドで-80°Cで一晩前置きます。
- ナイロンメッシュのインキュベーションチャンバーを45°Cのオーブンに一晩入れておきます。
- 低融点アガロースを使用して、35°の傾斜と厚さ2mmのプラットフォームをプレハブします(補足図1D)。ゲルが固まったら、35mmのシャーレの中央に置き、次の手順で脊髄を支えます。
- 心臓内灌流
- 腹腔内注射により、ラットに2.5%トリブロモエタノール(160 μL / 10 g)を麻酔します。.足の指を軽くつまむなどの外部刺激に反応しないことを確認して、ラットが完全に麻酔されていることを確認します。
- 適切な麻酔が確認されたら、ラットを仰臥位に置き、シリカゲルで満たされたペトリ皿に固定します。
- 剣状突起まで5mmの縦方向の皮膚切開を尾側に切り、皮下空間を完全に広げます。腹側正中線に沿って2cmの縦方向の皮膚切開を切り、上記の切開から胸の上部まで、胸壁の外側を完全に露出させます。
- 歯付きピンセットを使用して剣状骨を持ち上げ( 補足図2A)、次に細いハサミを使用して横隔膜を切断します。剣状突起の両側に沿って胸骨を切断して胸を開き、心臓を露出させます(補足図2B)。
注意: 両側の胸部内血管を保存するように注意してください。そうしないと、大量の出血を引き起こす可能性があります。 - 歯のないピンセットを使用して左心室を持ち上げます。22Gの針を左心室の縦軸に沿って左心室の頂点に挿入します(補足図2C)。その間、灌流チューブ内のリズミカルな血液脈動を観察したり、針が右心室に穿刺したりして、灌流効果が低下する可能性があります。
注意: 歯付きピンセットは使用しないでください。そうしないと、ピンセット保持部位から余分な血液漏れを引き起こす可能性があります。 - 細いハサミで右心房を切断し(補足図2C)、100mLの氷冷灌流液を1分以内に約2mL/sの速度で手動で注入します。
注:ラットの肝臓と足が青白くなり、右心房から血液が流れ出ない場合、良好な灌流を達成できます。
- 脊髄解剖(図1)
- ラットを腹臥位に置き、上前腸骨棘(L4椎レベル程度)と胸柱の湾曲シフトポイント(約T6椎レベル)でそれぞれ脊椎を切断します(図1A)。次に、分離された脊椎をすぐに酸素化された氷冷灌流溶液に入れて、残留血液と脂肪組織を洗い流します。この手順は、後続の手順で手術野を清潔に保つのに役立ちます。
注:傍脊髄筋は、昆虫ピンを使用して脊椎を固定するための予備となる必要があります。 - 隔離された脊椎をすぐに解剖学的トレイ(図1B)に移し、背側を上にして、吻側の端をオペレーターに近づけます。解剖学的トレイに50 mLの連続酸素化氷冷切断液を充填します(図1B)。
- 4本の昆虫ピンを使用して、傍脊髄筋を貫通して脊椎を固定します(図1B)。
- 解剖顕微鏡下で、両側の椎弓根を吻側端からマイクロハサミで切断し、「椎弓切除術」と呼ぶことができます(図1C)。脊髄を傷つけないように注意してください。その間、マイクロ歯ピンセットを使用して、切断した椎体を持ち上げます。
- 椎弓切除術後、すぐに脊髄を脊柱管から分離しないでください。代わりに、マイクロハサミを使用して、細胞と酸素化されたACSFの間の栄養取り込みを助長する背側正中線に沿って硬膜を切断します(図1D)。
注意: 硬膜は絶対に引き裂かないでください。硬膜をマイクロハサミで切断することのみが許可されています。そうしないと、神経根と脊椎実質が深刻な損傷を受けます! - 脊髄の吻側部分を持ち上げ、神経根を約1mm確保して慎重に切断します(図1E)。脊髄を脊柱管から分離した後、2本の昆虫ピンを使用して腹側を上にして脊髄を固定します(図1F)。
- マイクロハサミを使用して、腹側正中線に沿って硬膜を切断します(図1F)。余分な神経根を約1mmの予備で切り取ります。
注:神経は脊髄よりもはるかに粘り強いです。予備神経根が長すぎる(>1mm)と、ビブラトームが神経根を切断できず、脊椎実質に深刻な裂傷が生じる可能性があります。 - マイクロハサミを使用して、腰椎の拡大を6〜7 mmの長さに分離します(図1G)。
- ラットを腹臥位に置き、上前腸骨棘(L4椎レベル程度)と胸柱の湾曲シフトポイント(約T6椎レベル)でそれぞれ脊椎を切断します(図1A)。次に、分離された脊椎をすぐに酸素化された氷冷灌流溶液に入れて、残留血液と脂肪組織を洗い流します。この手順は、後続の手順で手術野を清潔に保つのに役立ちます。
