Summary
Dit protocol beschrijft een methode met behulp van een patch-clamp om de elektrische reacties van motorneuronen op ruggenmergstimulatie (SCS) met een hoge spatiotemporele resolutie te bestuderen, wat onderzoekers kan helpen hun vaardigheden te verbeteren bij het scheiden van het ruggenmerg en het tegelijkertijd handhaven van de levensvatbaarheid van de cel.
Abstract
Ruggenmergstimulatie (SCS) kan de bewegingsfunctie effectief herstellen na een dwarslaesie (SCI). Omdat de motorneuronen de laatste eenheid zijn om sensomotorisch gedrag uit te voeren, kan het direct bestuderen van de elektrische reacties van motorneuronen met SCS ons helpen de onderliggende logica van spinale motorische modulatie te begrijpen. Om tegelijkertijd verschillende stimuluskenmerken en cellulaire reacties vast te leggen, is een patch-clamp een goede methode om de elektrofysiologische kenmerken op eencellige schaal te bestuderen. Er zijn echter nog steeds enkele complexe moeilijkheden om dit doel te bereiken, waaronder het handhaven van de levensvatbaarheid van de cel, het snel scheiden van het ruggenmerg van de benige structuur en het gebruik van de SCS om met succes actiepotentialen te induceren. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol met behulp van patch-clamp om de elektrische reacties van motorneuronen op SCS met een hoge spatiotemporele resolutie te bestuderen, wat onderzoekers kan helpen hun vaardigheden te verbeteren bij het scheiden van het ruggenmerg en tegelijkertijd de levensvatbaarheid van de cel te behouden om het elektrische mechanisme van SCS op motorneuron soepel te bestuderen en onnodig vallen en opstaan te voorkomen.
Introduction
Ruggenmergstimulatie (SCS) kan de bewegingsfunctie effectief herstellen na een dwarslaesie (SCI). Andreas Rowald et al. meldden dat SCS de bewegings- en rompfunctie van de onderste ledematen binnen één dag mogelijkmaakt1. Het onderzoeken van het biologische mechanisme van SCS voor locomotorisch herstel is een cruciaal en trending onderzoeksgebied voor het ontwikkelen van een preciezere SCS-strategie. Het team van Grégoire Courtine toonde bijvoorbeeld aan dat excitatoire Vsx2-interneuron en Hoxa10-neuronen in het ruggenmerg de belangrijkste neuronen zijn voor de respons op SCS, en dat celspecifieke neuromodulatie haalbaar is om het loopvermogen van ratten na SCI2 te herstellen. Er zijn echter maar weinig studies die zich richten op het elektrische mechanisme van SCS op eencellige schaal. Hoewel het algemeen bekend is dat de bovendrempelige gelijkstroomstimulus de actiepotentialen (AP's) in het klassieke inktvisexperiment 3,4,5 kan opwekken, is het nog onduidelijk hoe de gepulseerde wisselende elektrische stimulatie, zoals SCS, de motorsignaalgeneratie beïnvloedt.
Gezien de complexiteit van intraspinale neurale circuits, is een geschikte selectie voor celpopulatie belangrijk voor het onderzoeken van het elektrische mechanisme van SCS. Hoewel SCS de motorische functie herstelt door de proprioceptieve route6 te activeren, zijn de motorneuronen de laatste eenheid om het motorcommando uit te voeren, afgeleid van de integratie van proprioceptie-informatie afferente input7. Daarom kan het rechtstreeks bestuderen van de elektrische kenmerken van motorneuronen met SCS ons helpen de onderliggende logica van spinale motormodulatie te begrijpen.
Zoals we weten, is patch-clamp de gouden standaardmethode voor cellulaire elektrofysiologische registratie met extreem hoge spatiotemporele resolutie8. Daarom beschrijft deze studie een methode met behulp van een patchklem om de elektrische reacties van motorneuronen op SCS te bestuderen. Vergeleken met de hersenpleisterklem9 is de ruggenmergklem moeilijker om de volgende redenen: (1) Het ruggenmerg wordt beschermd door het wervelkanaal met een klein volume, wat zeer fijne micromanipulatie en rigoureus ijskoud onderhoud vereist om een betere cellevensvatbaarheid te verkrijgen. (2) Omdat het ruggenmerg te slank is om op de snijplaat te worden vastgezet, moet het worden ondergedompeld in agarose met een laag smeltpunt en na stolling worden bijgesneden.
Daarom biedt deze methode technische details bij het ontleden van het ruggenmerg en het tegelijkertijd handhaven van de levensvatbaarheid van de cel, om het elektrische mechanisme van SCS op motorneuronen soepel te bestuderen en onnodige vallen en opstaan te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Institutional Animal Care and Use Committee keurde alle dierproeven goed en de onderzoeken werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante dierenwelzijnsvoorschriften.
1. Bereiding van dieren
- Dieren
- Huisvestingsinformatie: Huisvest mannelijke Sprague-Dawley-ratten (postnataal 10-14 dagen, P10-P14) in een specifieke pathogeenvrije omgeving.
OPMERKING: De kamercondities werden gehandhaafd op 20 °C ± 2 °C, vochtigheid: 50%-60%, met een licht/donkercyclus van 12 uur. Dieren hadden vrije toegang tot voedsel en water. - Label de motorneuronen retrograde: Injecteer Fluoro-Gold (FG) in de bilaterale tibialis anterior en gastrocnemius-spier (2% in steriele zoutoplossing, 50 μL per spier) om de motorneuronen 2 dagen voor het offer retrograde te labelen.
