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Neuroscience

A Preparação Ex Vivo do Corte da Medula Espinhal para o Registro de Patch-Clamp de Células Inteiras em Neurônios Motores Durante a Estimulação da Medula Espinhal

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65385
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,2
1National Engineering Research Center of Neuromodulation, School of Aerospace Engineering, Tsinghua University, 2IDG/McGovern Institute for Brain Research, Tsinghua University, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

Summary

Este protocolo descreve um método que utiliza um patch-clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à estimulação da medula espinhal (SCS) com alta resolução espaço-temporal, o que pode ajudar os pesquisadores a melhorar suas habilidades em separar a medula espinhal e manter a viabilidade celular simultaneamente.

Abstract

A estimulação da medula espinhal (ECS) pode efetivamente restaurar a função locomotora após a lesão medular (LME). Como os neurônios motores são a unidade final para executar comportamentos sensório-motores, estudar diretamente as respostas elétricas dos neurônios motores com SCS pode nos ajudar a entender a lógica subjacente da modulação motora espinhal. Para registrar simultaneamente diversas características de estímulos e respostas celulares, um patch-clamp é um bom método para estudar as características eletrofisiológicas em escala unicelular. No entanto, ainda existem algumas dificuldades complexas para atingir esse objetivo, incluindo a manutenção da viabilidade celular, a separação rápida da medula espinhal da estrutura óssea e o uso do SCS para induzir com sucesso potenciais de ação. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado usando patch-clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à SCS com alta resolução espaço-temporal, o que pode ajudar o pesquisador a melhorar suas habilidades em separar a medula espinhal e manter a viabilidade celular, ao mesmo tempo em que estuda suavemente o mecanismo elétrico da SCS no neurônio motor e evitar tentativas e erros desnecessários.

Introduction

A estimulação da medula espinhal (ECS) pode efetivamente restaurar a função locomotora após a lesão medular (LME). Andreas Rowald e col. relataram que a ECS possibilita a função locomotora e do tronco dos membros inferiores em um único dia1. Explorar o mecanismo biológico da SCS para recuperação locomotora é um campo de pesquisa crítico e de tendência para o desenvolvimento de uma estratégia SCS mais precisa. Por exemplo, a equipe de Grégoire Courtine demonstrou que o interneurônio excitatório Vsx2 e os neurônios Hoxa10 na medula espinhal são os neurônios-chave para responder à SCS, e a neuromodulação célula-específica é viável para restaurar a capacidade de andar do rato após a LME2. No entanto, poucos estudos enfocam o mecanismo elétrico da SCS em escala unicelular. Embora seja bem conhecido que o estímulo de corrente contínua supralimiar pode eliciar os potenciais de ação (PAs) no experimento clássico com lulas 3,4,5, ainda não está claro como a estimulação elétrica alternada pulsada, como a ECS, afeta a geração do sinal motor.

Dada a complexidade dos circuitos neurais intraespinhais, a seleção apropriada para a população celular é importante para investigar o mecanismo elétrico da SCS. Embora o ECS restaure a função motora ativando a via proprioceptiva6, os neurônios motores são a unidade final para executar o comando motor, derivado da integração da entrada aferente de informações proprioceptivas7. Portanto, estudar diretamente as características elétricas dos neurônios motores com SCS pode nos ajudar a entender a lógica subjacente da modulação motora espinhal.

Como sabemos, patch-clamp é o método padrão-ouro para registro eletrofisiológico celular com resolução espaço-temporal extremamentealta8. Portanto, este estudo descreve um método que utiliza um patch clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à SCS. Comparado com o patch-clamp9 do cérebro, o patch-clamp da medula espinhal é mais difícil devido aos seguintes motivos: (1) A medula espinhal é protegida pelo canal vertebral com volume minúsculo, o que requer micromanipulação muito fina e manutenção rigorosa do gelo para obter melhor viabilidade celular. (2) Como a medula espinhal é muito fina para ser fixada na bandeja de corte, ela deve ser imersa em agarose de baixo ponto de fusão e aparada após a solidificação.

Assim, este método fornece detalhes técnicos na dissecção da medula espinhal e na manutenção da viabilidade celular ao mesmo tempo, de modo a estudar suavemente o mecanismo elétrico da SCS em neurônios motores e evitar tentativas e erros desnecessários.

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Protocol

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou todos os experimentos com animais e os estudos foram conduzidos de acordo com as normas pertinentes de bem-estar animal.