- 低融点アガロースへの包埋
- 腰椎拡大を35°の斜面(図1H)に置き、背側を上にして尾端を下にします。吸収性の濾紙を使用して、組織表面に付着した豊富な水分を取り除きます(図1H)。
- 溶融したアガロースゲルを、腰椎肥大の入ったシャーレにゆっくりと注ぎます(図1I)。
注意: 注ぎすぎると、ゲルに気泡が溜まります。 - 上記のシャーレを氷水混合物に入れて、できるだけ早くゲルを冷却すると、細胞の活性を維持するのに役立ちます。
- ゲルを15 mm x 10 mm x 10 mmの立方体にトリミングし、瞬間接着剤で試料ディスクに取り付けます(図1J)。
- スライス
- 試料ディスクを凍結済みのカッティングトレイに置き、氷冷したカッティング溶液を注ぎます(図1K)。95%CO2と5%O2でカッティングトレイに連続的に泡立てます。
- ビブラトームパラメータを設定します:厚さ:350μm;速度:0.14-0.16 mm / s、振幅:1.0 mm、振動周波数:85 Hz。
- 動物ごとに2〜3枚の適切なスライスを収穫します。スライスごとに1〜2個の健康なFG +運動ニューロンを記録し、動物あたり5〜6個の細胞の範囲で記録します。
- 潜伏
- カバースライドピンセットを使用してスライスをクリップし(図1L)、連続的に酸素化されたACSFで満たされたインキュベーションチャンバーに入れます。インキュベーションチャンバーを32°Cのウォーターバスに30分間入れ、室温(RT)でさらに30分間インキュベートしてから記録します。
注:麻酔から最初のスライスの取得までの上記の手順は、細胞の生存率を可能な限り維持するために、20〜30分以内に完了する必要があります。各スライスの運動ニューロンは、約6〜7時間生存率を維持できます。
- カバースライドピンセットを使用してスライスをクリップし(図1L)、連続的に酸素化されたACSFで満たされたインキュベーションチャンバーに入れます。インキュベーションチャンバーを32°Cのウォーターバスに30分間入れ、室温(RT)でさらに30分間インキュベートしてから記録します。
2. SCSによるパッチクランプ記録(図2)
- 準備
- 記録チャンバーに連続的にバブリングしたACSFを約1〜2 mL / minの速度で灌流します。ペリスタルティックポンプのコントロールパネルから流量を個別に調整します。
- スライスを記録チャンバーに入れます。ナイロン糸の入ったU字型のプラチナワイヤーを使用して、スライスを所定の位置にしっかりと固定します。
- 赤外微分干渉コントラスト顕微鏡(IR-DIC)を使用してスライスを観察します。4倍の対物レンズの下で、背根の長さが約1mmであることを確認します。背根が実質に入る領域を見つけて、中心視野をこの領域に移動します。
- パルス発生器をカスタムメイドの電極に接続します(図2A)。
- SCS の構成
- マイクロマニピュレーションシステムを介して背側正中線の近くにSCSのアノードを配置します(図2B)。
- マイクロマニピュレーションシステムを介して、SCSの陰極を背根エントリゾーン(DREZ)の近くに配置します(図2B)。
- 細胞のターゲティングとイメージング
- 10倍の対物レンズを備えたIR-DICを使用して、ほとんどの運動ニューロンが位置する運動柱の背外側領域を大まかに見つけます。次に、中心視野をこの領域に移動します。
- 60倍の対物レンズに切り替えて、滑らかで明るい表面と目に見えない核を持つ健康なニューロンを見つけます(図2C、F)。
- IR強度を少し下げて、蛍光光源をオンにします。光フィルターを広帯域紫外励起フィルター(図2D、G)に切り替えて、適切なFG陽性(FG+)運動ニューロンを選択します(図2E、H)。
- 吸引電極を使用して、背根に1倍の運動閾値刺激を加えます。運動ニューロンに誘発活動電位が検出された場合(補足図3)、後根の活動が損なわれていないことが確認されます。そうでない場合は、このスライスを破棄する必要があります。
- パッチクランプ録音
