Summary
Denne protokollen beskriver en metode som bruker en patch-klemme for å studere de elektriske responsene til motorneuroner til ryggmargsstimulering (SCS) med høy spatiotemporal oppløsning, noe som kan hjelpe forskere med å forbedre sine ferdigheter i å skille ryggmargen og opprettholde cellens levedyktighet samtidig.
Abstract
Ryggmargsstimulering (SCS) kan effektivt gjenopprette lokomotorisk funksjon etter ryggmargsskade (SCI). Fordi motorneuronene er den endelige enheten for å utføre sensorimotorisk oppførsel, kan direkte studier av elektriske responser av motorneuroner med SCS hjelpe oss å forstå den underliggende logikken i spinalmotormodulasjon. For samtidig å registrere ulike stimulusegenskaper og cellulære responser, er en patch-klemme en god metode for å studere de elektrofysiologiske egenskapene på en enkeltcelleskala. Imidlertid er det fortsatt noen komplekse vanskeligheter med å nå dette målet, inkludert å opprettholde cellens levedyktighet, raskt skille ryggmargen fra den benete strukturen og bruke SCS for å lykkes med å indusere handlingspotensialer. Her presenterer vi en detaljert protokoll ved hjelp av patch-klemme for å studere de elektriske responsene til motorneuroner til SCS med høy spatiotemporal oppløsning, noe som kan hjelpe forskeren til å forbedre sine ferdigheter i å skille ryggmargen og opprettholde cellens levedyktighet samtidig for å jevnt studere den elektriske mekanismen til SCS på motorneuron og unngå unødvendig prøving og feil.
Introduction
Ryggmargsstimulering (SCS) kan effektivt gjenopprette lokomotorisk funksjon etter ryggmargsskade (SCI). Andreas Rowald et al. rapporterte at SCS muliggjør nedre lemmer lokomotorisk og trunkfunksjon innen en enkelt dag1. Å utforske den biologiske mekanismen til SCS for lokomotorisk gjenoppretting er et kritisk og trending forskningsfelt for å utvikle en mer presis SCS-strategi. For eksempel viste Grégoire Courtines team at eksitatoriske Vsx2 interneuron og Hoxa10 nevroner i ryggmargen er nøkkelnevronene til respons på SCS, og cellespesifikk nevromodulering er mulig å gjenopprette rottegangsevnen etter SCI2. Imidlertid fokuserer få studier på den elektriske mekanismen til SCS på en enkeltcelleskala. Selv om det er velkjent at supraterskel likestrømstimulus kan fremkalle aksjonspotensialene (AP) i det klassiske blekkspruteksperimentet 3,4,5, er det fortsatt uklart hvordan den pulserende vekslende elektriske stimuleringen, som SCS, påvirker motorsignalgenereringen.
Gitt kompleksiteten til intraspinale nevrale kretser, er passende utvalg for cellepopulasjon viktig for å undersøke den elektriske mekanismen til SCS. Selv om SCS gjenoppretter motorisk funksjon ved å aktivere den proprioseptive banen6, er motorneuronene den endelige enheten som utfører motorkommandoen, avledet fra integrering av propriosepsjonsinformasjon afferente inngang7. Derfor kan direkte studier av de elektriske egenskapene til motorneuroner med SCS hjelpe oss å forstå den underliggende logikken til spinalmotormodulasjon.
Som vi vet, er patch-clamp den gyldne standardmetoden for cellulært elektrofysiologisk opptak med ekstremt høy spatiotemporal oppløsning8. Derfor beskriver denne studien en metode som bruker en patchklemme for å studere de elektriske responsene til motorneuroner til SCS. Sammenlignet med hjernepatch-klemme9, er ryggmargen patch-klemme vanskeligere på grunn av følgende årsaker: (1) Ryggmargen er beskyttet av vertebral kanal med lite volum, noe som krever veldig fin mikromanipulasjon og streng iskald vedlikehold for å oppnå bedre celle levedyktighet. (2) Fordi ryggmargen er for slank til å festes på skjærebrettet, bør den senkes ned i agarose med lavt smeltepunkt og trimmes etter størkning.
Derfor gir denne metoden tekniske detaljer for å dissekere ryggmargen og opprettholde cellens levedyktighet samtidig for å jevnt studere den elektriske mekanismen til SCS på motorneuroner og unngå unødvendige forsøk og feil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institusjonell dyrepleie- og brukskomité godkjente alle dyreforsøk og undersøkelsene ble gjennomført i henhold til gjeldende dyrevelferdsregelverk.