1. Preparação dos animais

  1. Animais
    1. Informações sobre alojamento: Ratos Sprague-Dawley machos domésticos (10-14 dias pós-natal, P10-P14) em um ambiente específico livre de patógenos.
      NOTA: As condições da sala foram mantidas em 20 °C ± 2 °C, umidade: 50%-60%, com um ciclo claro/escuro de 12 horas. Os animais tinham livre acesso a comida e água.
    2. Rotular os neurônios motores retrogradamente: Injetar Fluoro-Gold (FG) no músculo tibial anterior e gastrocnêmio bilateral (2% em solução salina estéril, 50 μL por músculo) para marcar retrogradamente os neurônios motores 2 dias antes do sacrifício.
  2. Soluções
    1. Preparar solução de corte: Misture 120 mM de cloreto de colina, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1,25 mM NaH 2 PO4, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl2, 1,3 mM ácido ascórbico, 15 mM glicose. Pré-borbulhar a solução com 95% de O 2 e 5% de CO2 (ajustar para pH 7,4 com KOH) por 30 min antes da dissecção e fatiamento. Arrefecer a solução com gelo picado.
    2. Preparar líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF): Misturar 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4; 1,3 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 e 10 mM glicose. Pré-borbulhar a solução com 95% de O 2 e 5% de CO2 por 30 min antes da incubação.
    3. Preparar solução intracelular: Misturar 126 mM K-Gluconato, 2 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na2GTP, 10 mM K-Fosfocreatina e 0,5% Neurobiotina (pH 7,25 e 305 mOsm/Kg). Arrefecer a solução com gelo picado.
    4. Prepare o gel de agarose de baixo derretimento: Dissolva 4 g de agarose em 100 mL de solução de corte e use um rotor de agitação magnética para dissolvê-lo completamente. A 30 minutos antes de incorporar, aqueça a agarose de baixo ponto de fusão no forno de micro-ondas com alta potência por 1 min e, em seguida, transfira-a para um banho-maria de 39 °C para manter o estado líquido.
  3. Preparação do instrumento
    1. Colocar gelo triturado na bandeja de perfusão (Figura 1A suplementar) 10 minutos antes da perfusão. Coloque a bandeja anatômica (Figura 1B Suplementar) e a bandeja de corte (Figura 1C Suplementar) com uma faixa de água a -80 °C com antecedência.
    2. Colocar a câmara de incubação com tela de nylon no forno a 45 °C durante a noite com antecedência.
    3. Use agarose de baixo ponto de fusão para pré-fabricar uma inclinação de 35° e uma plataforma de 2 mm de espessura (Figura 1D suplementar). Após a solidificação do gel, coloque-os no centro de uma placa de Petri de 35 mm para apoiar a medula espinhal nos próximos procedimentos.
  4. Perfusão intracárdica
    1. Anestesiar os ratos com tribromoetanol a 2,5% (160 μL/10 g) por injeção intraperitoneal. Certifique-se de que os ratos estão totalmente anestesiados, verificando a falta de resposta a estímulos externos, como uma leve pitada do dedo do pé.
    2. Confirmada a anestesia adequada, colocar os ratos em decúbito dorsal e imobilizá-los na placa de Petri preenchida com sílica gel.
    3. Cortar uma incisão longitudinal de 5 mm na pele caudalmente ao processo xifoide e, em seguida, expandir completamente o espaço subcutâneo. Cortar uma incisão cutânea longitudinal de 2 cm ao longo da linha média ventral para expor completamente a parede torácica externa, começando com a incisão acima mencionada e terminando com o topo do tórax.
    4. Use uma pinça dentada para levantar o xifoide (Figura 2A Suplementar) e, em seguida, use uma tesoura fina para cortar o diafragma. Cortar o esterno em ambos os lados do processo xifoide para abrir o tórax e expor o coração (Figura 2B suplementar).
      OBS: Cuidado para preservar os vasos torácicos internos de ambos os lados; caso contrário, pode causar sangramento maciço.
    5. Use pinça desdentada para levantar o ventrículo esquerdo. Inserir uma agulha 22G no ápice do ventrículo esquerdo ao longo do eixo longitudinal do ventrículo esquerdo (Figura 2C suplementar). Enquanto isso, observe a pulsação rítmica do sangue no tubo de perfusão, ou a agulha pode perfurar o ventrículo direito, o que pode levar a um efeito de perfusão pobre.
      OBS: Pinça dentada não deve ser usada; caso contrário, pode causar vazamento de sangue extra do local de retenção da pinça.
    6. Use uma tesoura fina para cortar o átrio direito (Figura 2C suplementar) e, em seguida, injete manualmente 100 mL de líquido de perfusão gelado a uma taxa de cerca de 2 mL/s em 1 minuto.