- マイクロピペットに細胞内溶液を充填し、電極ホルダーに挿入します。マイクロマニピュレーションシステムを使用して、ピペットをACSF槽に下げます。ピペット抵抗は5〜8MΩの範囲です。
- ピペットに少量の陽圧を加えて、ほこりや細胞の破片を吹き飛ばします。
- 電極を下げてセルに近づきます。ピペットがFG+ニューロンの表面に触れると、先端のレベルで膜の小さなくぼみが見えるようになります。陽圧を解放します。
- 次に、シリンジを使用してピペットに少量の陰圧を加えます。これにより、少量の吸引力が発生し、細胞膜がガラスピペットに接触します。抵抗値がギガオーム(>1 GΩ)に増加するまで、ソフトウェアインターフェイスの総抵抗に常に注意してください。そして、ギガシールが形成される。
- 膜電位を-70mVにクランプし、アンプのソフトウェアインターフェースにある高速静電容量補償ボタンを押します。過渡的に陰圧を静かに加えて細胞膜を破裂させ、アンプのソフトウェアインターフェースにある 低速静電容量補正 ボタンを押します。この時点で、良好なセル全体の構成が得られます。
- ソフトウェアインターフェースのICボタンをクリックして電流クランプモードに切り替え、静止膜電位(RMP)を記録します。
- SCSを1〜2秒間、振幅1〜10mAで印加し、パルス幅と周波数はそれぞれ210μsと40Hzに固定します。最初のAPが観察されるまで刺激振幅をゆっくりと増加させることにより、モーターの閾値を決定します。
- 電流クランプモード10、11、12でレオベースの周りに5秒の脱分極電流注入を使用して、遅延発火と即時発火の運動ニューロンを区別します。即時発火運動ニューロン:低レオベースは、安定した発火頻度で即時かつ反復的な発火を誘発する可能性があります。発火の遅れた運動ニューロン:レオベースが高いと、発火速度が加速する反復発火の遅延発症を誘発する可能性があります(図3)。
- SCS をオフにした場合、自発的な AP の発火を捕捉するための膜電位を記録し続けます。
- SCSがオン/オフのときに、興奮性シナプス後電流(EPSC)の電圧クランプ記録を実行します。刺激パラメータは、1xモーター閾値、210μs、2Hzです。
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Representative Results
微細な操作中の厳格な低温維持(補足図1、補足図2、および図1)のおかげで、細胞生存率はその後の電気生理学的記録を実行するのに十分良好でした。臨床シナリオを可能な限りシミュレートするために、マイクロマニピュレーションを使用して、SCS陰極と陽極をそれぞれ背側正中線とDREZの近くに配置し(図2)、後角の神経信号を開始して、運動柱の背外側領域の運動ニューロンに伝播できるようにしました。本研究では、FGを用いて直径20-50μmの運動ニューロンの位置を特定しました。図2D,Gに示すように、脊髄回路の末端である運動ニューロンとして健康なFG+ニューロンを自信を持って確認しました。この標識法は、SCSが焼成パターンにどのように影響するかを研究する道を開きました。遅延発火および即時発火運動ニューロンの電気生理学的特性を補足表1および補足表2に列挙する。アクティブプロパティとパッシブプロパティの計算方法は、補足ファイル1に記載されています。
SCSがパルス状の交流電界を脊椎スライスに供給したとき、まず電流クランプモードを使用して膜電位の応答を記録しました(図4)。1/3の運動閾値(図4B、C)のステップで刺激振幅を徐々に増加させると、膜電位も上昇しましたが、Apsを誘発できるのは1倍の運動閾値のみでした(図4D)。図4Dは、約10〜20パルスごとにAPを誘発できることを示しており、これはSCS振幅に対する明確なAP応答の規則性が存在する可能性があることを示しています。
SCSをオフにした後も、膜電位の記録を続けました。 図5 は、膜電位が-60mVまでわずかに増加し、ニューロンが一連の自発的APを発火させたことを示しました。これらの自発的なAPは短時間(30〜40秒)持続し、その後膜電位は-65 mVに戻り、SCSが細胞の興奮性を一時的に増加させる可能性があることを示しています。