1. Dyr forberedelse
- Dyr
- Boliginformasjon: Hushanner Sprague-Dawley-rotter (postnatal 10-14 dager, P10-P14) i et spesifikt patogenfritt miljø.
MERK: Romforholdene ble opprettholdt ved 20 °C ± 2 °C, luftfuktighet: 50%-60%, med en 12-timers lys / mørk syklus. Dyrene hadde fri tilgang til mat og vann. - Merk motorneuronene retrogradt: Injiser fluoro-gull (FG) i den bilaterale tibialis anterior og gastrocnemius muskelen (2% i steril saltvann, 50 μL per muskel) for å retrograd merke motorneuronene 2 dager før ofringen.
- Boliginformasjon: Hushanner Sprague-Dawley-rotter (postnatal 10-14 dager, P10-P14) i et spesifikt patogenfritt miljø.
- Løsninger
- Forbered skjæreløsning: Bland 120 mM kolinklorid, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1,25 mM NaH 2 PO4, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl2, 1,3 mM askorbinsyre, 15 mM glukose. Forboble oppløsningen med 95 %O2 og 5 % CO2 (juster til pH 7,4 med KOH) i 30 minutter før disseksjon og kutting. Avkjøl løsningen med knust is.
- Forbered kunstig cerebrospinalvæske (ACSF): Bland 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4; 1,3 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 og 10 mM glukose. Forboble løsningen med 95%O2 og 5% CO2 i 30 minutter før inkubasjonen.
- Forbered intracellulær løsning: Bland 126 mM K-glukonat, 2 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na 2GTP,10 mM K-fosfokreatin og 0,5% nevrobiotin (pH 7,25 og 305 mOsm / kg). Avkjøl løsningen med knust is.
- Forbered lavsmeltende agarosegel: Løs opp 4 g agarose i 100 ml skjæreløsning, og bruk en magnetisk omrøringsrotor for å oppløse den helt. Ved 30 minutter før embedding, varm opp lavsmeltepunktagarose i mikrobølgeovnen med høy effekt i 1 min, og overfør den deretter til et vannbad på 39 °C for å opprettholde væsketilstanden.
- Instrument forberedelse
- Legg knust is på perfusjonsbrettet (tilleggsfigur 1A) 10 minutter før perfusjon. Plasser den anatomiske skuffen (tilleggsfigur 1B) og skjærebrettet (tilleggsfigur 1C) med et vannbånd ved -80 °C over natten i forveien.
- Sett inkubasjonskammeret med nylonnetting i ovnen ved 45 °C over natten i forveien.
- Bruk agarose med lavt smeltepunkt til å prefabrikkere en 35° skråning og en 2 mm tykk plattform (tilleggsfigur 1D). Etter gelstørkning, plasser dem i midten av en 35 mm petriskål for å støtte ryggmargen i de neste kommende prosedyrene.
- Intrakardial perfusjon
- Bedøv rottene med 2,5 % tribromoetanol (160 μL/10 g) via intraperitoneal injeksjon. Sørg for at rottene er fullt bedøvet ved å verifisere mangelen på respons på ytre stimuli, for eksempel en mild klype av tåen.
- Når riktig bedøvelse er bekreftet, legg rottene liggende og immobiliser dem i petriskålen fylt med silikagel.
- Klipp et 5 mm langsgående hudsnitt kaudalt til xiphoidprosessen, og utvid deretter det subkutane rommet helt. Klipp et 2 cm langsgående hudsnitt langs den ventrale midtlinjen for å fullstendig eksponere den ytre brystveggen, starter med det ovennevnte snittet og slutter med toppen av brystet.
- Bruk tannpinsett til å løfte xiphoid (tilleggsfigur 2A), og bruk deretter fin saks til å kutte membranen. Klipp brystbenet langs begge sider av xiphoidprosessen for å åpne brystet og eksponere hjertet (tilleggsfigur 2B).
MERK: Vær forsiktig med å bevare de indre thoraxkarene på begge sider; Ellers kan det føre til massiv blødning. - Bruk tannløs pinsett for å løfte venstre ventrikkel. Stikk en 22 G kanyle inn i venstre ventrikkels apex langs venstre ventrikkels lengdeakse (tilleggsfigur 2C). I mellomtiden observere rytmisk blodpulsering i perfusjonsrøret, eller nålen kan punktere inn i høyre ventrikkel, noe som kan føre til en dårlig perfusjonseffekt.