      NOTA: Quando o fígado e as patas dos ratos ficam pálidos e não há sangue saindo do átrio direito, uma boa perfusão pode ser obtida.
  5. Dissecção medular (Figura 1)
    1. Coloque o rato em decúbito ventral e corte a coluna vertebral na espinha ilíaca anterossuperior (cerca do nível vertebral de L4) e no ponto de deslocamento da curvatura da coluna torácica (aproximadamente ao nível vertebral de T6), respectivamente (Figura 1A). Em seguida, coloque imediatamente a coluna isolada na solução de perfusão gelada oxigenada para lavar o sangue residual e o tecido adiposo; Esse procedimento é benéfico para manter o campo operatório limpo nos procedimentos subsequentes.
      NOTA: Os músculos paraespinhais devem ser reservados, o que é propício para a posterior fixação da coluna vertebral usando um pino de inseto.
    2. Transfira imediatamente a coluna isolada para a bandeja anatômica (Figura 1B) com o dorso para cima e a extremidade rostral próxima ao operador. Preencher a moldeira anatômica com 50 mL de solução de corte continuamente oxigenada e gelada (Figura 1B).
    3. Use quatro pinos de insetos para fixar a coluna penetrando nos músculos paraespinhais (Figura 1B).
    4. Ao microscópio de dissecção, cortar os pedículos vertebrais de ambos os lados da extremidade rostral com a microtesoura, que pode ser denominada "laminectomia" (Figura 1C). Preste atenção para não danificar a medula espinhal. Enquanto isso, use a pinça microdentada para levantar o corpo vertebral cortado.
    5. Após a laminectomia, não separe a medula espinhal do canal espinhal imediatamente. Em vez disso, use uma microtesoura para cortar a dura-máter ao longo da linha média dorsal, o que é propício para a captação de nutrientes entre as células e ACSF oxigenada (Figura 1D).
      NOTA: Nunca rasgue a dura-máter. Só é permitido o corte da dura-máter por microtesoura; caso contrário, a raiz nervosa e o parênquima espinhal serão seriamente danificados!
    6. Levantar a parte rostral da medula espinhal e, em seguida, cortar cuidadosamente a raiz nervosa com cerca de 1 mm reservado (Figura 1E). Após separar a medula espinhal do canal vertebral, utilizar 2 pinos de insetos para fixar a medula espinhal com o lado ventral para cima (Figura 1F).
    7. Utilizar uma microtesoura para cortar a dura-máter ao longo da linha média ventral (Figura 1F). Cortar as raízes nervosas redundantes com cerca de 1 mm reservado.
      NOTA: O nervo é muito mais tenaz do que a medula espinhal. Se a raiz nervosa reservada for muito longa (>1 mm), o vibratome não pode cortar a raiz nervosa, o que pode levar a uma ruptura grave no parênquima espinhal.
    8. Utilizar uma microtesoura para separar o alargamento lombar até um comprimento de 6-7 mm (Figura 1G).
  6. Incorporação na agarose de baixo derretimento
    1. Colocar o alargamento lombar na inclinação de 35° (Figura 1H) com a face dorsal para cima e a extremidade caudal para baixo. Use um papel de filtro absorvente para remover água abundante na superfície do tecido (Figura 1H).
    2. Despeje lentamente o gel de agarose derretido na placa de Petri contendo o aumento lombar (Figura 1I).
      NOTA: Não despeje muito rápido, ou bolhas se acumularão no gel.
    3. Coloque a placa de Petri acima na mistura de água gelada para resfriar o gel o mais rápido possível, o que é propício para manter a atividade das células.
    4. Aparar o gel em um cubo de 15 mm x 10 mm x 10 mm e montá-lo no disco da amostra com supercola (Figura 1J).
  7. Cortar
    1. Coloque o disco da amostra na bandeja de corte pré-congelada e, em seguida, despeje a solução de corte gelada (Figura 1K). Borbulhar continuamente com 95% CO 2 e 5% O2 na bandeja de corte.
    2. Defina os parâmetros do vibratom: espessura: 350 μm; velocidade: 0,14-0,16 mm/s, amplitude: 1,0 mm e frequência de vibração: 85 Hz.
    3. Colha 2-3 fatias adequadas por animal. Registre 1-2 neurônios motores FG+ saudáveis por fatia, com uma faixa de 5-6 células por animal.
  8. Incubação
    1. Use uma pinça deslizante para prender um corte (Figura 1L) e colocá-lo na câmara de incubação preenchida com ACSF continuamente oxigenada. Colocar a câmara de incubação em banho-maria a 32 °C durante 30 minutos e, em seguida, continuar a incubá-la à temperatura ambiente (TR) durante mais 30 minutos antes do registo.
      NOTA: Os procedimentos acima, desde a anestesia até a obtenção do primeiro corte, devem ser concluídos dentro de 20-30 min para manter a viabilidade das células tanto quanto possível. Os neurônios motores em cada fatia podem manter sua viabilidade por aproximadamente 6-7 h.