- Huisvestingsinformatie: Huisvest mannelijke Sprague-Dawley-ratten (postnataal 10-14 dagen, P10-P14) in een specifieke pathogeenvrije omgeving.
- Oplossingen
- Snijoplossing bereiden: Meng 120 mM Cholinechloride, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1,25 mM NaH 2 PO4, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl2, 1,3 mM Ascorbinezuur, 15 mM glucose. Laat de oplossing voor bubbelen met 95%O2 en 5% CO2 (stel in op pH 7,4 met KOH) gedurende 30 minuten voor de dissectie en het snijden. Koel de oplossing af met gemalen ijs.
- Bereid kunstmatig hersenvocht (ACSF): Meng 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4; 1,3 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 en 10 mM glucose. Laat de oplossing vóór de incubatie 30 minuten voor de incubatie opborrelen met 95%O2 en 5% CO 2 (CO2).
- Bereid een intracellulaire oplossing voor: Meng 126 mM K-gluconaat, 2 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na2GTP, 10 mM K-fosfocreatine en 0,5% neurobiotine (pH 7,25 en 305 mOsm/kg). Koel de oplossing af met gemalen ijs.
- Bereid agarosegel met een laag smeltend gehalte: Los 4 g agarose op in 100 ml snijoplossing en gebruik een magnetische roerrotor om het volledig op te lossen. Verwarm de agarose met laag smeltpunt 30 minuten voor het inbedden gedurende 1 minuut in de magnetron met hoog vermogen en breng deze vervolgens over in een waterbad van 39 °C om de vloeibare toestand te behouden.
- Voorbereiding van het instrument
- Plaats gemalen ijs op de perfusielade (aanvullende figuur 1A) 10 minuten voor de perfusie. Plaats de anatomische lade (aanvullende afbeelding 1B) en de snijplaat (aanvullende afbeelding 1C) met een waterband op -80 °C een nacht van tevoren.
- Plaats de incubatiekamer met nylon gaas een nacht van tevoren in de oven op 45 °C.
- Gebruik agarose met een laag smeltpunt om een helling van 35° en een platform van 2 mm dik te prefabriceren (aanvullende afbeelding 1D). Plaats ze na het stollen van de gel in het midden van een petrischaal van 35 mm om het ruggenmerg te ondersteunen bij de volgende procedures.
- Intracardiale perfusie
- Verdoof de ratten met 2,5% tribroomethanol (160 μl/10 g) via intraperitoneale injectie. Zorg ervoor dat de ratten volledig verdoofd zijn door het gebrek aan reactie op externe stimuli, zoals een zacht knijpen in de teen, te verifiëren.
- Wanneer de juiste verdoving is bevestigd, plaatst u de ratten op hun rug en immobiliseert u ze in de petrischaal gevuld met silicagel.
- Snijd een incisie van 5 mm in de lengterichting van de huid caudaal af naar de processus xiphoid en breid vervolgens de onderhuidse ruimte volledig uit. Snijd een incisie van 2 cm in de lengterichting van de huid langs de ventrale middellijn om de buitenste borstwand volledig bloot te leggen, beginnend met de bovengenoemde incisie en eindigend met de bovenkant van de borstkas.
- Gebruik een getande pincet om de xiphoid op te tillen (aanvullende figuur 2A) en gebruik vervolgens een fijne schaar om het diafragma door te knippen. Snijd het borstbeen langs beide zijden van de processus xiphoid door om de borstkas te openen en het hart bloot te leggen (aanvullende figuur 2B).
NOTITIE: Zorg ervoor dat u de interne thoracale vaten aan beide zijden behoudt; anders kan het enorme bloedingen veroorzaken. - Gebruik een tandeloos pincet om de linker hartkamer op te tillen. Steek een naald van 22 G in de linkerventrikeltop langs de lengteas van de linkerventrikel (aanvullende figuur 2C). Let ondertussen op de ritmische bloedpulsatie in de perfusiebuis, anders kan de naald in de rechterhartkamer prikken, wat kan leiden tot een slecht perfusie-effect.
NOTITIE: Een pincet met tand mag niet worden gebruikt; anders kan het extra bloedlekkage uit de pincethoudplaats veroorzaken. - Gebruik een fijne schaar om het rechter atrium af te knippen (aanvullende figuur 2C) en injecteer vervolgens handmatig 100 ml ijskoude perfuseervloeistof met een snelheid van ongeveer 2 ml/s binnen 1 minuut.
OPMERKING: Wanneer de lever en poten van ratten bleek worden en er geen bloed uit het rechter atrium stroomt, kan een goede perfusie worden bereikt.
- Dissectie van het ruggenmerg (figuur 1)
- Plaats de rat in buikligging en snijd de wervelkolom door bij respectievelijk de voorste superieure iliacale wervelkolom (ongeveer L4 wervelniveau) en het krommingsverschuivende punt van de thoracale kolom (ongeveer T6 wervelniveau) (Figuur 1A). Plaats vervolgens onmiddellijk de geïsoleerde wervelkolom in de zuurstofrijke ijskoude perfuseeroplossing om het resterende bloed- en vetweefsel af te wassen; Deze procedure is gunstig voor het schoonhouden van het operatieveld in de volgende procedures.