MERK: Tannpinsett skal ikke brukes; Ellers kan det føre til ekstra blodlekkasje fra pinsettholdestedet. - Bruk fin saks til å klippe høyre forkammer (tilleggsfigur 2C), og injiser deretter 100 ml iskald perfusjonerende væske manuelt med en hastighet på ca. 2 ml/s innen 1 min.
MERK: Når rotters lever og poter blir bleke, og det ikke renner blod ut fra høyre atrium, kan god perfusjon oppnås.
- Ryggmargsdisseksjon (figur 1)
- Plasser rotta i mageleie, og skjær ryggraden ved henholdsvis fremre øvre iliaca ryggrad (ca. L4 vertebralt nivå) og krumningsskiftepunktet i thoraxcolumna (ca. T6 vertebralt nivå) (figur 1A). Deretter plasserer du umiddelbart den isolerte ryggraden i den oksygenerte iskalde perfusjonsløsningen for å vaske av gjenværende blod og fettvev; Denne prosedyren er gunstig for å holde det operative feltet rent i de påfølgende prosedyrene.
MERK: De paraspinale musklene bør reserveres, noe som bidrar til den påfølgende fiksering av ryggraden ved bruk av en insektpinne. - Overfør umiddelbart den isolerte ryggraden til den anatomiske skuffen (figur 1B) med ryggsiden opp og rostralenden nær operatøren. Fyll det anatomiske brettet med 50 ml kontinuerlig oksygenert iskald skjæreløsning (figur 1B).
- Bruk fire insektpinner for å fikse ryggraden ved å trenge inn i paraspinalmusklene (figur 1B).
- Under disseksjonsmikroskopet kutter du vertebrale pedikler på begge sider fra rostralenden med mikrosaksen, som kan kalles "laminektomi" (figur 1C). Vær oppmerksom på ikke å skade ryggmargen. I mellomtiden bruker du mikrotannpinsetten til å løfte den kuttede vertebrale kroppen.
- Etter laminektomi, ikke skille ryggmargen fra ryggraden umiddelbart. Bruk i stedet en mikrosaks til å kutte dura materen langs den dorsale midtlinjen, noe som bidrar til næringsopptak mellom celler og oksygenert ACSF (figur 1D).
MERK: Riv aldri dura materen. Bare kutting av dura mater med mikrosaks er tillatt; Ellers vil nerveroten og spinal parenchyma bli alvorlig skadet! - Løft rostraldelen av ryggmargen, og skjær deretter nerveroten forsiktig med ca. 1 mm reservert (figur 1E). Etter å ha skilt ryggmargen fra vertebralkanalen, bruk 2 insektpinner for å feste ryggmargen med ventralsiden opp (figur 1F).
- Bruk en mikrosaks til å kutte dura materen langs den ventrale midtlinjen (figur 1F). Klipp av de overflødige nerverøttene med ca. 1 mm reservert.
MERK: Nerven er mye mer seig enn ryggmargen. Hvis den reserverte nerveroten er for lang (>1 mm), kan ikke vibratomen kutte av nerveroten, noe som kan føre til en alvorlig rift i spinalparenkymet. - Bruk en mikrosaks til å skille korsryggforstørrelsen til en lengde på 6–7 mm (figur 1G).
- Plasser rotta i mageleie, og skjær ryggraden ved henholdsvis fremre øvre iliaca ryggrad (ca. L4 vertebralt nivå) og krumningsskiftepunktet i thoraxcolumna (ca. T6 vertebralt nivå) (figur 1A). Deretter plasserer du umiddelbart den isolerte ryggraden i den oksygenerte iskalde perfusjonsløsningen for å vaske av gjenværende blod og fettvev; Denne prosedyren er gunstig for å holde det operative feltet rent i de påfølgende prosedyrene.
- Innebygging i lavsmeltende agarose
- Plasser korsryggforstørrelsen i hellingen på 35 ° (figur 1H) med ryggsiden opp og den kaudale enden ned. Bruk et absorberende filterpapir for å fjerne rikelig med vann på vevsoverflaten (figur 1H).
- Hell langsomt den smeltede agarosegelen i petriskålen som inneholder lumbalforstørrelsen (figur 1I).
MERK: Ikke hell for fort, ellers vil bobler samle seg i gelen. - Plasser ovennevnte petriskål i isvannblandingen for å avkjøle gelen så snart som mulig, noe som bidrar til å opprettholde cellens aktivitet.
- Trim gelen til en kube på 15 mm x 10 mm x 10 mm og monter den på prøveplaten med superlim (figur 1J).
