Summary
Detta protokoll beskriver en metod som använder en patch-clamp för att studera de motoriska nervcellernas elektriska svar på ryggmärgsstimulering (SCS) med hög spatiotemporal upplösning, vilket kan hjälpa forskare att förbättra sina färdigheter i att separera ryggmärgen och upprätthålla cellviabilitet samtidigt.
Abstract
Ryggmärgsstimulering (SCS) kan effektivt återställa rörelsefunktionen efter ryggmärgsskada. Eftersom de motoriska nervcellerna är den sista enheten för att utföra sensomotoriska beteenden, kan direkta studier av de elektriska svaren hos motorneuroner med SCS hjälpa oss att förstå den underliggande logiken för ryggradsmotorisk modulering. För att samtidigt registrera olika stimulusegenskaper och cellulära svar är en patch-clamp en bra metod för att studera de elektrofysiologiska egenskaperna på encellsskala. Det finns dock fortfarande några komplexa svårigheter för att uppnå detta mål, inklusive att upprätthålla cellviabiliteten, snabbt separera ryggmärgen från den beniga strukturen och använda SCS för att framgångsrikt inducera aktionspotentialer. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll med hjälp av patch-clamp för att studera de elektriska svaren hos motorneuroner på SCS med hög spatiotemporal upplösning, vilket kan hjälpa forskare att förbättra sina färdigheter i att separera ryggmärgen och upprätthålla cellviabiliteten samtidigt som de smidigt studerar den elektriska mekanismen för SCS på motorneuron och undviker onödiga försök och misstag.
Introduction
Ryggmärgsstimulering (SCS) kan effektivt återställa rörelsefunktionen efter ryggmärgsskada. Andreas Rowald et al. rapporterade att SCS möjliggör rörelse- och bålfunktion i nedre extremiteter inom en enda dag1. Att utforska den biologiska mekanismen för SCS för motorisk återhämtning är ett kritiskt och trendigt forskningsområde för att utveckla en mer exakt SCS-strategi. Till exempel visade Grégoire Courtines team att excitatoriska Vsx2-interneuron och Hoxa10-neuroner i ryggmärgen är de viktigaste neuronerna för att svara på SCS, och cellspecifik neuromodulering är möjlig för att återställa råttans gångförmåga efter SCI2. Få studier fokuserar dock på den elektriska mekanismen för SCS på encellsskala. Även om det är välkänt att supratröskeln likströmsstimulus kan framkalla aktionspotentialerna (AP) i det klassiska bläckfiskexperimentet 3,4,5, är det fortfarande oklart hur den pulserande växelströmsstimuleringen, såsom SCS, påverkar motorsignalgenereringen.
Med tanke på komplexiteten hos intraspinala neurala kretsar är lämpligt urval för cellpopulationen viktigt för att undersöka den elektriska mekanismen för SCS. Även om SCS återställer motorisk funktion genom att aktivera den proprioceptiva vägen6, är de motoriska nervcellerna den slutliga enheten för att utföra det motoriska kommandot, härlett från att integrera proprioceptionsinformation afferent input7. Att direkt studera de elektriska egenskaperna hos motorneuroner med SCS kan därför hjälpa oss att förstå den underliggande logiken för spinal motorisk modulering.
Som vi vet är patch-clamp den gyllene standardmetoden för cellulärt elektrofysiologisk inspelning med extremt hög spatiotemporal upplösning8. Därför beskriver denna studie en metod som använder en patch clamp för att studera de elektriska svaren hos motorneuroner på SCS. Jämfört med hjärnklämma9 är ryggmärgsklämman svårare på grund av följande skäl: (1) Ryggmärgen skyddas av kotkanalen med liten volym, vilket kräver mycket fin mikromanipulation och rigoröst iskallt underhåll för att få bättre cellviabilitet. (2) Eftersom ryggmärgen är för smal för att fästas på skärbrickan, bör den nedsänkas i agaros med låg smältpunkt och trimmas efter stelning.
Därför ger denna metod tekniska detaljer för att dissekera ryggmärgen och samtidigt upprätthålla cellviabiliteten för att smidigt studera den elektriska mekanismen för SCS på motorneuroner och undvika onödiga försök och misstag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Animal Care and Use Committee godkände alla djurförsök och studierna utfördes i enlighet med gällande djurskyddsbestämmelser.
1. Förberedelse av djur
- Djur
- Boendeinformation: Hushanar av Sprague-Dawley-råttor (postnatala 10-14 dagar, P10-P14) i en specifik patogenfri miljö.
OBS: Rumsförhållandena bibehölls vid 20 °C ± 2 °C, luftfuktighet: 50%-60%, med en 12-timmars ljus/mörk cykel. Djuren hade fri tillgång till mat och vatten. - Märk motorneuronerna retrogradt: Injicera Fluoro-Gold (FG) i den bilaterala tibialis anterior- och gastrocnemius-muskeln (2 % i steril koksaltlösning, 50 μL per muskel) för att retrogradt märka de motoriska nervcellerna 2 dagar före offret.