OPMERKING: De paraspinale spieren moeten worden gereserveerd, wat bevorderlijk is voor de daaropvolgende fixatie van de wervelkolom met behulp van een insectenspeld. - Breng de geïsoleerde wervelkolom onmiddellijk over naar de anatomische lade (Figuur 1B) met de dorsale zijde naar boven en het rostrale uiteinde dicht bij de operator. Vul de anatomische bak met 50 ml continu zuurstofrijke ijskoude snijoplossing (Figuur 1B).
- Gebruik vier insectenpinnen om de wervelkolom vast te zetten door de paraspinale spieren te penetreren (Figuur 1B).
- Snijd onder de dissectiemicroscoop de wervelsteeltjes van beide zijden van het rostrale uiteinde met de microschaar, wat "laminectomie" kan worden genoemd (Figuur 1C). Let op dat u het ruggenmerg niet beschadigt. Gebruik ondertussen het micro-getande pincet om het doorgesneden wervellichaam op te tillen.
- Scheid na de laminectomie het ruggenmerg niet onmiddellijk van het wervelkanaal. Gebruik in plaats daarvan een microschaar om de dura mater langs de dorsale middellijn door te snijden, wat bevorderlijk is voor de opname van voedingsstoffen tussen cellen en zuurstofrijke ACSF (Figuur 1D).
NOTITIE: Scheur de dura mater nooit. Alleen het knippen van de dura mater met een microschaar is toegestaan; Anders worden de zenuwwortel en het spinale parenchym ernstig beschadigd! - Til het rostrale deel van het ruggenmerg op en snijd vervolgens voorzichtig de zenuwwortel door met ongeveer 1 mm gereserveerd (Figuur 1E). Nadat u het ruggenmerg van het wervelkanaal hebt gescheiden, gebruikt u 2 insectenpennen om het ruggenmerg met de buikzijde naar boven vast te zetten (Figuur 1F).
- Gebruik een microschaar om de dura mater langs de ventrale middellijn door te knippen (Figuur 1F). Snijd de overtollige zenuwwortels af met ongeveer 1 mm gereserveerd.
OPMERKING: De zenuw is veel hardnekkiger dan het ruggenmerg. Als de gereserveerde zenuwwortel te lang is (>1 mm), kan het vibratoom de zenuwwortel niet afsnijden, wat kan leiden tot een ernstige scheur in het spinale parenchym. - Gebruik een microschaar om de lumbale vergroting te scheiden tot een lengte van 6-7 mm (Figuur 1G).
- Plaats de rat in buikligging en snijd de wervelkolom door bij respectievelijk de voorste superieure iliacale wervelkolom (ongeveer L4 wervelniveau) en het krommingsverschuivende punt van de thoracale kolom (ongeveer T6 wervelniveau) (Figuur 1A). Plaats vervolgens onmiddellijk de geïsoleerde wervelkolom in de zuurstofrijke ijskoude perfuseeroplossing om het resterende bloed- en vetweefsel af te wassen; Deze procedure is gunstig voor het schoonhouden van het operatieveld in de volgende procedures.
- Inbedding in de laagsmeltende agarose
- Plaats de lumbale vergroting op de helling van 35 ° (Figuur 1H) met de dorsale zijde naar boven en het staartuiteinde naar beneden. Gebruik een absorberend filtreerpapier om overvloedig water op het weefseloppervlak te verwijderen (Figuur 1H).
- Giet langzaam de gesmolten agarosegel in de petrischaal met de lumbale vergroting (Figuur 1I).
OPMERKING: Giet niet te snel, anders hopen zich luchtbellen op in de gel. - Plaats de bovenstaande petrischaal in het ijs-watermengsel om de gel zo snel mogelijk af te koelen, wat bevorderlijk is voor het behoud van de activiteit van cellen.
- Snijd de gel in een kubus van 15 mm x 10 mm x 10 mm en monteer deze met secondelijm op de preparaatschijf (Figuur 1J).
- Snijden
- Plaats de preparaatschijf in de voorgevroren snijplaat en giet vervolgens de ijskoude snijoplossing (Figuur 1K). Continu bubbelen met 95% CO 2 en 5% O2 in de snijplaat.
- Stel de vibratoomparameters in: dikte: 350 μm; snelheid: 0,14-0,16 mm/s, amplitude: 1,0 mm en trillingsfrequentie: 85 Hz.
- Oogst 2-3 geschikte plakjes per dier. Registreer 1-2 gezonde FG+ motorneuronen per plak, met een bereik van 5-6 cellen per dier.
- Incubatie
- Gebruik een pincet om een plakje af te knippen (Figuur 1L) en plaats het in de incubatiekamer gevuld met continu zuurstofrijk ACSF. Plaats de incubatiekamer gedurende 30 minuten in een waterbad bij 32 °C en blijf deze vervolgens nog 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) incuberen voordat u gaat opnemen.
OPMERKING: De bovenstaande procedures, van anesthesie tot het verkrijgen van de eerste plak, moeten binnen 20-30 minuten worden voltooid om de levensvatbaarheid van cellen zoveel mogelijk te behouden. De motorneuronen in elke plak kunnen hun levensvatbaarheid ongeveer 6-7 uur behouden.