次に、SCSのオン/オフ時のEPSCの電圧クランプ記録を使用しました(図6)。各SCSパルスの後、誘発されたEPSCが検出されました。刺激アーチファクトとEPSCの間の潜伏時間は2.64±0.38msでした(補足図4)。誘発されたEPSCの振幅は35.14±12.73pAでした(補足図4)。誘発されたEPSCの頻度は、SCSの頻度と一致しています。受動的な電荷平衡を差し引くと、誘発されたEPSCは、1倍の運動閾値刺激後の生存可能な運動ニューロンで観察できます(補足図5A)。刺激の極性は、同じ細胞内で2時間灌流を停止した後に逆転した。刺激はEPSCを誘導せず、誘発されたEPSCがアーチファクトではないことを確認した(補足図5B)。
図1:脊髄の解剖とスライス 。 (A)脊椎を上前腸骨棘(約L4椎体レベル)と胸柱の湾曲シフトポイント(約T6椎レベル)でそれぞれ切断します。(B)孤立した脊椎をすぐに解剖学的トレイに移し、背側を上にして、吻側の端をオペレーターに近づけます。解剖学的トレイに連続的に酸素化された氷冷切断液を入れます。(C)吻側端から両側に椎弓切除術を行います。(D)細胞と酸素化人工脳脊髄液(ACSF)との間の栄養の取り込みを助長する背側硬膜を切断します。(E)神経根を慎重に切断します。(F)腹側硬膜を切断する。(G)腰椎拡大部を6〜7mmの長さに分離します。 (H)背側を上にして、尾端を下にして35°斜面に腰椎肥大を置きます。吸収性の濾紙を使用して、組織表面の豊富な水分を取り除きます。(I)溶融アガロースゲルをペトリ皿にゆっくりと流し込む。(J)ゲルを立方体にトリミングし、瞬間接着剤で試料ディスクに取り付けます。(カ)試料ディスクをカッティングトレイに置き、氷冷したカッティングソリューションを注ぎます。(L)腰椎肥大時の脊椎スライスの一例。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:脊髄刺激(SCS)の構成と運動ニューロンのイメージング 。 (A)特注電極付きパルス発生器は、振幅、パルス幅、周波数を個別に調整できます。インレットは、電極接点の寸法仕様が800μm x 500μm x 300μmであることを示しました。 (B)マイクロマニピュレーションシステムを介して、背側正中線と背側根入口ゾーン(DREZ)の近くにそれぞれ陽極と陰極を配置します。記録ピペットをモーターコラムの背外側領域に置き、フルオロゴールド陽性(FG+)運動ニューロンをクランプします。(C)赤外微分干渉コントラスト顕微鏡(IR-DIC)イメージング(60倍)による健康な即時発火運動ニューロン。(D)同じニューロンを蛍光イメージング(60倍)のみで、光沢のあるフルオロゴールド(FG)粒子は、このニューロンが運動ニューロンであることを表しています。(ウ)IR-DICとFG+運動ニューロンの蛍光の合成画像。(F-H)IR-DICイメージングによる健康な遅延発火運動ニューロン(60倍)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:5秒の脱分極電流注入を使用して、遅延発火と即時発火の運動ニューロンを区別 します。 (A)即時発火運動ニューロン:低レオ塩基は、安定した発火頻度で即時発火と反復発火を誘発する可能性があります。(B)発火の遅れた運動ニューロン:レオベースが高いと、発火速度が加速する反復発火の遅延発症を誘発する可能性があります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:脊髄刺激(SCS)は、運動ニューロンの活動電位(AP)を誘発 しました。 (A)刺激を与えない場合、安静時膜電位(RMP)は-65mVであった。(B)1/3xのモーター閾値刺激ではAPを誘発できません。(C)2/3xのモーター閾値刺激ではAPを誘発できません。(D)1xモータ閾値刺激はAPを誘発することができ、10〜20パルスごとにAPを誘発することができる。 この 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5:脊髄刺激(SCS)後の自発的活動電位(AP)。 