- Boendeinformation: Hushanar av Sprague-Dawley-råttor (postnatala 10-14 dagar, P10-P14) i en specifik patogenfri miljö.
- Lösningar
- Förbered skärlösning: Blanda 120 mM kolinklorid, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1,25 mM NaH 2 PO4, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl2, 1,3 mM askorbinsyra, 15 mM glukos. Förbubbla lösningen med 95 %O2 och 5 % CO2 (justera till pH 7,4 med KOH) i 30 minuter före dissektion och skivning. Kyl lösningen med krossad is.
- Förbered konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF): Blanda 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4; 1,3 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 och 10 mM glukos. Förbubbla lösningen med 95 %O2 och 5 % CO2 i 30 minuter före inkubationen.
- Förbered intracellulär lösning: Blanda 126 mM K-glukonat, 2 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na2GTP, 10mM K-fosfokreatin och 0,5 % neurobiotin (pH 7,25 och 305 mOsm/kg). Kyl lösningen med krossad is.
- Förbered lågsmältande agarosgel: Lös upp 4 g agaros i 100 ml skärlösning och använd en magnetisk omrörarrotor för att lösa upp den helt. Värm agarosen med låg smältpunkt i mikrovågsugnen med hög effekt i 1 minut 30 minuter före inbäddning och överför den sedan till ett 39 °C vattenbad för att bibehålla flytande tillstånd.
- Förberedelse av instrument
- Lägg krossad is på perfusionsbrickan (tilläggsfigur 1A) 10 minuter före perfusion. Placera den anatomiska brickan (kompletterande figur 1B) och skärbrickan (kompletterande figur 1C) med ett vattenband vid -80 °C över natten i förväg.
- Placera inkubationskammaren med nylonnät i ugnen vid 45 °C över natten i förväg.
- Använd agaros med låg smältpunkt för att prefabricera en 35° lutning och en 2 mm tjock plattform (tilläggsfigur 1D). Efter gelstelning, placera dem i mitten av en 35 mm petriskål för att stödja ryggmärgen i nästa kommande procedurer.
- Intrakardiell perfusion
- Bedöva råttorna med 2,5 % tribrometanol (160 μL/10 g) via intraperitoneal injektion. Se till att råttorna är helt bedövade genom att verifiera bristen på svar på yttre stimuli, till exempel ett försiktigt nyp i tån.
- När den korrekta bedövningen har bekräftats, placera råttorna på rygg och immobilisera dem i petriskålen fylld med kiselgel.
- Skär ett 5 mm längsgående hudsnitt kaudalt till xiphoid-processen och expandera sedan det subkutana utrymmet helt. Skär ett 2 cm längsgående hudsnitt längs den ventrala mittlinjen för att helt exponera den yttre bröstväggen, börja med det ovan nämnda snittet och sluta med toppen av bröstet.
- Använd en tandad pincett för att lyfta xiphoiden (tilläggsfigur 2A) och använd sedan en fin sax för att klippa membranet. Skär bröstbenet längs båda sidor av xiphoid-processen för att öppna bröstkorgen och exponera hjärtat (tilläggsfigur 2B).
OBS: Var noga med att bevara de inre bröstkorgskärlen på båda sidor; annars kan det orsaka massiv blödning. - Använd en tandlös pincett för att lyfta vänster kammare. Stick in en 22 G nål i vänster kammares apex längs vänster kammares längsgående axel (tilläggsfigur 2C). Observera under tiden den rytmiska blodpulseringen i perfusionsröret, annars kan nålen punkteras i höger kammare, vilket kan leda till en dålig perfusionseffekt.
OBS: Tandad pincett ska inte användas; Annars kan det orsaka extra blodläckage från pincetthållplatsen. - Använd en fin sax för att klippa höger förmak (tilläggsfigur 2C) och injicera sedan manuellt 100 ml iskall perfusionsvätska med en hastighet av cirka 2 ml/s inom 1 minut.
OBS: När råttornas lever och tassar blir bleka och inget blod rinner ut från höger förmak kan god perfusion uppnås.
- Dissektion av ryggmärgen (figur 1)
- Placera råttan i bukläge och skär av ryggraden vid främre övre höftbensryggraden (ungefär L4-ryggradsnivå) respektive bröstkorgens krökningsförskjutningspunkt (ungefär T6-ryggradsnivå) (figur 1A). Placera sedan omedelbart den isolerade ryggraden i den syresatta iskalla perfusionslösningen för att tvätta bort kvarvarande blod och fettvävnad; Denna procedur är fördelaktig för att hålla operationsområdet rent i de efterföljande procedurerna.