- Gebruik een pincet om een plakje af te knippen (Figuur 1L) en plaats het in de incubatiekamer gevuld met continu zuurstofrijk ACSF. Plaats de incubatiekamer gedurende 30 minuten in een waterbad bij 32 °C en blijf deze vervolgens nog 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) incuberen voordat u gaat opnemen.
2. Patch-clamp opname met SCS (Figuur 2)
- Voorbereidingen
- Doordrenk de opnamekamer met continu geborrelde ACSF met een snelheid van ongeveer 1-2 ml/min. Pas het debiet individueel aan via het bedieningspaneel op de slangenpomp.
- Plaats een plakje in de opnamekamer. Gebruik de U-vormige platinadraad met nylondraden om de plak stevig op zijn plaats te stabiliseren.
- Gebruik een infrarood differentiële interferentiecontrastmicroscoop (IR-DIC) om de plak te observeren. Controleer onder de 4x objectieflens dat de lengte van de dorsale wortel ongeveer 1 mm is. Zoek het gebied waar de dorsale wortel het parenchym binnenkomt en verplaats vervolgens het centrale gezichtsveld naar dit gebied.
- Sluit de pulsgenerator aan op maat gemaakte elektroden (Figuur 2A).
- SCS-configuratie
- Plaats de anode van SCS in de buurt van de dorsale middellijn via het micromanipulatiesysteem (Figuur 2B).
- Plaats de kathode van SCS in de buurt van de dorsale wortelingangszone (DREZ) via het micromanipulatiesysteem (Figuur 2B).
- Celtargeting en beeldvorming
- Gebruik IR-DIC met een 10x objectieflens om ruwweg het dorsolaterale gebied van de motorkolom te vinden, waar de meeste motorneuronen zich bevinden. Verplaats vervolgens het centrale gezichtsveld naar dit gebied.
- Schakel over naar een 60x objectieflens om een gezond neuron te vinden met een glad en helder oppervlak en onzichtbare kernen (Figuur 2C,F).
- Verlaag de IR-intensiteit iets en schakel de fluorescentielichtbron in. Schakel het lichtfilter over naar het breedband ultraviolette excitatiefilter (Figuur 2D,G) om een geschikt FG-positief (FG+) motorneuron te selecteren (Figuur 2E,H).
- Gebruik zuigelektroden om 1x motordrempelstimulatie toe te passen op de dorsale wortel. Als een evoked action potential wordt gedetecteerd in de motorneuronen (aanvullende figuur 3), bevestigt dit dat de activiteit van de dorsale wortel intact is. Als dit niet het geval is, moet dit plakje worden weggegooid.
- Patch-clamp opname
- Vul de micropipet met de intracellulaire oplossing en plaats deze in de elektrodehouder. Gebruik het micromanipulatiesysteem om de pipet in het ACSF-bad te laten zakken. De pipetweerstand varieert van 5-8 MΩ.
- Oefen een kleine hoeveelheid positieve druk uit op de pipet om het stof en celvuil weg te blazen.
- Laat de elektrode zakken om de cel te naderen. Wanneer de pipet het oppervlak van het FG+ neuron raakt, wordt een kleine inkeping van het membraan zichtbaar ter hoogte van de tip. Laat de overdruk los.
- Oefen vervolgens met een injectiespuit een kleine hoeveelheid onderdruk uit op de pipet. Hierdoor ontstaat een kleine hoeveelheid zuigkracht die het celmembraan in contact brengt met de glazen pipet. Let altijd op de totale weerstand op de software-interface totdat de weerstandswaarde toeneemt tot gigaohm (>1 GΩ). Vervolgens wordt de gigaseal gevormd.
- Klem de membraanpotentiaal op -70 mV en druk vervolgens op de knop voor snelle capaciteitscompensatie op de software-interface van de versterker. Oefen voorzichtig een tijdelijke negatieve druk uit om het celmembraan te scheuren en druk vervolgens op de langzame capaciteitscompensatieknop op de software-interface van de versterker. Op dit punt wordt een goede configuratie van de hele cel verkregen.
- Schakel over naar de stroomtangmodus door op de IC-knop op de software-interface te klikken en registreer het rustmembraanpotentiaal (RMP).
- Pas de SCS 1-2 s toe met een amplitude van 1-10 mA, terwijl de pulsbreedte en -frequentie zijn vastgesteld op respectievelijk 210 μs en 40 Hz. Bepaal de motorische drempel door de stimulatieamplitude langzaam te verhogen totdat de eerste AP wordt waargenomen.
- Onderscheid vertraagde en onmiddellijk vurende motorneuronen met behulp van een depolariserende stroominjectie van 5 s rond de rheobase in de stroomklemmodus10,11,12. Onmiddellijk vurende motorneuronen: Lage rheobase kan onmiddellijk en repetitief vuren induceren met een stabiele vuurfrequentie; Vertraagd vurende motorneuronen: Een hoge rheobase kan een vertraagd begin induceren voor herhaald vuren met een versnellende vuursnelheid (Figuur 3).
- Wanneer SCS is uitgeschakeld, gaat u door met het opnemen van het membraanpotentiaal voor het opvangen van de spontane AP's die worden afgevuurd.