2. Gravação de patch clamp com SCS (Figura 2)

  1. Preparações
    1. Perfundir a câmara de gravação com ACSF continuamente borbulhada a uma taxa de cerca de 1-2 mL/min. Ajuste a vazão individualmente através do painel de controle da bomba peristáltica.
    2. Coloque uma fatia na câmara de gravação. Use o fio de platina em forma de U com fios de nylon para estabilizar firmemente a fatia no lugar.
    3. Use um microscópio de contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC) para observar o corte. Sob a lente objetiva 4x, confirme se o comprimento da raiz dorsal é de cerca de 1 mm. Encontre a área onde a raiz dorsal entra no parênquima e, em seguida, mova o campo de visão central para esta área.
    4. Conecte o gerador de pulsos com eletrodos feitos sob medida (Figura 2A).
  2. Configuração do SCS
    1. Colocar o ânodo do SCS próximo à linha média dorsal através do sistema de micromanipulação (Figura 2B).
    2. Colocar o cátodo do SCS próximo à zona de entrada da raiz dorsal (DREZ) através do sistema de micromanipulação (Figura 2B).
  3. Segmentação e geração de imagens de células
    1. Use IR-DIC com uma lente objetiva de 10x encontrar aproximadamente a região dorsolateral da coluna motora, onde a maioria dos neurônios motores estão localizados. Em seguida, mova o campo de visão central para esta área.
    2. Mude para uma lente objetiva de 60x para encontrar um neurônio saudável com uma superfície lisa e brilhante e núcleos invisíveis (Figura 2C,F).
    3. Diminua ligeiramente a intensidade do infravermelho e ligue a fonte de luz de fluorescência. Alternar o filtro de luz para o filtro de excitação ultravioleta de banda larga (Figura 2D,G), para selecionar um neurônio motor FG-positivo (FG+) apropriado (Figura 2E,H).
    4. Use eletrodos de sucção para aplicar estimulação do limiar motor de 1x na raiz dorsal. Se um potencial de ação evocado é detectado nos neurônios motores (Figura 3 Suplementar), confirma-se que a atividade da raiz dorsal está intacta. Caso contrário, essa fatia deve ser descartada.
  4. Gravação de patch-clamp
    1. Encha a micropipeta com a solução intracelular e insira-a no suporte do eléctrodo. Use o sistema de micromanipulação para abaixar a pipeta para o banho de ACSF. A resistência da pipeta varia de 5-8 MΩ.
    2. Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva na pipeta para soprar a poeira e os detritos celulares.
      1. Abaixe o eletrodo para se aproximar da célula. Quando a pipeta toca a superfície do neurônio FG+, um pequeno recuo da membrana torna-se visível ao nível da ponta. Solte a pressão positiva.
      2. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de pressão negativa na pipeta usando uma seringa. Isso cria uma pequena quantidade de sucção que puxa a membrana celular em contato com a pipeta de vidro. Sempre preste atenção à resistência total na interface do software até que o valor da resistência aumente para gigaohms (>1 GΩ). Em seguida, o gigaseal é formado.
    3. Aperte o potencial de membrana a -70 mV e, em seguida, pressione o botão de compensação rápida de capacitância na interface de software do amplificador. Aplique suavemente uma pressão negativa transitória para romper a membrana celular e, em seguida, pressione o botão de compensação de capacitância lenta na interface de software do amplificador. Neste ponto, uma boa configuração de célula inteira é obtida.
    4. Alterne para o modo de fixação de corrente clicando no botão IC na interface do software e registre o potencial de membrana de repouso (RMP).
    5. Aplicar o SCS por 1-2 s com amplitude de 1-10 mA, enquanto a largura e a frequência de pulso são fixadas em 210 μs e 40 Hz, respectivamente. Determinar o limiar motor aumentando lentamente a amplitude de estimulação até que a primeira PA seja observada.
    6. Distinguir neurônios motores de disparo retardado e imediato usando uma injeção de corrente despolarizante de 5 s ao redor da reobase no modo de pinça de corrente10,11,12. Neurônios motores de disparo imediato: A baixa reobase pode induzir disparos imediatos e repetitivos com frequência de disparo estável; Neurônios motores de disparo tardios: A reobase alta pode induzir um início tardio para disparos repetitivos com uma taxa de disparo acelerada (Figura 3).
    7. Quando o SCS estiver desligado, continue a registrar o potencial de membrana para capturar os APs disparando espontaneamente.
    8. Execute gravações de clamp de voltagem para corrente pós-sináptica excitatória (EPSC) quando o SCS estiver ligado e desligado. O parâmetro de estimulação é 1x limiar motor, 210 μs, 2 Hz.

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Representative Results

Graças à rigorosa manutenção a baixa temperatura durante a operação fina (Figura 1 Suplementar, Figura 2 Suplementar e Figura 1), a viabilidade celular foi boa o suficiente para realizar registros eletrofisiológicos subsequentes. Para simular ao máximo o cenário clínico, utilizamos a micromanipulação para posicionar o cátodo e o ânodo do SCS próximos à linha média dorsal e ao EDRED, respectivamente (Figura 2), o que poderia iniciar o sinal neural no corno dorsal para se propagar para os neurônios motores na região dorsolateral da coluna motora. Neste estudo, utilizamos o GF para localizar os neurônios motores com diâmetro de 20-50 μm. Como mostrado na Figura 2D,G, confirmamos com confiança um neurônio FG+ saudável como um neurônio motor - o terminal do circuito espinhal. Esse método de marcação abriu caminho para estudar como a SCS afeta o padrão de disparo. As propriedades eletrofisiológicas dos neurônios motores de disparo tardio e imediato estão listadas na Tabela Suplementar 1 e na Tabela Suplementar 2. Os métodos para calcular as propriedades ativas e passivas são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

Quando a SCS liberou um campo elétrico alternado pulsado para o corte espinhal, usamos pela primeira vez o modo de pinça de corrente para registrar a resposta do potencial de membrana (Figura 4). À medida que aumentamos gradualmente a amplitude de estimulação com um passo de 1/3 limiar motor (Figura 4B,C), o potencial de membrana também se elevou com ele, mas apenas 1x limiar motor poderia eliciar Aps (Figura 4D). A Figura 4D mostra que cerca de 10-20 pulsos poderiam eliciar um PA, o que indica que uma regularidade definida da resposta AP à amplitude da SCS pode existir.