OBS: De paraspinala musklerna bör reserveras, vilket bidrar till den efterföljande fixeringen av ryggraden med hjälp av en insektsnål. - Överför omedelbart den isolerade ryggraden till den anatomiska brickan (Figur 1B) med ryggsidan uppåt och den rostrala änden nära operatören. Fyll det anatomiska tråget med 50 ml kontinuerligt syresatt iskalla skärmedel (Figur 1B).
- Använd fyra insektsnålar för att fixera ryggraden genom att penetrera paraspinalmusklerna (Figur 1B).
- Under dissektionsmikroskopet skär du kotpediklarna på båda sidor från rostraländen med mikrosaxen, som kan kallas "laminektomi" (Figur 1C). Var uppmärksam på att inte skada ryggmärgen. Använd under tiden den mikrotandade pincetten för att lyfta den skurna kotkroppen.
- Efter laminektomin ska du inte omedelbart separera ryggmärgen från ryggmärgskanalen. Använd istället en mikrosax för att klippa dura mater längs den dorsala mittlinjen, vilket bidrar till näringsupptag mellan celler och syresatt ACSF (Figur 1D).
OBS: Riv aldrig sönder dura mater. Endast att klippa dura mater med mikrosax är tillåtet; Annars kommer nervroten och spinalparenkymet att skadas allvarligt! - Lyft den rostrala delen av ryggmärgen och skär sedan försiktigt av nervroten med cirka 1 mm reserverad (Figur 1E). Efter att ha separerat ryggmärgen från kotkanalen, använd 2 insektsstift för att fixera ryggmärgen med den ventrala sidan uppåt (Figur 1F).
- Använd en mikrosax för att klippa dura mater längs den ventrala mittlinjen (Figur 1F). Skär av de överflödiga nervrötterna med ca 1 mm reserverat.
OBS: Nerven är mycket mer ihärdig än ryggmärgen. Om den reserverade nervroten är för lång (>1 mm) kan vibratomet inte skära av nervroten, vilket kan leda till en allvarlig bristning i spinalparenkymet. - Använd en mikrosax för att separera ländryggsförstoringen till en längd av 6-7 mm (Figur 1G).
- Placera råttan i bukläge och skär av ryggraden vid främre övre höftbensryggraden (ungefär L4-ryggradsnivå) respektive bröstkorgens krökningsförskjutningspunkt (ungefär T6-ryggradsnivå) (figur 1A). Placera sedan omedelbart den isolerade ryggraden i den syresatta iskalla perfusionslösningen för att tvätta bort kvarvarande blod och fettvävnad; Denna procedur är fördelaktig för att hålla operationsområdet rent i de efterföljande procedurerna.
- Inbäddning i den lågsmältande agarosen
- Placera ländryggsförstoringen på 35 ° lutning (Figur 1H) med ryggsidan uppåt och stjärtänden nedåt. Använd ett absorberande filterpapper för att avlägsna rikligt med vatten på vävnadsytan (Figur 1H).
- Häll långsamt den smälta agarosgelen i petriskålen som innehåller ländryggsförstoringen (Figur 1I).
OBS: Häll inte för snabbt, annars kommer bubblor att samlas i gelen. - Placera ovanstående petriskål i isvattenblandningen för att kyla gelen så snart som möjligt, vilket bidrar till att upprätthålla cellernas aktivitet.
- Trimma gelén till en kub på 15 mm x 10 mm x 10 mm och montera den på provskivan med superlim (Figur 1J).
- Skivning
- Placera provskivan i den förfrysta skärbrickan och häll sedan den iskalla skärlösningen (Figur 1K). Bubbla kontinuerligt med 95 % CO2 och 5 % O2 i skärbrickan.
- Ställ in vibratomparametrarna: tjocklek: 350 μm; hastighet: 0,14-0,16 mm/s, amplitud: 1,0 mm och vibrationsfrekvens: 85 Hz.
- Skörda 2-3 lämpliga skivor per djur. Registrera 1-2 friska FG+ motorneuroner per skiva, med ett intervall på 5-6 celler per djur.
- Inkubation
- Använd lockpincett för att klippa en skiva (Figur 1L) och placera den i inkubationskammaren fylld med kontinuerligt syresatt ACSF. Placera inkubationskammaren i ett vattenbad vid 32 °C i 30 minuter och fortsätt sedan att inkubera den i rumstemperatur (RT) i ytterligare 30 minuter före registreringen.
OBS: Ovanstående procedurer, från anestesi till att få den första skivan, bör slutföras inom 20-30 minuter för att behålla cellernas livskraft så mycket som möjligt. De motoriska nervcellerna i varje skiva kan behålla sin livskraft i cirka 6-7 timmar.
- Använd lockpincett för att klippa en skiva (Figur 1L) och placera den i inkubationskammaren fylld med kontinuerligt syresatt ACSF. Placera inkubationskammaren i ett vattenbad vid 32 °C i 30 minuter och fortsätt sedan att inkubera den i rumstemperatur (RT) i ytterligare 30 minuter före registreringen.