SCSをオフにした後、ニューロンは一連の自発的APを短時間(30〜40秒)発火させ、その後、静止膜電位(RMP)は-65mVに戻りました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:脊髄刺激(SCS)パラメータと誘発性興奮性シナプス後電流(EPSC)の図。 (A)SCSパラメータの図。(B、C)単一の刺激パルス(1xモーター閾値刺激)に続いて、誘発されたEPSCを観察できます。(D)パッシブ電荷バランスを差し引いた後、EPSCの遅延と振幅を計算できます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図1:機器の準備。 (A)灌流トレイ:灌流の10分前に、シリカゲルで満たされた10cmのシャーレに砕いた氷を置きます。(B)解剖学的トレイ:生贄の前夜に、シリカゲルで満たされた自作の解剖学的トレイを-80°Cの冷蔵庫に入れます。(C)カッティングトレイ:生贄を捧げる前夜に、ウォーターバンド付きのカッティングトレイを-80°Cの冷蔵庫に入れます。(D)アガロースキャスティングスロープ:灌流の30分前に、35mmのシャーレの中央にベースプレートを備えた35°のアガローススロープを配置します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 2:心内灌流。 (A)剣状突起を持ち上げます。(B)剣状突起の両側に沿って胸骨を切断し、胸部を開き、心臓を露出させます。胸部内部血管を傷つけないように注意すると、大量の出血が手術野全体を満たし、オペレーターが心室の頂点または右心房を特定できなくなります。(C)灌流のために左心室の頂点に22Gの針を挿入し、液体の出口のために右心房を切断します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:背根の活動の確認。 吸引電極を使用して、背根に1倍の運動閾値刺激を加えます。運動ニューロンに誘発活動電位が検出されれば、後根の活動が損なわれていないことが確認できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:SCSオン時の誘発EPSCの潜伏時間と振幅。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:誘発EPSCの妥当性の実証。 (A)受動的電荷平衡を差し引いた後、1倍の運動閾値刺激に続いて、誘発されたEPSCが生存可能な運動ニューロンで観察され得る。(B)同じ細胞内で2時間灌流を停止した後、刺激の極性が逆転し、1回の運動閾値刺激はEPSCを誘発せず、誘発されたEPSCがアーチファクトではないことを確認しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:能動特性と受動特性の計算方法。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:運動ニューロンの受動的特性。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:運動ニューロンの活性特性 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
SCSによって変調された運動情報は、最終的に運動ニューロンに収束されます。したがって、運動ニューロンを研究対象とすることで、研究デザインが簡素化され、SCSの神経調節メカニズムがより直接的に明らかになる可能性があります。多様な刺激特性と細胞応答を同時に記録するには、パッチクランプが単一細胞スケールで電気生理学的特性を研究するのに適した方法です。しかし、細胞の生存率を維持する方法、脊髄を骨構造から迅速に分離する方法、SCSを使用してAPをうまく誘導する方法など、いくつかの困難がまだあります。したがって、この研究は、研究者が重要な操作スキルをすばやく把握し、起こりうる落とし穴を回避し、方法論ではなく研究デザインにできるだけ早く集中できるようにすることを目的としています。