Após o desligamento da ECS, continuamos a registrar o potencial de membrana. A Figura 5 mostrou que o potencial de membrana aumentou ligeiramente para -60 mV, e o neurônio disparou uma série de PA espontâneas. Esses PAs espontâneos duram por um curto período de tempo (30-40 s), então o potencial de membrana retornou a -65 mV, indicando que o SCS pode aumentar temporariamente a excitabilidade celular.

Em seguida, foram utilizados registros de clampe de voltagem para EPSC quando a SCS estava ligada e desligada (Figura 6). Após cada pulso de SCS, uma EPSC evocada pôde ser detectada. A latência entre o artefato de estímulo e a EPSC foi de 2,64 ± 0,38 ms (Figura 4 Suplementar). A amplitude das EPSCs evocadas foi de 35,14 ± 12,73 pA (Figura 4 Suplementar). A frequência de EPSCs evocadas é consistente com a frequência de SCS. Após a subtração do balanceamento passivo de carga, pode-se observar a EPSC evocada em um neurônio motor viável após estimulação do limiar motor 1x (Figura 5A Suplementar). A polaridade do estímulo foi invertida após interrupção da perfusão por 2 h na mesma célula. A estimulação não induziu nenhuma EPSC, confirmando que a EPSC evocada não era um artefato (Figura 5B Suplementar).

Figure 1
Figura 1: Dissecção e corte medular . (A) Cortar a coluna vertebral na espinha ilíaca anterossuperior (cerca de L4 nível vertebral) e o ponto de deslocamento da curvatura da coluna torácica (aproximadamente T6 nível vertebral), respectivamente. (B) Transfira imediatamente a coluna isolada para a bandeja anatômica com o dorso para cima e a extremidade rostral próxima ao operador. Encha a bandeja anatômica com a solução de corte gelada continuamente oxigenada. (C) Realizar laminectomia em ambos os lados a partir da extremidade rostral. (D) Cortar a dura-máter dorsal, que é propícia à captação de nutrientes entre as células e o líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado (LCA). (E) Corte cuidadosamente a raiz nervosa. (F) Cortar a dura-máter ventral. (G) Separe o alargamento lombar para um comprimento de 6-7 mm. (H) Coloque o alargamento lombar na inclinação de 35 ° com o lado dorsal para cima e a extremidade caudal para baixo. Use um papel de filtro absorvente para remover a água abundante na superfície do tecido. (I) Despeje lentamente o gel de agarose derretido na placa de Petri. (J) Aparar o gel em um cubo e montá-lo no disco da amostra com super cola. (K) Coloque o disco da amostra na bandeja de corte e, em seguida, despeje a solução de corte gelada. (L) Um exemplo de um corte espinhal no aumento lombar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Configuração da estimulação medular (ECS) e imagem do neurônio motor. (A) O gerador de pulsos com eletrodos feitos sob medida pode ajustar separadamente a amplitude, a largura do pulso e a frequência. A entrada mostrou que a especificação dimensional de um contato com eletrodo é de 800 μm x 500 μm x 300 μm. (B) Colocar o ânodo e o cátodo próximos à linha média dorsal e à zona de entrada da raiz dorsal (EDRE) através do sistema de micromanipulação, respectivamente. Coloque a pipeta de registro na região dorsolateral da coluna motora para pinçar os neurônios motores Fluoro-Gold positivo (FG+). (C) Um neurônio motor de disparo imediato saudável com imagem de microscópio de contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC) (60x). (D) O mesmo neurônio com apenas imagens de fluorescência (60x), partículas brilhantes de Fluoro-Gold (FG) representam que este neurônio é um neurônio motor. (E) Imagem mesclada de IR-DIC e fluorescência no neurônio motor FG+. (F-H) Um neurônio motor de disparo atrasado saudável com imagem IR-DIC (60x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Distinguir neurônios motores de disparo tardio e imediato usando uma injeção de corrente despolarizante de 5 s. (A) Neurônios motores de disparo imediato: A reobase baixa pode induzir disparo imediato e repetitivo com frequência de disparo estável; (B) Neurônios motores de disparo retardado: A reobase alta pode induzir um início tardio para disparos repetitivos com uma taxa de disparo acelerada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: A estimulação medular (ECS) provocou o disparo de potenciais de ação (PAs) em neurônios motores . (A) Quando nenhum estímulo foi aplicado, o potencial de membrana de repouso (PGR) foi de -65 mV. (B) 1/3x do estímulo do limiar motor não consegue eliciar PAs. (C) O estímulo do limiar motor de 2/3x não pode eliciar PAs. (D) 1x estímulo de limiar motor pode eliciar PAs, e a cada 10-20 pulsos pode eliciar PA.