2. Patch-clamp-inspelning med SCS (figur 2)
- Förberedelser
- Perfusionera inspelningskammaren med kontinuerligt bubblad ACSF med en hastighet av cirka 1-2 ml/min. Ställ in flödet individuellt via manöverpanelen på den peristaltiska pumpen.
- Placera en skiva i inspelningskammaren. Använd den U-formade platinatråden med nylontrådar för att stabilisera skivan ordentligt på plats.
- Använd ett infrarött differentialinterferenskontrastmikroskop (IR-DIC) för att observera skivan. Under den 4x objektivlinsen, kontrollera att längden på ryggroten är cirka 1 mm. Hitta området där dorsalroten går in i parenkymet och flytta sedan det centrala synfältet till detta område.
- Anslut pulsgeneratorn med specialtillverkade elektroder (Figur 2A).
- SCS-konfiguration
- Placera anoden på SCS nära den dorsala mittlinjen via mikromanipulationssystemet (figur 2B).
- Placera katoden av SCS nära dorsalrotens ingångszon (DREZ) via mikromanipulationssystemet (figur 2B).
- Cellinriktning och avbildning
- Använd IR-DIC med en 10x objektivlins för att ungefär hitta den dorsolaterala regionen av den motoriska pelaren, där de flesta motorneuroner finns. Flytta sedan det centrala synfältet till detta område.
- Byt till en 60x objektivlins för att hitta en frisk neuron med en slät och ljus yta och osynliga kärnor (Figur 2C,F).
- Sänk IR-intensiteten något och slå på fluorescensljuskällan. Byt ljusfiltret till det ultravioletta excitationsfiltret med brett band (Figur 2D,G) för att välja en lämplig FG-positiv (FG+) motorneuron (Figur 2E,H).
- Använd sugelektroder för att applicera 1x motorisk tröskelstimulering på ryggroten. Om en framkallad aktionspotential detekteras i de motoriska nervcellerna (tilläggsfigur 3) bekräftar det att dorsalrotens aktivitet är intakt. Om inte, bör den här skivan kasseras.
- Inspelning med klämklämma
- Fyll mikropipetten med den intracellulära lösningen och sätt in den i elektrodhållaren. Använd mikromanipulationssystemet för att sänka pipetten i ACSF-badet. Pipettresistansen sträcker sig från 5-8 MΩ.
- Applicera en liten mängd positivt tryck på pipetten för att blåsa bort damm och cellskräp.
- Sänk elektroden för att närma dig cellen. När pipetten vidrör ytan av FG+-neuronen blir en liten fördjupning av membranet synlig i nivå med spetsen. Släpp det positiva trycket.
- Applicera sedan en liten mängd undertryck på pipetten med hjälp av en spruta. Detta skapar en liten mängd sug som drar cellmembranet i kontakt med glaspipetten. Var alltid uppmärksam på det totala motståndet på programvarugränssnittet tills motståndsvärdet ökar till gigaohm (>1 GΩ). Sedan bildas gigasealen.
- Clamp membranpotentialen vid -70 mV och tryck sedan på snabbkapacitanskompensationsknappen på mjukvarugränssnittet för amplifier. Applicera försiktigt ett övergående negativt tryck för att brista cellmembranet och tryck sedan på knappen för kompensation för långsam kapacitans på mjukvarugränssnittet på amplifier. Vid denna tidpunkt erhålls en bra helcellskonfiguration.
- Växla till ström-clamp-läge genom att klicka på IC-knappen på programvarugränssnittet och registrera vilomembranpotentialen (RMP).
- Applicera SCS i 1-2 s med amplituden 1-10 mA, medan pulsbredden och frekvensen är fixerade till 210 μs respektive 40 Hz. Bestäm motortröskeln genom att långsamt öka stimuleringsamplituden tills den första AP observeras.
- Särskilj fördröjda och omedelbart avfyrande motorneuroner med hjälp av en 5 s depolariserande ströminjektion runt rheobas i strömklämläge10,11,12. Motorneuroner med omedelbar avfyrning: Låg reobas kan inducera omedelbar och repetitiv avfyrning med stabil avfyrningsfrekvens; Motorneuroner med fördröjd avfyrning: Hög reobas kan inducera en fördröjd debut för upprepad avfyrning med en accelererande avfyrningshastighet (Figur 3).
- När SCS är avstängt fortsätter du att registrera membranpotentialen för att fånga spontana AP:er som avfyras.