- Voer voltage-clamp-opnames uit voltage-clamp-opnames voor excitatoire postsynaptische stroom (EPSC) wanneer SCS is in- en uitgeschakeld. De stimulatieparameter is 1x motordrempel, 210 μs, 2 Hz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dankzij het rigoureuze onderhoud bij lage temperaturen tijdens de fijne werking (aanvullende figuur 1, aanvullende figuur 2 en figuur 1) was de levensvatbaarheid van de cel goed genoeg om latere elektrofysiologische opnames uit te voeren. Om het klinische scenario zoveel mogelijk te simuleren, gebruikten we micromanipulatie om de SCS-kathode en anode respectievelijk in de buurt van de dorsale middellijn en DREZ te plaatsen (Figuur 2), wat een neuraal signaal in de dorsale hoorn kon initiëren om zich voort te planten naar de motorneuronen in het dorsolaterale gebied van de motorkolom. In deze studie gebruikten we FG om de motorneuronen met een diameter van 20-50 μm te lokaliseren. Zoals te zien is in figuur 2D,G, hebben we vol vertrouwen bevestigd dat een gezond FG+ neuron een motorneuron is - het uiteinde van het ruggenmergcircuit. Deze etiketteringsmethode maakte de weg vrij om te bestuderen hoe SCS het vuurpatroon beïnvloedt. De elektrofysiologische eigenschappen van vertraagde en onmiddellijk vurende motorneuronen worden vermeld in aanvullende tabel 1 en aanvullende tabel 2. De methoden voor de berekening van de actieve en passieve eigenschappen zijn opgenomen in aanvullend dossier 1.
Toen SCS een gepulseerd wisselend elektrisch veld aan de spinale plak leverde, gebruikten we eerst de stroom-clamp-modus om de respons van de membraanpotentiaal vast te leggen (Figuur 4). Naarmate we de stimulatieamplitude geleidelijk verhoogden met een stap van 1/3 motordrempel (Figuur 4B,C), steeg ook de membraanpotentiaal mee, maar slechts 1x de motordrempel kon Aps opwekken (Figuur 4D). Figuur 4D laat zien dat ongeveer elke 10-20 pulsen een AP kunnen uitlokken, wat aangeeft dat er een duidelijke regelmaat van de AP-respons op SCS-amplitude zou kunnen bestaan.
Nadat de SCS was uitgeschakeld, gingen we door met het registreren van membraanpotentiaal. Figuur 5 toonde aan dat de membraanpotentiaal licht toenam tot -60 mV, en het neuron vuurde een reeks spontane AP's af. Deze spontane AP's duren een korte periode (30-40 s), waarna de membraanpotentiaal terugkeert naar -65 mV, wat aangeeft dat de SCS de prikkelbaarheid van de cel tijdelijk kan verhogen.
Vervolgens gebruikten we spanningsklemopnames voor EPSC wanneer SCS aan en uit stond (Afbeelding 6). Na elke SCS-puls kon een opgewekte EPSC worden gedetecteerd. De latentie tussen het stimulusartefact en EPSC was 2,64 ± 0,38 ms (aanvullende figuur 4). De amplitude van de opgewekte EPSC's was 35,14 ± 12,73 pA (aanvullende figuur 4). De frequentie van opgewekte EPSC's komt overeen met de SCS-frequentie. Na aftrek van de passieve ladingsbalancering, kan de opgewekte EPSC worden waargenomen in een levensvatbaar motorneuron na 1x motorische drempelstimulatie (aanvullende figuur 5A). De stimulatiepolariteit werd omgekeerd na het stoppen van de perfusie gedurende 2 uur in dezelfde cel. De stimulatie induceerde geen EPSC, wat bevestigt dat de opgewekte EPSC geen artefact was (aanvullende figuur 5B).
Figuur 1: Dissectie en snijden van het ruggenmerg. (A) Snijd respectievelijk de wervelkolom door bij de voorste superieure iliacale wervelkolom (ongeveer L4 wervelniveau) en het krommingsverschuifpunt van de thoracale kolom (ongeveer T6 wervelniveau). (B) Breng de geïsoleerde wervelkolom onmiddellijk over naar de anatomische bak met de dorsale zijde naar boven en het rostrale uiteinde dicht bij de operator. Vul de anatomische bak met de continu zuurstofrijke ijskoude snijoplossing. (C) Voer laminectomie uit aan beide zijden vanaf het rostrale uiteinde. (D) Snijd de dorsale dura mater door, die bevorderlijk is voor de opname van voedingsstoffen tussen cellen en zuurstofrijke kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF). (E) Snijd voorzichtig de zenuwwortel door. (F) Snijd de ventrale dura mater door. (G) Scheid de lumbale vergroting tot een lengte van 6-7 mm. (H) Plaats de lumbale vergroting op de helling van 35 ° met de dorsale kant naar boven en het staartuiteinde naar beneden. Gebruik een absorberend filtreerpapier om overvloedig water op het weefseloppervlak te verwijderen. (I) Giet langzaam de gesmolten agarosegel in de petrischaal. (J) Snijd de gel in een kubus en monteer deze met secondelijm op de preparaatschijf. (K) Plaats de preparaatschijf in de snijplaat en giet vervolgens de ijskoude snijoplossing. (L) Een voorbeeld van een spinale plak bij lumbale vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Configuratie van ruggenmergstimulatie (SCS) en beeldvorming van motorneuronen . (A) De pulsgenerator met op maat gemaakte elektroden kan de amplitude, pulsbreedte en frequentie afzonderlijk aanpassen. Inlaat toonde aan dat de dimensionale specificatie van een elektrodecontact 800 μm x 500 μm x 300 μm is. (B) Plaats de anode en kathode in de buurt van respectievelijk de dorsale middellijn en de dorsale wortelingangszone (DREZ) via het micromanipulatiesysteem. Plaats de opnamepipet in het dorsolaterale gebied van de motorkolom om de fluoro-goudpositieve (FG+) motorneuronen vast te klemmen. (C) Een gezond, onmiddellijk vurend motorneuron met infrarood differentiële interferentiecontrastmicroscoop (IR-DIC) beeldvorming (60x). (D) Hetzelfde neuron met alleen fluorescentiebeeldvorming (60x), glanzende fluoro-goud (FG) deeltjes geven aan dat dit neuron een motorneuron is. (E) Samengevoegd beeld van IR-DIC en fluorescentie in FG+ motorneuron. (F-H) Een gezond vertraagd vurend motorneuron met IR-DIC-beeldvorming (60x). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Onderscheid vertraagde en onmiddellijk vurende motorneuronen met behulp van een depolarisatiestroominjectie van 5 s. (A) Onmiddellijk vurende motorneuronen: Lage rheobase kan onmiddellijk en herhaald vuren met stabiele vuurfrequentie induceren; (B) Vertraagd vuren van motorneuronen: Hoge rheobase kan een vertraagd begin induceren voor herhaald vuren met een versnellende vuursnelheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Ruggenmergstimulatie (SCS) wekte actiepotentialen (AP's) op in motorneuronen . (A) Wanneer er geen stimulatie werd toegepast, was de rustmembraanpotentiaal (RMP) -65 mV. (B) 1/3x motorische drempelstimulus kan geen AP's uitlokken. (C) 2/3x motorische drempelstimulus kan geen AP's uitlokken. (D) 1x motorische drempelstimulus kan AP's uitlokken en elke 10-20 pulsen kan een AP uitlokken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Spontane actiepotentialen (AP's) die worden afgevuurd na ruggenmergstimulatie (SCS). Nadat de SCS was uitgeschakeld, vuurde het neuron gedurende een korte periode (30-40 s) een reeks spontane AP's af, waarna het rustmembraanpotentiaal (RMP) terugkeerde naar -65 mV. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Illustratie van de parameter voor ruggenmergstimulatie (SCS) en de opgewekte excitatoire postsynaptische stroom (EPSC). (A) Illustratie van de SCS-parameter; (B,C) Na een enkele stimulatiepuls (1x motorische drempelstimulatie) kan de opgewekte EPSC worden waargenomen; (D) Na aftrek van de passieve ladingsbalancering kunnen de latentie en amplitude van de EPSC worden berekend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Voorbereiding van het instrument. (A) Perfusiebakje: plaats 10 minuten voor de perfusie gemalen ijs op de petrischaal van 10 cm gevuld met silicagel. (B) Anatomisch bakje: plaats het zelfgemaakte anatomische bakje gevuld met silicagel in de koelkast van -80 °C. (C) Snijbak: plaats de snijbak met waterband de avond voor het offeren in de koelkast van -80 °C. (D) Agarose-giethelling: plaats 30 minuten voor de perfusie een agarosehelling van 35° met voetplaten in het midden van een petrischaal van 35 mm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Intracardiale perfusie. (A) Hef het xiphoid-proces op. (B) Snijd het borstbeen langs beide zijden van de processus xiphoid door om de borstkas te openen en het hart bloot te leggen. Pas op dat u de interne thoracale vaten niet beschadigt, anders zullen massale bloedingen het hele operatieveld vullen en de operator belemmeren bij het identificeren van de ventrikeltop of het rechter atrium. (C) Steek een naald van 22 G in de linker hartkamer voor perfusie en snijd het rechter atrium door voor het verlaten van de vloeistof. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Bevestiging van de dorsale wortelactiviteit. Gebruik zuigelektroden om 1x motordrempelstimulatie toe te passen op de dorsale wortel. Als een evoked action potentiaal wordt gedetecteerd in de motorneuronen, kunnen we bevestigen dat de activiteit van de dorsale wortel intact is. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 4: Latentie en amplitude van opgeroepen EPSC's wanneer SCS was ingeschakeld. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 5: Bewijs van de geldigheid van de opgeroepen EPSC. (A) Na 1x motorische drempelstimulatie na aftrek van de passieve ladingsbalancering, kan de opgewekte EPSC worden waargenomen in een levensvatbaar motorneuron; (B) Na het stoppen van de perfusie gedurende 2 uur in dezelfde cel, werd de stimulatiepolariteit omgekeerd, 1x motorische drempelstimulatie induceerde geen EPSC, wat bevestigde dat de opgewekte EPSC geen artefact was. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 1: Berekeningsmethoden van de actieve en passieve eigenschappen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Passieve eigenschappen van motorneuronen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Actieve eigenschappen van motorneuronen Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De bewegingsinformatie die door SCS wordt gemoduleerd, wordt uiteindelijk geconvergeerd naar de motorneuronen. Daarom kan het nemen van de motorneuronen als onderzoeksdoel de onderzoeksopzet vereenvoudigen en het neuromodulatiemechanisme van SCS directer onthullen. Om tegelijkertijd verschillende stimuluskenmerken en cellulaire reacties vast te leggen, is een patch-clamp een goede methode om de elektrofysiologische kenmerken op eencellige schaal te bestuderen. Er zijn echter nog steeds enkele moeilijkheden, waaronder hoe de levensvatbaarheid van de cel te behouden, hoe het ruggenmerg snel van de benige structuur kan worden gescheiden en hoe de SCS kan worden gebruikt om met succes AP's te induceren. Daarom is deze studie bedoeld om onderzoekers te helpen snel essentiële operationele vaardigheden te begrijpen, enkele mogelijke valkuilen te vermijden en zich zo vroeg mogelijk te concentreren op het onderzoeksontwerp in plaats van op de methodologie.