Figure 5
Figura 5: Disparo dos potenciais de ação espontânea (PAs) após estimulação medular (ECS). Depois que o SCS foi desligado, o neurônio disparou uma série de APs espontâneas por um curto período de tempo (30-40 s), então o potencial de membrana de repouso (RMP) retornou a -65 mV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Ilustração do parâmetro estimulação medular (ECS) e corrente pós-sináptica excitatória evocada (EPSC). (A) Ilustração do parâmetro SCS; (B,C) Após um único pulso de estimulação (1x estimulação do limiar motor), pode-se observar a EPSC evocada; (D) Após a subtração do balanceamento passivo de carga, pode-se calcular a latência e a amplitude do EPSC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Preparação do instrumento. (A) Bandeja de perfusão: 10 minutos antes da perfusão, colocar gelo triturado na placa de Petri de 10 cm preenchida com sílica gel. (B) Bandeja anatômica: na noite anterior ao sacrifício, coloque a bandeja anatômica de fabricação própria preenchida com sílica gel na geladeira a -80 °C. (C) Bandeja de corte: na noite anterior ao sacrifício, coloque a bandeja de corte com faixa de água na geladeira a -80 °C. (D) Inclinação de fundição de agarose: 30 min antes da perfusão, colocar um talude de agarose de 35° com placas de base no centro de uma placa de Petri de 35 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 suplementar: Perfusão intracárdica. (A) Levantar o processo xifoide. (B) Cortar o esterno ao longo de ambos os lados do processo xifoide para abrir o tórax e expor o coração. Tenha cuidado para não danificar os vasos torácicos internos, ou sangramento maciço preencherá todo o campo operatório e impedirá o operador de identificar o ápice do ventrículo ou átrio direito. (C) Inserir uma agulha 22G no ápice do ventrículo esquerdo para perfusão e cortar o átrio direito para saída de líquido. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Confirmando a atividade da raiz dorsal. Use eletrodos de sucção para aplicar estimulação do limiar motor de 1x na raiz dorsal. Se um potencial de ação evocado é detectado nos neurônios motores, podemos confirmar que a atividade da raiz dorsal está intacta. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 4 Suplementar: Latência e amplitude das EPSCs evocadas quando a ECS estava ligada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 5: Demonstração da validade da EPSC evocada. (A) Após estimulação do limiar motor de 1x após subtração do balanceamento passivo de carga, a EPSC evocada pode ser observada em um neurônio motor viável; (B) Após a interrupção da perfusão por 2 h na mesma célula, a polaridade da estimulação foi invertida, a estimulação do limiar motor de 1x não induziu nenhuma EPSC, o que confirmou que a EPSC evocada não era um artefato. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Métodos de cálculo das propriedades ativas e passivas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Propriedades passivas dos neurônios motores. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 2: Propriedades ativas dos neurônios motores Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

A informação do movimento modulada pela SCS é finalmente convergente para os neurônios motores. Portanto, tomar os neurônios motores como alvo da pesquisa pode simplificar o desenho do estudo e revelar o mecanismo de neuromodulação da SCS mais diretamente. Para registrar simultaneamente diversas características de estímulos e respostas celulares, um patch-clamp é um bom método para estudar as características eletrofisiológicas em escala unicelular. No entanto, ainda existem algumas dificuldades, incluindo como manter a viabilidade celular, como separar rapidamente a medula espinhal da estrutura óssea e como usar o SCS para induzir PAs com sucesso. Portanto, este estudo visa ajudar os pesquisadores a compreender rapidamente as habilidades operatórias essenciais, evitar algumas possíveis armadilhas e se concentrar no desenho do estudo em vez da metodologia o mais cedo possível.

Para se obter boa viabilidade celular, deve-se sempre atentar para os seguintes detalhes: (1) Manter a medula espinhal em temperatura gelada é muito importante, pois a baixa temperatura pode inibir a morte celular e retardar a taxa metabólica, o que pode proteger o neurônio de danos mecânicos durante a perfusão, dissecção e fatiamento13; (2) A remoção delicada da dura-máter por microtesoura pode aumentar a absorção neuronal de nutrientes das soluções circundantes. Nunca descasque diretamente a dura-máter; caso contrário, a medula espinhal será seriamente danificada. Além disso, se você esquecer de limpar a dura-máter, o processo de fatiamento subsequente pode ser difícil porque a lâmina pode não cortar completamente a dura-máter e, em seguida, arrancar a medula espinhal restante da agarose, o que pode levar à falha do fatiamento. (3) Em comparação com o corte transversal convencional, os cortes oblíquos aumentam a área de substância cinzenta, e você pode encontrar mais neurônios motores FG+ em um único corte9. (4) Como a medula espinhal sozinha não pode ser firmemente fixada no disco da amostra como o cérebro, incorporá-la em gel de agarose é eficaz para resolver esse problema sem diminuir a viabilidade celular. Recomendamos o uso de agarose de baixo derretimento (ponto de gel 26-30 °C) em vez de agarose convencional (ponto de gel 38-43 °C), porque a alta temperatura pode danificar a viabilidade celular. (5) Recomendamos que a distância entre dois fios de nylon de fio de platina em forma de U seja de 1 a 1,5 mm, pois fios soltos não conseguem imobilizar firmemente a medula espinhal, e fios densos podem esmagar a célula.