- Slicing
- Plasser prøveskiven i det forfrosne skjærebrettet, og hell deretter den iskalde skjæreløsningen (figur 1K). Boble kontinuerlig med 95 % CO2 og 5 %O2 i skjærebrettet.
- Still inn vibratomparametrene: tykkelse: 350 μm; hastighet: 0,14-0,16 mm / s, amplitude: 1,0 mm og vibrasjonsfrekvens: 85 Hz.
- Høst 2-3 egnede skiver per dyr. Ta opp 1-2 sunne FG + motorneuroner per skive, med en rekkevidde på 5-6 celler per dyr.
- Inkubasjon
- Bruk dekselpinsetten til å klippe et stykke (figur 1L) og plasser det i inkubasjonskammeret fylt med kontinuerlig oksygenert ACSF. Plasser inkubasjonskammeret i et vannbad ved 32 °C i 30 minutter, og fortsett deretter å inkubere det ved romtemperatur (RT) i ytterligere 30 minutter før opptak.
MERK: Ovennevnte prosedyrer, fra anestesi til å oppnå det første stykket, bør fullføres innen 20-30 minutter for å beholde cellens levedyktighet så mye som mulig. Motorneuronene i hver skive kan opprettholde levedyktigheten i omtrent 6-7 timer.
- Bruk dekselpinsetten til å klippe et stykke (figur 1L) og plasser det i inkubasjonskammeret fylt med kontinuerlig oksygenert ACSF. Plasser inkubasjonskammeret i et vannbad ved 32 °C i 30 minutter, og fortsett deretter å inkubere det ved romtemperatur (RT) i ytterligere 30 minutter før opptak.
2. Patch-clamp-opptak med SCS (figur 2)
- Forberedelser
- Perfus opptakskammeret med kontinuerlig boblet ACSF med en hastighet på ca. 1-2 ml / min. Juster strømningshastigheten individuelt via kontrollpanelet på den peristaltiske pumpen.
- Legg et stykke i opptakskammeret. Bruk den U-formede platinatråden med nylontråder for å stabilisere skiven på plass.
- Bruk et infrarødt differensialinterferenskontrastmikroskop (IR-DIC) for å observere skiven. Under 4x objektivlinsen, bekreft at lengden på dorsalroten er ca. 1 mm. Finn området der dorsalroten kommer inn i parenkymen, og flytt deretter det sentrale synsfeltet til dette området.
- Koble pulsgeneratoren med skreddersydde elektroder (figur 2A).
- SCS-konfigurasjon
- Plasser anoden til SCS nær den dorsale midtlinjen via mikromanipulasjonssystemet (figur 2B).
- Plasser katoden til SCS nær inngangssonen for dorsalrot (DREZ) via mikromanipulasjonssystemet (figur 2B).
- Cellemålretting og bildebehandling
- Bruk IR-DIC med en 10x objektivlinse Finn omtrent den dorsolaterale regionen av motorkolonnen, der de fleste motorneuroner befinner seg. Flytt deretter det sentrale synsfeltet til dette området.
- Bytt til en 60x objektivlinse for å finne et sunt nevron med en jevn og lys overflate og usynlige kjerner (figur 2C, F).
- Skru litt ned IR-intensiteten og slå på fluorescenslyskilden. Bytt lysfilter til bredbånds ultrafiolett eksitasjonsfilter (figur 2D,G), for å velge et passende FG-positivt (FG+) motornevron (figur 2E,H).
- Bruk sugeelektroder til å påføre 1x motorisk terskelstimulering på dorsalroten. Hvis det påvises et fremkalt aksjonspotensial i motornevronene (tilleggsfigur 3), bekrefter det at aktiviteten til ryggroten er intakt. Hvis ikke, bør denne skiven kastes.
- Patch-klemme opptak
- Fyll mikropipetten med den intracellulære oppløsningen og sett den inn i elektrodeholderen. Bruk mikromanipulasjonssystemet til å senke pipetten ned i ACSF-badet. Pipettmotstanden varierer fra 5-8 MΩ.
- Påfør en liten mengde overtrykk på pipetten for å blåse bort støv og celleavfall.
- Senk elektroden for å nærme seg cellen. Når pipetten berører overflaten av FG+ nevronet, blir en liten fordypning av membranen synlig på spissens nivå. Slipp det positive trykket.