Om een goede levensvatbaarheid van de cellen te verkrijgen, moet men altijd op de volgende details letten: (1) Het ruggenmerg op ijskoude temperatuur houden is erg belangrijk omdat een lage temperatuur de celdood kan remmen en de stofwisseling kan vertragen, wat het neuron kan beschermen tegen mechanische schade tijdens perfusie, dissectie en snijden13; (2) Het subtiel verwijderen van de dura mater met een microschaar kan de opname van neuronale voedingsstoffen uit omringende oplossingen verbeteren. Trek de dura mater nooit direct af; anders wordt het ruggenmerg ernstig beschadigd. Bovendien, als u vergeet de dura mater vrij te maken, kan het daaropvolgende snijproces moeilijk zijn omdat het mes de dura mater mogelijk niet volledig afsnijdt en vervolgens het resterende ruggenmerg uit agarose scheurt, wat kan leiden tot het mislukken van het snijden. (3) Vergeleken met conventionele transversale plakjes, vergroten schuine plakjes het oppervlak van grijze stof en kun je meer FG+ motorneuronen vinden in een enkele plak9. (4) Omdat het ruggenmerg alleen niet stevig op de monsterschijf kan worden bevestigd zoals de hersenen, is het inbedden ervan in agarosegel effectief om dit probleem op te lossen zonder de levensvatbaarheid van de cel te verminderen. We raden aan om agarose met een laag smeltpunt (gelpunt 26-30 °C) te gebruiken in plaats van conventionele agarose (gelpunt 38-43 °C), omdat hoge temperaturen de levensvatbaarheid van de cel kunnen schaden. (5) We raden aan dat de afstand tussen twee nylondraden van U-vormige platinadraad 1 tot 1,5 mm moet zijn, omdat losse draden het ruggenmerg niet stevig kunnen immobiliseren en dichte draden de cel kunnen verpletteren.
Vergeleken met de conventionele stimulatieapparaten, zoals bipolaire haakelektroden die veel worden gebruikt in fundamenteel onderzoek, is de SCS-elektrode in deze studie afgeleid van ons eerdere klinische werk14 en fundamenteel onderzoek15. SCS-leveringen pulseren afwisselende elektrische stimulatie, die zorgt voor verschillende parameters voor het aanpassen van dimensies. Dit SCS-apparaat heeft ook een ladingsbalansfunctie om weefselelektrolyse te voorkomen en maakt geen rechtstreeks contact met het neurale weefsel; daarom heeft deze SCS een goede veiligheid voor in vivo toepassingen.
Na SCS-behandeling kunnen de spontane AP's van motorneuronen worden toegeschreven aan de volgende redenen: (1) SCS induceert de lading om zich op te hopen in het cellichaam en axonale colliculus van neuronen, wat leidt tot de toename van RMP16. Dit fenomeen geeft aan dat SCS de prikkelbaarheid van neuronen kan verbeteren, wat verband kan houden met de verandering van geleidbaarheid van ionenkanalen na SCS, zoals Na v 1.117, K v 2.1 18 of Ca v 2.3 19. (2) SCS kan dorsale GABAergische neuronen activeren om proprioceptieve feedback naar motorneuronen te vergemakkelijken. We suggereren dat neurale transmissie continu kan bestaan tussen de sensorische neuronen en motorneuronen, wat leidt tot spontane AP's in motorneuronen na SCS. Spontane AP's kunnen een intrinsieke staat van paraatheid behouden om sensomotorisch gedrag uit te voeren20. Daarom kan het activeren of remmen van spontane AP's gunstig zijn voor de behandeling van spinale neurologische aandoeningen.
Zoals we weten, is in vivo elektrofysiologische registratie beter voor het detecteren van elektrofysiologische respons onder de natuurlijke verdeling van het elektrische veld en de plaatsing van elektroden. Bovendien maken in vivo motoneuron-opnames het mogelijk om de identiteit van motoneurons te identificeren. Dit kan worden gedaan door antidromische identificatie van motoraxonen in combinatie met spiervezelkrachtmeting21. Maar in vivo ruggenmergopnames hebben ook de volgende nadelen: (1) Motorneuron ligt op 2-3 mm afstand van het dorsale oppervlak van het ruggenmerg, zelfs met behulp van de meest geavanceerde confocale beeldvorming met twee fotonen is de waarnemingsdiepte slechts 500-800 μm, dus het is moeilijk om ze optisch in vivo te observeren met behulp van de bestaande methoden. Daarom, als we een enkel motorneuron in vivo precies willen vastklemmen, moet de glazen pipet door de dorsale kolom gaan om het onzichtbare motorneuron te bereiken; De in vivo patch-clamp kan alleen "blind" worden uitgevoerd, wat resulteert in aanzienlijke onzekerheid en faalpercentage. (2) Met uitzondering van de in vivo patch-clamp kunnen siliciumelektrode-opnames de alternatieve methode zijn, zoals Utah-array of Neuropixels-elektrode. De signalen die door siliciumelektroden worden geregistreerd, zijn echter meestal samengestelde actiepotentiaal in plaats van enkelvoudige actiepotentiaal. Hoewel de activiteit van afzonderlijke neuronen is opgelost met behulp van algoritmen voor het sorteren van spikes, moeten de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van sorteeralgoritmen nog worden verbeterd.