良好な細胞生存率を得るためには、常に次の詳細に注意を払う必要があります:(1)低温は細胞死を阻害し、代謝速度を遅くする可能性があるため、脊髄を氷のように冷たい温度に保つことは非常に重要です。(2)硬膜をマイクロハサミで繊細に除去することで、周囲の溶液からの神経栄養素の取り込みを高めることができます。硬膜を直接剥がさないでください。そうしないと、脊髄が深刻な損傷を受けます。また、硬膜の除去を忘れてしまうと、刃が硬膜を完全に切断できず、残った脊髄をアガロースから引き抜くことがあり、その後のスライス工程が困難になり、スライスの失敗につながる可能性があります。(3)従来の横スライスと比較して、斜めスライスは灰白質の面積を増やし、単一のスライスでより多くのFG +運動ニューロンを見つけることができます9。(4)脊髄だけでは脳のように検体椎間板にしっかりと固定できないため、アガロースゲルに埋め込むことで、細胞の生存率を低下させることなくこの問題を解決することができます。高温は細胞の生存率を損なう可能性があるため、従来のアガロース(ゲル化ポイント38-43°C)ではなく、低融点アガロース(ゲルポイント26-30°C)の使用を推奨します。(5)U字型白金線のナイロン糸2本間の距離は、糸が緩んでいると脊髄をしっかりと固定できず、密な糸が細胞を押しつぶす可能性があるため、1〜1.5mmにすることをお勧めします。
本研究のSCS電極は、基礎研究で広く用いられているバイポーラフック電極などの従来の刺激装置と比較して、これまでの臨床研究14 と基礎研究15から得られたものである。SCSは、パルス交互電気刺激を提供し、多様なパラメータ調整寸法を提供します。このSCSデバイスは、組織の電気分解を回避するための電荷バランス機能も備えており、神経組織に直接接触しません。したがって、このSCSは in vivo アプリケーションに対して優れた安全性を備えています。
SCS治療後、運動ニューロンの自発的APは、以下の理由に起因している可能性があります:(1)SCSは、ニューロンの細胞体および軸索結腸に電荷を蓄積するように誘導し、RMP16の増加につながります。この現象は、SCSがニューロンの興奮性を改善する可能性を示しており、これは、Na v 1.1 17、Kv 2.118、またはCav 2.3 19などのSCS後のイオンチャネルの導電率の変化に関連している可能性があります。(2)SCSは、運動ニューロンへの固有受容フィードバックを促進するために、背側のGABA作動性ニューロンを活性化する可能性があります。我々は、感覚ニューロンと運動ニューロンの間に神経伝達が連続的に存在し、SCS後の運動ニューロンに自発的なAPをもたらす可能性を示唆しています。自発的APは、感覚運動行動を実行する準備の本質的な状態を維持することができる20。したがって、自発的なAPを活性化または阻害することは、脊髄神経疾患の治療に有益である可能性があります。
周知のように、 in vivo 電気生理学的記録は、電界の自然な分布と電極の配置下での電気生理学的応答を検出するのに適しています。さらに、 in vivo 運動ニューロン記録により、運動ニューロンの同一性の識別が可能になります。これは、筋線維力測定と組み合わせた運動軸索の抗ドローム識別によって行うことができる21。しかし、 in vivo 脊髄記録には、(1)運動ニューロンが脊髄の背側表面から2〜3mm離れており、最先端の2光子共焦点イメージングを使用しても、観察深度が500〜800μmしかないため、既存の方法では生体 内で 光学的に観察することが困難であるという欠点もあります。したがって、 生体内で単一の運動ニューロンを正確にクランプしたい場合、ガラスピペットは背柱を通過して目に見えない運動ニューロンに到達する必要があります。 in vivo パッチクランプは「ブラインド」方式でしか実施できないため、大きな不確実性と故障率が生じます。(2) in vivo パッチクランプを除いて、シリコン電極記録は、ユタアレイまたはニューロピクセル電極などの代替方法であり得る。ただし、シリコン電極によって記録される信号は、ほとんどが単一活動電位ではなく複合活動電位です。単一ニューロンの活動はスパイクソーティングアルゴリズムを使用して解決されていますが、ソーティングアルゴリズムの精度と信頼性はまだ改善する必要があります。