- Påfør deretter en liten mengde undertrykk på pipetten ved hjelp av en sprøyte. Dette skaper en liten mengde sug som trekker cellemembranen i kontakt med glasspipetten. Vær alltid oppmerksom på den totale motstanden på programvaregrensesnittet til motstandsverdien øker til gigaohm (>1 GΩ). Deretter dannes gigasealen.
- Klem membranpotensialet ved -70 mV, og trykk deretter på knappen for rask kapasitanskompensasjon på forsterkerens programvaregrensesnitt. Påfør forsiktig et forbigående undertrykk for å sprekke cellemembranen, og trykk deretter på knappen for langsom kapasitanskompensasjon på forsterkerens programvaregrensesnitt. På dette tidspunktet oppnås en god helcellekonfigurasjon.
- Bytt til strømklemmemodus ved å klikke på IC-knappen på programvaregrensesnittet, og registrer hvilemembranpotensialet (RMP).
- Påfør SCS i 1-2 s med amplitude på 1-10 mA, mens pulsbredden og frekvensen er fast ved henholdsvis 210 μs og 40 Hz. Bestem motorterskelen ved sakte å øke stimuleringsamplituden til det første AP observeres.
- Skille forsinkede og umiddelbare avfyrende motorneuroner ved hjelp av en 5 s depolariserende strøminjeksjon rundt reobase i strømklemmemodus10,11,12. Umiddelbare avfyrende motorneuroner: Lav rheobase kan indusere umiddelbar og repeterende avfyring med stabil avfyringsfrekvens; Forsinkede avfyrende motornevroner: Høy reobase kan indusere en forsinket debut for repeterende avfyring med en akselererende avfyringshastighet (figur 3).
- Når SCS er slått av, fortsetter du å registrere membranpotensialet for å fange opp spontane AP-er.
- Utfør spenningsklemmeopptak spenningsklemmeopptak for eksitatorisk postsynaptisk strøm (EPSC) når SCS er på og av. Stimuleringsparameteren er 1x motorterskel, 210 μs, 2 Hz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Takket være grundig vedlikehold ved lave temperaturer under findriften (tilleggsfigur 1, tilleggsfigur 2 og figur 1) var cellens levedyktighet god nok til å utføre påfølgende elektrofysiologiske registreringer. For å simulere det kliniske scenariet mest mulig brukte vi mikromanipulasjon for å plassere SCS-katoden og anoden nær henholdsvis dorsal-midtlinjen og DREZ (figur 2), som kunne initiere nevrale signaler i dorsalhornet for å forplante seg til motornevronene i den dorsolaterale regionen av motorkolonnen. I denne studien brukte vi FG til å lokalisere motorneuronene med en diameter på 20-50 μm. Som vist i figur 2D, G, bekreftet vi trygt et sunt FG + nevron som et motorneuron - terminalen i ryggkretsen. Denne merkemetoden banet vei for å studere hvordan SCS påvirker avfyringsmønsteret. De elektrofysiologiske egenskapene til forsinkede og umiddelbare motornevroner er listet opp i tilleggstabell 1 og tilleggstabell 2. Metodene for beregning av aktive og passive egenskaper er gitt i tilleggsfil 1.
Når SCS leverte et pulserende alternerende elektrisk felt til spinalskiven, brukte vi først strømklemmemodus for å registrere responsen til membranpotensialet (figur 4). Da vi gradvis økte stimuleringsamplituden med et trinn på 1/3 motorterskel (figur 4B,C), steg også membranpotensialet med det, men bare 1x motorterskel kunne fremkalle Aps (figur 4D). Figur 4D viser at omtrent hver 10-20 pulser kan fremkalle en AP, noe som indikerer at en bestemt AP-responsregularitet til SCS-amplitude kan eksistere.
Etter at SCS ble slått av, fortsatte vi å registrere membranpotensial. Figur 5 viste at membranpotensialet økte noe til -60 mV, og nevronet fyrte av en rekke spontane APer. Disse spontane AP-ene varer i en kort periode (30-40 s), deretter returneres membranpotensialet til -65 mV, noe som indikerer at SCS midlertidig kan øke celleeksitabiliteten.
Deretter brukte vi spenningsklemmeopptak for EPSC når SCS var på og av (figur 6). Etter hver SCS-puls kunne en fremkalt EPSC detekteres. Latensen mellom stimulusartefakten og EPSC var 2,64 ± 0,38 ms (tilleggsfigur 4). Amplituden til fremkalte EPSC var 35,14 ± 12,73 pA (tilleggsfigur 4). Frekvensen av fremkalte EPSC-er er konsistent med SCS-frekvensen. Etter å ha trukket fra den passive ladningsbalanseringen, kan den fremkalte EPSC observeres i et levedyktig motornevron etter 1x motorisk terskelstimulering (tilleggsfigur 5A). Stimulasjonspolariteten ble reversert etter å ha stoppet perfusjonen i 2 timer i samme celle. Stimuleringen induserte ingen EPSC, noe som bekreftet at den fremkalte EPSC ikke var en artefakt (tilleggsfigur 5B).