Vergeleken met de in vivo opnames is het grootste voordeel van in vitro tegen in vivo het gebruik van een spanningsklem, die een uniek begrip mogelijk maakt van de synaptische routes die door SCS worden geactiveerd. Bovendien zou het ook het gebruik van live beeldvormingstools mogelijk maken. We speculeren dat SCS de afgifte van neurotransmitters zoals GABA en glutamaat van neuronen op het hoogste niveau op de motorneuronen induceert, wat resulteert in een algehele exciterende EPSC-respons7. Daarom zullen we in ons komende onderzoek de detectie van IPSC, mini EPSC (mEPSC) en opgeroepen EPSC geïnduceerd door SCS opnemen om de patronen van remmende en exciterende afgifte van neurotransmitters uit pre-motorneuronen of interneuronen te verduidelijken. We erkenden volledig dat in-vitrostimulatie ook enkele beperkingen heeft: (1) Longitudinale circuits over lange afstand van het ruggenmerg zijn verstoord, wat resulteert in het verlies van inkomende informatie van de motorische cortex of de onderste extremiteit; (2) De verdeling van elektrische velden tijdens in-vitrostimulatie kan verschillen van die bij in-vivostimulatie. In deze studie was de activeringsdrempel (ongeveer in milliampère) voor AP's veel hoger dan die van het in vivo experiment (ongeveer in microampère)15; dit kwam omdat de volumecapaciteit van de ACSF-oplossing in de opnamekamer veel hoger was dan de cerebrospinale vloeistof in de natuurlijke toestand, en de wiskundige theorie ondersteunt dat het elektrische veld sneller verzwakt in materialen met een hoge geleidbaarheid22. Daarom werd het grootste deel van de stroom geabsorbeerd door de badoplossing en speculeren we dat slechts een klein deel van het elektrische veld naar de zenuwwortels kan diffunderen.
Daarom, rekening houdend met de voor- en nadelen van in vivo stimulatie en in vitro stimulatie, kan worden geconcludeerd dat in vitro patch-clamp een voordelige methode is om de synaptische aard en/of cellulaire effecten van SCS bij neonatale knaagdieren te bestuderen.
In de klinische praktijk trekt de elektrode niet direct samen met het oppervlak van het ruggenmerg of de zenuwwortel23. In plaats daarvan vertrouwt het op de elektrische veldstraling die door de elektrode wordt gegenereerd om indirect de activiteit van de zenuwen te beïnvloeden1. Meerdere studies 1,23,24 hebben bevestigd dat het kathodecontact van SCS zo dicht mogelijk bij de dorsale wortel of de ingangszone (DREZ) moet worden geplaatst om een optimale selectiviteit te bereiken voor het stimuleren van een specifieke spier. Het vergroten van de afstand tussen de elektrode en de zenuwwortel zal de specificiteit van de stimulatie verzwakken. Daarom plaatsen we de kathode direct in de buurt van de DREZ in plaats van direct contact te maken met de zenuwwortel of het ruggenmerg.
De afferente vezels van de dorsale wortel projecteren eerst naar de sensorische neuronen, dan naar de interneuronen en de motorneuronen. Naast de dwarse uitstekende circuits zijn er ook circuits die naar het rostrale en caudale uiteinde uitsteken. Motorneuronen die overeenkomen met de voorste spier tibialis zijn bijvoorbeeld op meerdere niveaus te vinden25. Daarom, hoewel schuine voorbereiding de transversale uitstekende circuits kan verbreken, zal het nog steeds niet-transversale uitstekende vezels behouden, waardoor de studie van de pre-motorische sensorische circuits mogelijk wordt. Naast schuine en transversale voorbereiding biedt longitudinale voorbereiding duidelijke voordelen om de circuits van de dorsale wortel naar de motorneuronen beter te behouden en de effectieve retentie van ruggenmergcircuits over meerdere segmenten mogelijk te maken26, wat een betere weergave geeft van de werkelijke fysiologische omstandigheden.
Volgens het simulatieonderzoek 6,27,28 activeert SCS voornamelijk proprioceptieve afferente vezels om de beweging van de onderste ledematen te herstellen, inclusief de Ia-, Ib- en II-afferente vezels. In deze studie kunnen we echter niet met zekerheid bevestigen welke soorten vezels specifiek door SCS werden geactiveerd. We speculeren dat een soortgelijk patroon ook kan bestaan in de in vitro pleisterklem. We zullen dit probleem aanpakken door wiskundige modellering en simulatie uit te voeren en deze op te nemen in ons lopende werk.
Concluderend kan dit protocol onderzoekers helpen hun operatieve vaardigheden te verbeteren en de essentie te begrijpen van het combineren van patch-clamp-opnames en SCS om het elektrische mechanisme van SCS op een eencellige schaal te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 en 82301657) en het China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