in vivo記録と比較して、in vivoに対するin vitroの最大の利点は、SCSによって活性化されるシナプス経路を独自に理解できる電圧クランプの使用です。さらに、ライブイメージングツールの使用も許可されます。SCSは、GABAやグルタミン酸などの神経伝達物質を上位のニューロンから運動ニューロンに放出し、全体的な興奮性EPSC応答をもたらすと推測しています7。そこで、今後の研究では、SCSによって誘導されるIPSC、mini EPSC(mEPSC)、誘発性EPSCの検出を取り入れ、運動前ニューロンや介在ニューロンからの抑制性および興奮性神経伝達物質の放出パターンを明らかにします。また、in vitro刺激にはいくつかの限界があることを十分に認識しています:(1)脊髄の長距離縦方向回路が破壊され、運動皮質または下肢からの着信情報が失われます。(2)in vitro刺激時の電界の分布は、in vivo刺激時の電界の分布と異なる場合があります。この研究では、APの活性化閾値(約ミリアンペア)は、in vivo実験の閾値(約マイクロアンペア)よりもはるかに高かった15。これは、記録室内のACSF溶液の体積容量が自然状態の脳脊髄液よりもはるかに大きく、高導電性材料では電界がより速く減衰することが数理理論で裏付けられているためである22。そのため、電流のほとんどが浴液に吸収され、電界はごく一部しか神経根に拡散できないと推測されます。
したがって、in vivo刺激とin vitro刺激の長所と短所を考慮すると、in vitroパッチクランプは、新生児げっ歯類におけるSCSのシナプス特性および/または細胞効果を研究するための有利な方法であると結論付けることができます。
臨床診療では、電極は脊髄または神経根23の表面を直接収縮させない。その代わりに、電極によって生成された電界放射に依存して、間接的に神経1の活動に影響を与える。複数の研究1,23,24により、SCSの陰極接触は、特定の筋肉を刺激するための最適な選択性を達成するために、後根または進入ゾーン(DREZ)にできるだけ近づけて配置する必要があることが確認されています。電極と神経根の間の距離を長くすると、刺激の特異性が弱まります。そのため、神経根や脊髄に直接接触するのではなく、DREZの近くにカソードを直接配置します。
背根の求心性線維は、最初に感覚ニューロンに投射し、次に介在ニューロンと運動ニューロンに投射します。横方向の投影回路の他に、吻側と尾側の端に向かって突出する回路もあります。例えば、前脛骨筋に対応する運動ニューロンは、複数のレベルで見出すことができる25。したがって、斜めのプレパレーションは横方向の投影回路を切断する可能性がありますが、それでも非横方向の投影線維は保存され、運動前の感覚回路の研究が可能になります。斜めおよび横方向の準備に加えて、縦方向の準備は、背根から運動ニューロンまでの回路をよりよく保存し、複数のセグメントにわたる脊髄回路の効果的な保持を可能にする明確な利点を提供します26。
シミュレーション研究6,27,28によると、SCSは主に固有受容性求心性線維を活性化して、Ia、Ib、およびII求心性線維を含む下肢の動きを回復させます。しかし、本研究では、SCSによって特異的に活性化された繊維の種類を確実に確認することはできません。同様のパターンがin vitroパッチクランプにも存在する可能性があると推測されます。この課題に対しては、数理モデリングとシミュレーションを行い、現在進行中の作業に組み込んでいきます。
結論として、このプロトコルは、研究者が操作スキルを向上させ、パッチクランプ記録とSCSを組み合わせてSCSの電気的メカニズムを単一細胞スケールで調査することの本質を把握するのに役立つ可能性があります。
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Disclosures
何一つ
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会の若手研究者(52207254および82301657)および中国ポスドク科学基金(2022M711833)から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
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