Comparado com os dispositivos de estimulação convencionais, como os eletrodos de gancho bipolar, amplamente utilizados em pesquisa básica, o eletrodo SCS neste estudo é derivado de nosso trabalho clínico prévio14 e pesquisabásica15. A SCS entrega estimulação elétrica alternada pulsada, que fornece diversas dimensões de ajuste de parâmetros. Este dispositivo SCS também tem uma função de balanço de carga para evitar a eletrólise tecidual e não entra em contato direto com o tecido neural; portanto, este SCS tem boa segurança para aplicações in vivo.

Após o tratamento com SCS, os PAs espontâneos dos neurônios motores podem ser atribuídos aos seguintes motivos: (1) SCS induz o acúmulo de carga no corpo celular e colículo axonal dos neurônios, levando ao aumento do RMP16. Esse fenômeno indica que a SCS pode melhorar a excitabilidade dos neurônios, o que pode estar relacionado à mudança da condutividade dos canais iônicos após a SCS, como Na v 1,117, K v 2,1 18 ou Ca v 2,319. (2) A SCS pode ativar neurônios gabaérgicos dorsais para facilitar o feedback proprioceptivo aos neurônios motores. Sugerimos que a transmissão neural pode existir continuamente entre os neurônios sensoriais e os neurônios motores, levando a PAs espontâneos em neurônios motores após a SCS. Os PA espontâneos podem manter um estado intrínseco de prontidão para a execução de comportamentos sensório-motores20. Portanto, ativar ou inibir PA espontâneas pode ser benéfico para o tratamento de doenças neurológicas da coluna vertebral.

Como sabemos, o registro eletrofisiológico in vivo é melhor para detectar a resposta eletrofisiológica sob a distribuição natural do campo elétrico e a colocação dos eletrodos. Além disso, registros in vivo de motoneurônios permitem a identificação da identidade de motoneurônios. Isso pode ser feito por meio da identificação antidrômica dos axônios motores acoplada à medida da força da fibramuscular21. Mas os registros medulares in vivo também têm as seguintes desvantagens: (1) O neurônio motor fica a 2-3 mm de distância da superfície dorsal da medula espinhal, mesmo usando a imagem confocal de dois fótons mais avançada, a profundidade de observação é de apenas 500-800 μm, por isso é difícil observá-los opticamente in vivo usando os métodos existentes. Portanto, se quisermos prender exatamente um único neurônio motor in vivo, a pipeta de vidro deve passar pela coluna dorsal para alcançar o neurônio motor invisível; O patch-clamp in vivo só pode ser realizado de forma "cega", resultando em incerteza significativa e taxa de falha. (2) Com exceção do patch-clamp in vivo , o registro de eletrodos de silício pode ser o método alternativo, como o arranjo de Utah ou o eletrodo de Neuropixels. No entanto, os sinais registrados pelos eletrodos de silício são principalmente potencial de ação composto em vez de potencial de ação único. Embora a atividade de neurônios individuais tenha sido resolvida usando algoritmos de classificação de ponta, a precisão e a confiabilidade dos algoritmos de classificação ainda precisam ser melhoradas.

Em comparação com os registros in vivo, o maior benefício do in vitro contra o in vivo é o uso de pinça de tensão, que permite uma compreensão única das vias sinápticas ativadas pelo SCS. Além disso, também permitiria o uso de ferramentas de imagem ao vivo. Especulamos que a SCS induz a liberação de neurotransmissores como GABA e glutamato de neurônios de nível superior para os neurônios motores, resultando em uma resposta global excitatória de EPSC7. Portanto, em nossas próximas pesquisas, incorporaremos a detecção de IPSC, mini EPSC (mEPSC) e EPSC evocada induzida por SCS para esclarecer os padrões de liberação de neurotransmissores inibitórios e excitatórios de neurônios pré-motores ou interneurônios. Reconhecemos plenamente que a estimulação in vitro também tem algumas limitações: (1) o circuito longitudinal de longo alcance da medula espinhal é interrompido, resultando na perda de informações recebidas do córtex motor ou membro inferior; (2) A distribuição dos campos elétricos durante a estimulação in vitro pode diferir daquela na estimulação in vivo. Neste estudo, o limiar de ativação (aproximadamente em miliamperes) para APs foi muito maior do que o do experimento in vivo (aproximadamente em microamperes)15; isso ocorreu porque a capacidade de volume da solução de ACSF na câmara de registro era muito maior do que a do líquido cefalorraquidiano no estado natural, e a teoria matemática sustenta que o campo elétrico atenua mais rapidamente em materiais de alta condutividade22. Portanto, a maior parte da corrente foi absorvida pela solução de banho, e especulamos que apenas uma pequena porção do campo elétrico pode difundir-se para as raízes nervosas.

Portanto, considerando as vantagens e desvantagens da estimulação in vivo e in vitro , pode-se concluir que o patch-clamp in vitro é um método vantajoso para estudar a natureza sináptica e/ou os efeitos celulares da SCS em roedores neonatais.