- Utför voltage-clamp-inspelningar voltage-clamp-inspelningar för excitatorisk postsynaptisk ström (EPSC) när SCS är på och av. Stimuleringsparametern är 1x motortröskel, 210 μs, 2 Hz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tack vare det rigorösa underhållet vid låg temperatur under finoperationen (kompletterande figur 1, kompletterande figur 2 och figur 1) var cellviabiliteten tillräckligt god för att utföra efterföljande elektrofysiologiska registreringar. För att simulera det kliniska scenariot så mycket som möjligt använde vi mikromanipulation för att placera SCS-katoden och anoden nära den dorsala mittlinjen respektive DREZ (Figur 2), vilket kunde initiera neural signal i rygghornet för att sprida sig till de motoriska nervcellerna i den dorsolaterala regionen av den motoriska pelaren. I den här studien använde vi FG för att lokalisera motorneuroner med en diameter på 20-50 μm. Som visas i figur 2D,G bekräftade vi med säkerhet en frisk FG+-neuron som en motorneuron - ryggradskretsens terminal. Denna märkningsmetod banade väg för att studera hur SCS påverkar avfyrningsmönstret. De elektrofysiologiska egenskaperna hos motorneuroner med fördröjd och omedelbar avfyrning anges i tilläggstabell 1 och tilläggstabell 2. Metoderna för att beräkna de aktiva och passiva egenskaperna finns i tilläggsfil 1.
När SCS levererade ett pulserande alternerande elektriskt fält till ryggradsskivan använde vi först strömklämläge för att registrera responsen på membranpotentialen (figur 4). När vi gradvis ökade stimuleringsamplituden med ett steg på 1/3 motortröskel (Figur 4B,C), ökade också membranpotentialen med den, men endast 1x motortröskeln kunde framkalla Aps (Figur 4D). Figur 4D visar att ungefär var 10-20:e puls kan framkalla en AP, vilket indikerar att en bestämd AP-svarsregelbundenhet till SCS-amplitud kan finnas.
Efter att SCS stängdes av fortsatte vi att registrera membranpotentialen. Figur 5 visade att membranpotentialen ökade något till -60 mV, och neuronen avfyrade en serie spontana AP. Dessa spontana AP varar under en kort tidsperiod (30-40 s), sedan återgår membranpotentialen till -65 mV, vilket indikerar att SCS tillfälligt kan öka cellens excitabilitet.
Sedan använde vi spänningskläminspelningar för EPSC när SCS var på och av (figur 6). Efter varje SCS-puls kunde en framkallad EPSC detekteras. Latensen mellan stimulusartefakten och EPSC var 2,64 ± 0,38 ms (tilläggsfigur 4). Amplituden för framkallade EPSC var 35,14 ± 12,73 pA (tilläggsfigur 4). Frekvensen av framkallade EPSC överensstämmer med SCS-frekvensen. Efter subtrahering av den passiva laddningsbalanseringen kan den framkallade EPSC observeras i en livskraftig motorneuron efter 1x motorisk tröskelstimulering (tilläggsfigur 5A). Stimuleringspolariteten kastades om efter att perfusionen stoppats i 2 timmar i samma cell. Stimuleringen inducerade inte någon EPSC, vilket bekräftar att den framkallade EPSC inte var en artefakt (tilläggsfigur 5B).
Figur 1: Ryggmärgsdissektion och skivning. (A) Skär av ryggraden vid främre övre höftbensryggraden (ca L4 kotnivå) respektive krökningsförskjutningspunkten för bröstkorgen (ca T6 vertebral nivå). (B) Överför omedelbart den isolerade ryggraden till den anatomiska brickan med ryggsidan uppåt och den rostrala änden nära operatören. Fyll den anatomiska brickan med den kontinuerligt syresatta iskalla skärlösningen. (C) Utför laminektomi på båda sidor från rostraländen. (D) Skär av dorsal dura mater, vilket bidrar till näringsupptag mellan celler och syresatt konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF). (E) Skär försiktigt av nervroten. (F) Skär av ventrala dura mater. g) Separera ländryggsförstoringen till en längd av 6-7 mm. (H) Placera ländryggsförstoringen på 35° lutningen med ryggsidan uppåt och stjärtänden nedåt. Använd ett absorberande filterpapper för att ta bort rikligt med vatten på vävnadsytan. (I) Häll långsamt den smälta agarosgelen i petriskålen. (J) Trimma gelen till en kub och montera den på provskivan med superlim. (K) Placera provskivan i skärbrickan och häll sedan den iskalla skärlösningen. (L) Ett exempel på en ryggradsskiva vid ländryggsförstoring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Konfiguration av ryggmärgsstimulering (SCS) och avbildning av motorneuroner. (A) Pulsgeneratorn med specialtillverkade elektroder kan separat justera amplitud, pulsbredd och frekvens. Inlet visade att dimensionsspecifikationen för en elektrodkontakt är 800 μm x 500 μm x 300 μm. (B) Placera anoden och katoden nära dorsala mittlinjen respektive dorsalrotens ingångszon (DREZ) via mikromanipulationssystemet. Placera registreringspipetten vid den dorsolaterala regionen av motorpelaren för att klämma fast de fluorguldpositiva (FG+) motorneuronerna. (C) En frisk motorneuron med infrarött differentialinterferenskontrastmikroskop (IR-DIC) avbildning (60x). (D) Samma neuron med endast fluorescensavbildning (60x), glänsande fluorguldpartiklar (FG) representerar att denna neuron är en motorneuron. (E) Sammanslagen bild av IR-DIC och fluorescens i FG+ motorneuron. (F-H) En frisk fördröjd avfyrning av motorneuron med IR-DIC-avbildning (60x). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Särskilj fördröjda och omedelbart avfyrande motorneuroner med hjälp av en 5 s depolariserande ströminjektion. (A) Motorneuroner med omedelbar avfyrning: Låg reobas kan inducera omedelbar och upprepad avfyrning med stabil avfyrningsfrekvens; (B) Motorneuroner med fördröjd avfyrning: Hög reobas kan inducera en fördröjd start för upprepad avfyrning med en accelererande avfyrningshastighet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Ryggmärgsstimulering (SCS) framkallade aktionspotentialer (AP) som avfyras i motorneuroner . (A) När ingen stimulering tillämpades var vilomembranpotentialen (RMP) -65 mV. (B) 1/3x motortröskelstimulus kan inte framkalla AP. (C) 2/3x motortröskelstimulus kan inte framkalla AP. (D) 1x motorisk tröskelstimulus kan framkalla AP, och var 10-20:e puls kan framkalla en AP. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Spontana aktionspotentialer (AP) som aktiveras efter ryggmärgsstimulering (SCS). Efter att SCS stängts av avfyrade neuronen en serie spontana AP under en kort tidsperiod (30-40 s), sedan återgick vilomembranpotentialen (RMP) till -65 mV. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Illustration av parametern för ryggmärgsstimulering (SCS) och framkallad excitatorisk postsynaptisk ström (EPSC). (A) Illustration av SCS-parameter; (B,C) Efter en enda stimuleringspuls (1x motortröskelstimulering) kan den framkallade EPSC observeras; (D) Efter att ha subtraherat den passiva laddningsbalanseringen kan EPSC:s latens och amplitud beräknas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Förberedelse av instrumentet. (A) Perfusionsform: 10 minuter före perfusionen, lägg krossad is på den 10 cm långa petriskålen fylld med kiselgel. (B) Anatomisk bricka: Placera den egentillverkade anatomiska brickan fylld med kiselgel i kylskåpet -80 °C kvällen före avoffrandet. (C) Skärbricka: Placera skärbrickan med vattenband i kylskåpet -80 °C kvällen före offrandet. (D) Agarosgjutningslutning: 30 minuter före perfusionen, placera en 35° agarossluttning med bottenplattor i mitten av en 35 mm petriskål. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfigur 2: Intrakardiell perfusion. (A) Lyft xiphoidprocessen. (B) Skär bröstbenet längs båda sidor av xiphoid-processen för att öppna bröstkorgen och exponera hjärtat. Var försiktig så att du inte skadar de inre bröstkorgskärlen, annars kommer massiv blödning att fylla hela operationsfältet och hindra operatören från att identifiera ventrikelns apex eller höger förmak. (C) Stick in en 22 G nål vid vänster kammares spets för perfusion och skär av höger förmak för vätskeutlopp. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Bekräfta dorsalrotsaktiviteten. Använd sugelektroder för att applicera 1x motorisk tröskelstimulering på ryggroten. Om en framkallad aktionspotential detekteras i de motoriska nervcellerna kan vi bekräfta att aktiviteten hos ryggroten är intakt. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 4: Latens och amplitud för framkallade EPSC:er när SCS var på. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 5: Påvisande av giltigheten av den åberopade EPSC. (A) Efter 1x motorisk tröskelstimulering efter subtrahering av den passiva laddningsbalanseringen kan den framkallade EPSC observeras i en livskraftig motorneuron; (B) Efter att ha stoppat perfusionen i 2 timmar i samma cell var stimuleringspolariteten omvänd, 1x motortröskelstimulering inducerade ingen EPSC, vilket bekräftade att den framkallade EPSC inte var en artefakt. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletteringsfil 1: Beräkningsmetoder för de aktiva och passiva egenskaperna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 1: Passiva egenskaper hos motorneuroner. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 2: Aktiva egenskaper hos motorneuroner Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rörelseinformationen som moduleras av SCS konvergerar slutligen till de motoriska nervcellerna. Att ta de motoriska nervcellerna som forskningsmål kan därför förenkla studiedesignen och avslöja neuromoduleringsmekanismen för SCS mer direkt. För att samtidigt registrera olika stimulusegenskaper och cellulära svar är en patch-clamp en bra metod för att studera de elektrofysiologiska egenskaperna på encellsskala. Det finns dock fortfarande vissa svårigheter, bland annat hur man upprätthåller cellviabiliteten, hur man snabbt separerar ryggmärgen från den beniga strukturen och hur man använder SCS för att inducera AP framgångsrikt. Därför syftar denna studie till att hjälpa forskare att snabbt förstå viktiga operativa färdigheter, undvika några möjliga fallgropar och fokusera på studiedesignen snarare än metodiken så tidigt som möjligt.