Figur 1 Ryggmargsdisseksjon og skiver. (A) Skjær ryggraden ved henholdsvis fremre øvre iliaca ryggrad (ca. L4 vertebralt nivå) og krumningsskiftepunktet i thoracic columna (ca. T6 vertebralt nivå). (B) Overfør umiddelbart den isolerte ryggraden til den anatomiske skuffen med ryggsiden opp og rostralenden nær operatøren. Fyll det anatomiske brettet med den kontinuerlig oksygenerte iskalde skjæreløsningen. (C) Utfør laminektomi på begge sider fra rostralenden. (D) Kutt dorsal dura mater, som bidrar til næringsopptak mellom celler og oksygenert kunstig cerebrospinalvæske (ACSF). (E) Kutt forsiktig nerveroten. (F) Skjær den ventrale dura materen. (G) Skill lumbalforstørrelsen til en lengde på 6-7 mm. (H) Plasser korsryggforstørrelsen på 35 ° hellingen med ryggsiden opp og den kaudale enden ned. Bruk et absorberende filterpapir for å fjerne rikelig vann på vevsoverflaten. (I) Hell langsomt den smeltede agarosegelen i petriskålen. (J) Trim gelen i en terning og monter den på prøveplaten med superlim. (K) Legg prøveskiven i skjærebrettet, og hell deretter den iskalde skjæreløsningen. (VG Nett) Et eksempel på en spinal skive ved lumbal utvidelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ryggmargsstimulering (SCS) konfigurasjon og motor neuron imaging. (A) Pulsgeneratoren med skreddersydde elektroder kan justere amplitude, pulsbredde og frekvens separat. Innløpet viste at den dimensjonale spesifikasjonen av en elektrodekontakt er 800 μm x 500 μm x 300 μm. (B) Plasser anoden og katoden nær henholdsvis dorsalens midtlinje og dorsale rotinngangssone (DREZ) via mikromanipulasjonssystemet. Plasser opptakspipetten i det dorsolaterale området av motorkolonnen for å klemme de fluor-gullpositive (FG+) motornevronene. (C) En sunn umiddelbar avfyring motor neuron med infrarød differensial interferens kontrast mikroskop (IR-DIC) imaging (60x). (D) Det samme nevronet med bare fluorescensavbildning (60x), skinnende fluor-gull (FG) partikler representerer at dette nevronet er et motorneuron. (E) Sammenslått bilde av IR-DIC og fluorescens i FG+ motornevron. (VG Nett) En sunn forsinket avfyring motor neuron med IR-DIC imaging (60x). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skille mellom forsinkede og umiddelbare avfyrende motorneuroner ved hjelp av en 5 s depolariserende strøminjeksjon. (A) Umiddelbare avfyrende motorneuroner: Lav reobase kan indusere umiddelbar og repeterende avfyring med stabil avfyringsfrekvens; (B) Forsinkede avfyringsmotorneuroner: Høy reobase kan indusere et forsinket utbrudd for repeterende avfyring med en akselererende avfyringshastighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Ryggmargsstimulering (SCS) fremkalte aksjonspotensialer (AP) i motornevroner. (A) Når ingen stimulering ble brukt, var hvilemembranpotensialet (RMP) -65 mV. (B) 1/3x motorisk terskelstimulus kan ikke fremkalle AP. (C) 2/3x motorisk terskelstimulus kan ikke fremkalle AP. (D) 1x motorisk terskelstimulus kan fremkalle AP, og hver 10-20 pulser kan fremkalle en AP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Spontane aksjonspotensialer (AP) etter ryggmargsstimulering (SCS). Etter at SCS ble slått av, fyrte nevronet en serie spontane APer i en kort periode (30-40 s), deretter returnerte hvilemembranpotensialet (RMP) til -65 mV. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Illustrasjon av parameter for ryggmargsstimulering (SCS) og fremkalt eksitatorisk postsynaptisk strøm (EPSC). (A) Illustrasjon av SCS-parameter; (B,C) Etter en enkelt stimuleringspuls (1x motorisk terskelstimulering) kan den fremkalte EPSC observeres; (D) Etter å ha trukket fra den passive ladningsbalanseringen, kan latensen og amplituden til EPSC beregnes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Klargjøring av instrumenter. (A) Perfusjonsbrett: 10 minutter før perfusjonen, legg knust is på 10 cm petriskålen fylt med silikagel. (B) Anatomisk brett: Om natten før ofring, plasser det selvlagde anatomiske brettet fylt med silikagel i kjøleskapet på -80 °C. (C) Skjærebrett: Om kvelden før ofring, plasser skjærebrettet med vannbånd i -80 °C kjøleskap. (D) Agarose støpehelling: 30 minutter før perfusjonen, plasser en 35 ° agarosehelling med bunnplater i midten av en 35 mm petriskål. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Intrakardial perfusjon. (A) Løft xiphoidprosessen. (B) Klipp brystbenet langs begge sider av xiphoidprosessen for å åpne brystet og avsløre hjertet. Vær forsiktig så du ikke skader de indre thoraxkarene, ellers vil massiv blødning fylle hele operasjonsfeltet og hindre operatøren i å identifisere ventrikkeltoppen eller høyre atrium. (C) Sett inn en 22 G kanyle ved venstre ventrikkels apex for perfusjon og kutt høyre atrium for væskeutgang. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: Bekreftelse av dorsalrotaktiviteten. Bruk sugeelektroder til å påføre 1x motorisk terskelstimulering på dorsalroten. Hvis det oppdages et fremkalt aksjonspotensial i motornevronene, kan vi bekrefte at aktiviteten til dorsalroten er intakt. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 4: Latenstid og amplitude av fremkalte EPSC-er når SCS var på. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 5: Demonstrasjon av gyldigheten av den fremkalte EPSC. (A) Etter 1x motorisk terskelstimulering etter å ha trukket fra den passive ladningsbalanseringen, kan den fremkalte EPSC observeres i et levedyktig motorneuron; (B) Etter å ha stoppet perfusjonen i 2 timer i samme celle, ble stimuleringspolariteten reversert, 1x motorisk terskelstimulering induserte ingen EPSC, noe som bekreftet at den fremkalte EPSC ikke var en artefakt. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: Beregningsmetoder for de aktive og passive egenskapene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 1: Passive egenskaper til motorneuroner. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 2: Aktive egenskaper til motorneuroner Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bevegelsesinformasjonen modulert av SCS blir endelig konvergert til motorneuronene. Derfor kan det å ta motorneuronene som forskningsmål forenkle studiedesignet og avsløre nevromodulasjonsmekanismen til SCS mer direkte. For samtidig å registrere ulike stimulusegenskaper og cellulære responser, er en patch-klemme en god metode for å studere de elektrofysiologiske egenskapene på en enkeltcelleskala. Imidlertid er det fortsatt noen vanskeligheter, inkludert hvordan man opprettholder cellens levedyktighet, hvordan man raskt skiller ryggmargen fra den benete strukturen, og hvordan man bruker SCS til å indusere APs vellykket. Derfor har denne studien som mål å hjelpe forskere raskt å forstå viktige operative ferdigheter, unngå noen mulige fallgruver, og fokusere på studiedesign i stedet for metodikk så tidlig som mulig.
For å oppnå god levedyktighet av celler, bør man alltid være oppmerksom på følgende detaljer: (1) Å holde ryggmargen ved iskald temperatur er svært viktig fordi lav temperatur kan hemme celledød og redusere metabolsk hastighet, noe som kan beskytte nevronet mot mekanisk skade under perfusjon, disseksjon og skiver13; (2) Delikat fjerning av dura materen med mikrosaks kan forbedre nevronnæringsopptaket fra omkringliggende løsninger. Skrell aldri av dura materen direkte; Ellers vil ryggmargen bli alvorlig skadet. I tillegg, hvis du glemmer å fjerne dura materen, kan den etterfølgende kutteprosessen være vanskelig fordi bladet ikke helt kan kutte av dura materen og deretter rive ut den gjenværende ryggmargen fra agarose, noe som kan føre til svikt i kutting. (3) Sammenlignet med konvensjonelle tverrskiver øker skrå skiver arealet av grå substans, og du kan finne flere FG + motorneuroner i en enkelt skive9. (4) Fordi ryggmargen alene ikke kan festes fast på prøveplaten som hjernen, er det effektivt å legge det inn i agarosegel for å løse dette problemet uten å redusere cellens levedyktighet. Vi anbefaler å bruke lavsmeltende agarose (gelpunkt 26-30 °C) i stedet for konvensjonell agarose (gelpunkt 38-43 °C), fordi høy temperatur kan skade cellens levedyktighet. (5) Vi anbefaler at avstanden mellom to nylontråder av U-formet platinatråd skal være 1 til 1,5 mm fordi løse tråder ikke kan immobilisere ryggmargen, og tette tråder kan klemme cellen.