Na prática clínica, o eletrodo não contrai diretamente a superfície da medula espinhal ou a raiz nervosa23. Em vez disso, depende da radiação de campo elétrico gerada pelo eletrodo para afetar indiretamente a atividade dos nervos1. Múltiplos estudos 1,23,24 confirmaram que o contato catódico do SCS deve ser colocado o mais próximo possível da raiz dorsal ou da zona de entrada (EDRED) para atingir a seletividade ideal para estimular um músculo específico. O aumento da distância entre o eletrodo e a raiz nervosa enfraquecerá a especificidade da estimulação. Portanto, colocamos diretamente o cátodo perto do DREZ em vez de entrar em contato diretamente com a raiz nervosa ou a medula espinhal.

As fibras aferentes da raiz dorsal projetam-se primeiro para os neurônios sensoriais, depois para os interneurônios e os neurônios motores. Além dos circuitos de projeção transversal, existem também circuitos que se projetam em direção à extremidade rostral e caudal. Por exemplo, neurônios motores correspondentes ao músculo tibial anterior podem ser encontrados em múltiplos níveis25. Portanto, embora a preparação oblíqua possa romper os circuitos de projeção transversal, ela ainda preservará fibras projetantes não transversais, permitindo o estudo do circuito sensorial pré-motor. Além do preparo oblíquo e transversal, o preparo longitudinal oferece vantagens distintas para melhor preservar os circuitos desde a raiz dorsal até os neurônios motores e possibilitar a retenção efetiva dos circuitos medulares em múltiplos segmentos26, o que proporciona uma representação mais próxima das reais condições fisiológicas.

De acordo com a pesquisa de simulação 6,27,28, a SCS ativa principalmente fibras aferentes proprioceptivas para restaurar o movimento dos membros inferiores, incluindo as fibras aferentes Ia, Ib e II. No entanto, neste estudo, não podemos confirmar com segurança quais tipos de fibras foram especificamente ativados pelo SCS. Especulamos que um padrão semelhante também possa existir no patch clamp in vitro. Abordaremos essa questão conduzindo modelagem matemática e simulação e incorporando-a em nosso trabalho em andamento.

Em conclusão, este protocolo pode ajudar os pesquisadores a melhorar suas habilidades operatórias e compreender os fundamentos da combinação de gravações patch-clamp e SCS para investigar o mecanismo elétrico da SCS em uma escala de célula única.

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Disclosures

Nenhum

Acknowledgments

Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China para Jovens Acadêmicos (52207254 e 82301657) e pelo Fundo de Ciência de Pós-doutorado da China (2022M711833).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Ascorbic Acid Sigma A4034
CaCl2·2H2O Sigma C5080
Choline Chloride Sigma C7527
Cover slide tweezers VETUS 36A-SA Clip a slice
D-Glucose Sigma G8270
EGTA Sigma E4378
Fine scissors RWD Life Science S12006-10 Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source Olympus  U-HGLGPS
Fluoro-Gold Fluorochrome Fluorochrome Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877
HEPES Sigma H3375
infrared CCD camera Dage-MTI IR-1000E
KCl Sigma P5405
K-gluconate Sigma P1847
Low melting point agarose Sigma A9414
MgSO4·7H2O Sigma M2773
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-200
Micropipette puller Sutter instrument P1000
Micro-scissors  Jinzhong wa1020 Laminectomy
Microscope for anatomy Olympus  SZX10
Microscope for ecletrophysiology Olympus  BX51WI
Micro-toothed tweezers RWD Life Science F11008-09 Lift the cut vertebral body
NaCl Sigma S5886
NaH2PO4 Sigma S8282
NaHCO3 Sigma V900182
Na-Phosphocreatine Sigma P7936
Objective lens for ecletrophysiology Olympus  LUMPLFLN60XW working distance 2 mm 
Osmometer  Advanced  FISKE 210
Patch-clamp amplifier  Axon  Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer Axon  Digidata 1550B
pH meter  Mettler Toledo  FE28
Slice Anchor Multichannel system SHD-27H
Spinal cord stimulatior PINS T901
Toothed tweezer RWD Life Science F13030-10 Lift the xiphoid
Vibratome Leica VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter Olympus  U-MF2

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References

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Ex Vivo Preparação Corte da Medula Espinhal Gravação de Patch-clamp de Células Inteiras Neurônios Motores Estimulação da Medula Espinhal Função Locomotora Lesão Medular Respostas Elétricas Comportamentos Sensório-Motores Características do Estímulo Respostas Celulares Método Patch-clamp Características Eletrofisiológicas Viabilidade Celular Separação da Medula Espinhal Estrutura Óssea Potenciais de Ação Protocolo Resolução Espaço-Temporal Mecanismo Elétrico
A <em>Preparação Ex Vivo</em> do Corte da Medula Espinhal para o Registro de Patch-Clamp de Células Inteiras em Neurônios Motores Durante a Estimulação da Medula Espinhal
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Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L.… More

Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L. The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation. J. Vis. Exp. (199), e65385, doi:10.3791/65385 (2023).

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