För att få god cellviabilitet bör man alltid vara uppmärksam på följande detaljer: (1) Att hålla ryggmärgen vid iskall temperatur är mycket viktigt eftersom låg temperatur kan hämma celldöd och sakta ner ämnesomsättningen, vilket kan skydda neuronen från mekanisk skada under perfusion, dissektion och skivning13; (2) Att försiktigt ta bort dura mater med mikrosax kan förbättra det neuronala näringsupptaget från omgivande lösningar. Dra aldrig av dura mater direkt; Annars kommer ryggmärgen att skadas allvarligt. Dessutom, om du glömmer att rensa dura mater, kan den efterföljande skivningsprocessen vara svår eftersom bladet kanske inte helt skär av dura mater och sedan sliter ut den återstående ryggmärgen från agaros, vilket kan leda till att skivningen misslyckas. (3) Jämfört med konventionella tvärgående skivor ökar sneda skivor arean av grå substans, och du kan hitta fler FG+ motorneuroner i en enda skiva9. (4) Eftersom ryggmärgen ensam inte kan fixeras ordentligt på provskivan som hjärnan, är inbäddning av den i agarosgel effektivt för att lösa detta problem utan att minska cellviabiliteten. Vi rekommenderar att du använder agaros med låg smältpunkt (gelpunkt 26-30 °C) snarare än konventionell agaros (gelpunkt 38-43 °C), eftersom hög temperatur kan skada cellviabiliteten. (5) Vi rekommenderar att avståndet mellan två nylontrådar av U-formad platinatråd bör vara 1 till 1.5 mm eftersom lösa trådar inte kan immobilisera ryggmärgen ordentligt och täta trådar kan klämma cellen.
Jämfört med de konventionella stimuleringsanordningarna, såsom bipolära krokelektroder som ofta används inom grundforskning, är SCS-elektroden i denna studie härledd från vårt tidigare kliniska arbete14 och grundforskning15. SCS levererar pulserande alternerande elektrisk stimulering, vilket ger olika parameterjusteringsdimensioner. Denna SCS-enhet har också en laddningsbalansfunktion för att undvika vävnadselektrolys och kommer inte i direkt kontakt med nervvävnaden; därför har detta SCS god säkerhet för in vivo-applikationer .
Efter SCS-behandling kan de spontana AP av motorneuroner hänföras till följande orsaker: (1) SCS inducerar laddningen att ackumuleras i cellkroppen och axonal colliculus av neuroner, vilket leder till en ökning av RMP16. Detta fenomen indikerar att SCS kan förbättra neuronens excitabilitet, vilket kan vara relaterat till förändringen av konduktiviteten hos jonkanaler efter SCS, såsom Na v 1.117, K v 2.1 18 eller Ca v 2.3 19. (2) SCS kan aktivera dorsala GABAerga neuroner för att underlätta proprioceptiv återkoppling till motoriska nervceller. Vi föreslår att neural överföring kan finnas kontinuerligt mellan de sensoriska neuronerna och motorneuronerna, vilket leder till spontana APs i motorneuroner efter SCS. Spontana AP kan upprätthålla ett inneboende tillstånd av beredskap för att utföra sensomotoriska beteenden20. Därför kan aktivering eller hämning av spontana AP vara fördelaktigt för behandling av neurologiska sjukdomar i ryggraden.
Som vi vet är elektrofysiologisk registrering in vivo bättre för att detektera elektrofysiologisk respons under den naturliga fördelningen av det elektriska fältet och placeringen av elektroder. Dessutom möjliggör in vivo motoneuroninspelningar identifiering av motoneuronidentitet. Detta kan göras genom antidromisk identifiering av motoriska axoner i kombination med mätning av muskelfiberkraft21. Men in vivo ryggmärgsinspelningar har också följande nackdelar: (1) Motorneuron ligger 2-3 mm från ryggmärgens dorsala yta, även med den mest avancerade tvåfotonkonfokalavbildningen är observationsdjupet bara 500-800 μm, så det är svårt att optiskt observera dem in vivo med de befintliga metoderna. Därför, om vi vill klämma exakt en enda motorneuron in vivo, måste glaspipetten passera genom den dorsala pelaren för att nå den osynliga motorneuronen; In vivo patch-clamp kan endast utföras på ett "blint" sätt, vilket resulterar i betydande osäkerhet och felfrekvens. (2) Med undantag för patchklämman in vivo kan kiselelektrodinspelningar vara den alternativa metoden, t.ex. Utah-matris eller Neuropixels-elektrod. Signalerna som registreras av kiselelektroder är dock mestadels sammansatta aktionspotential snarare än enkelverkande potential. Även om aktiviteten hos enskilda neuroner har lösts med hjälp av spiksorteringsalgoritmer, måste noggrannheten och tillförlitligheten hos sorteringsalgoritmerna fortfarande förbättras.
Jämfört med in vivo-inspelningar är den största fördelen med in vitro mot in vivo användningen av spänningsklämma, vilket möjliggör en unik förståelse av de synaptiska vägar som aktiveras av SCS. Dessutom skulle det också göra det möjligt att använda verktyg för bildåtergivning i realtid. Vi spekulerar i att SCS inducerar frisättning av neurotransmittorer som GABA och glutamat från neuroner på övre nivå på de motoriska nervcellerna, vilket resulterar i ett övergripande excitatoriskt EPSC-svar7. Därför kommer vi i vår kommande forskning att införliva detektion av IPSC, mini EPSC (mEPSC) och framkallad EPSC inducerad av SCS för att klargöra mönstren för hämmande och excitatorisk frisättning av neurotransmittorer från pre-motoriska neuroner eller interneuroner. Vi är fullt medvetna om att in vitro-stimulering också har vissa begränsningar: (1) Långväga längsgående kretsar i ryggmärgen störs, vilket resulterar i förlust av inkommande information från den motoriska cortex eller nedre extremiteten; (2) Fördelningen av elektriska fält under in vitro-stimulering kan skilja sig från den vid in vivo-stimulering. I denna studie var aktiveringströskeln (ungefär i milliampere) för AP mycket högre än för in vivo-experimentet (ungefär i mikroampere)15; Detta berodde på att volymkapaciteten hos ACSF-lösningen i inspelningskammaren var mycket högre än cerebrospinalvätskan i naturligt tillstånd, och matematisk teori stöder att elektriska fält dämpas snabbare i material med hög ledningsförmåga22. Därför absorberades det mesta av strömmen av badlösningen, och vi spekulerar i att endast en liten del av det elektriska fältet kan diffundera till nervrötterna.
Därför, med tanke på för- och nackdelarna med in vivo-stimulering och in vitro-stimulering, kan man dra slutsatsen att in vitro patch-clamp är en fördelaktig metod för att studera den synaptiska karaktären och/eller cellulära effekterna av SCS hos neonatala gnagare.
I klinisk praxis drar elektroden inte direkt ihop ryggmärgens yta eller nervroten23. Istället förlitar den sig på den elektriska fältstrålningen som genereras av elektroden för att indirekt påverka nervernas aktivitet1. Flera studier 1,23,24 har bekräftat att katodkontakten för SCS bör placeras så nära ryggroten eller ingångszonen (DREZ) som möjligt för att uppnå optimal selektivitet för att stimulera en specifik muskel. Att öka avståndet mellan elektroden och nervroten kommer att försvaga stimuleringens specificitet. Därför placerar vi katoden direkt nära DREZ i stället för att direkt kontakta nervroten eller ryggmärgen.
De afferenta fibrerna i ryggroten projicerar först till de sensoriska neuronerna, sedan till interneuronerna och de motoriska neuronerna. Förutom de tvärgående utskjutande kretsarna finns det också kretsar som skjuter ut mot rostrala och kaudala änden. Till exempel kan motorneuroner som motsvarar tibialis anterior-muskeln hittas på flera nivåer25. Därför, även om sned beredning kan skära av de tvärgående utskjutande kretsarna, kommer det fortfarande att bevara icke-tvärgående utskjutande fibrer, vilket möjliggör studier av de pre-motoriska sensoriska kretsarna. Förutom sned och tvärgående preparering erbjuder longitudinell preparering tydliga fördelar för att bättre bevara kretsarna från ryggroten till motorneuronerna och möjliggöra effektiv retention av ryggmärgskretsar över flera segment26, vilket ger en närmare representation av de verkliga fysiologiska förhållandena.
Enligt simuleringsforskningen 6,27,28 aktiverar SCS huvudsakligen proprioceptiva afferenta fibrer för att återställa rörelsen i nedre extremiteterna, inklusive de afferenta fibrerna Ia, Ib och II. I denna studie kan vi dock inte med säkerhet bekräfta vilka typer av fiber som specifikt aktiverades av SCS. Vi spekulerar i att ett liknande mönster också kan finnas i in vitro patch clamp. Vi kommer att ta itu med denna fråga genom att genomföra matematisk modellering och simulering och införliva det i vårt pågående arbete.
Sammanfattningsvis kan detta protokoll hjälpa forskare att förbättra sina operativa färdigheter och förstå det väsentliga i att kombinera patch-clamp-inspelningar och SCS för att undersöka den elektriska mekanismen för SCS på encellsskala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Denna studie finansierades av National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 och 82301657) och China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