Sammenlignet med konvensjonelle stimuleringsenheter, som bipolare krokelektroder som er mye brukt i grunnforskning, er SCS-elektroden i denne studien hentet fra vårt tidligere kliniske arbeid14 og grunnforskning15. SCS leverer pulserende vekslende elektrisk stimulering, noe som gir forskjellige parameterjusteringsdimensjoner. Denne SCS-enheten har også en ladningsbalansefunksjon for å unngå vevelektrolyse og kommer ikke direkte i kontakt med nevralvevet; Derfor har denne SCS god sikkerhet for in vivo-applikasjoner .
Etter SCS-behandling kan de spontane APene til motorneuroner tilskrives følgende årsaker: (1) SCS induserer ladningen til å akkumulere i cellekroppen og aksonal colliculus av nevroner, noe som fører til økningen av RMP16. Dette fenomenet indikerer at SCS kan forbedre eksitabiliteten til nevron, noe som kan være relatert til endringen av ledningsevnen til ionkanaler etter SCS, slik som Na v 1.117, K v 2.1 18 eller Ca v 2.3 19. (2) SCS kan aktivere dorsale GABAerge nevroner for å lette proprioceptiv tilbakemelding til motorneuroner. Vi foreslår at nevral overføring kontinuerlig kan eksistere mellom sensoriske nevroner og motorneuroner, noe som fører til spontane APs i motorneuroner etter SCS. Spontane AP-er kan opprettholde en iboende tilstand av beredskap til å utføre sensorimotorisk atferd20. Derfor kan aktivering eller hemming av spontane AP være gunstig for behandling av spinale nevrologiske sykdommer.
Som vi vet, er in vivo elektrofysiologisk opptak bedre for å oppdage elektrofysiologisk respons under den naturlige fordeling av det elektriske feltet og plasseringen av elektroder. Videre tillater in vivo motoneuron opptak identifisering av motoneuron identitet. Dette kan gjøres gjennom antidromisk identifikasjon av motoraksoner kombinert med muskelfiberkraftmåling21. Men in vivo ryggmargsopptak har også følgende ulemper: (1) Motor neuron ligger 2-3 mm vekk fra ryggmargens dorsale overflate, selv ved hjelp av den mest avanserte to-foton konfokale bildebehandling, er observasjonsdybden bare 500-800 μm, så det er vanskelig å optisk observere dem in vivo ved hjelp av eksisterende metoder. Derfor, hvis vi ønsker å klemme en enkelt motorneuron in vivo, må glasspipetten passere gjennom dorsalkolonnen for å nå det usynlige motorneuronet; In vivo patch-klemmen kan bare utføres på en "blind" måte, noe som resulterer i betydelig usikkerhet og feilrate. (2) Bortsett fra in vivo patch-klemmen, kan silisiumelektrodeopptak være den alternative metoden, for eksempel Utah array eller Neuropixels elektrode. Imidlertid er signalene som registreres av silisiumelektroder for det meste sammensatt aksjonspotensial i stedet for enkelt handlingspotensial. Selv om aktiviteten til enkeltnevroner er løst ved hjelp av piggsorteringsalgoritmer, må nøyaktigheten og påliteligheten til sorteringsalgoritmer fortsatt forbedres.
Sammenlignet med in vivo-opptakene er den største fordelen med in vitro mot in vivo bruk av spenningsklemme, noe som gir en unik forståelse av de synaptiske banene aktivert av SCS. I tillegg vil det også tillate bruk av levende bildebehandlingsverktøy. Vi spekulerer på at SCS induserer frigjøring av nevrotransmittere som GABA og glutamat fra nevroner på øvre nivå på motorneuronene, noe som resulterer i en generell eksitatorisk EPSC-respons7. Derfor vil vi i vår kommende forskning innlemme deteksjon av IPSC, mini EPSC (mEPSC) og fremkalt EPSC indusert av SCS for å klargjøre mønstrene for hemmende og eksitatorisk nevrotransmitterfrigjøring fra premotoriske nevroner eller interneuroner. Vi erkjente fullt ut at in vitro-stimulering også har noen begrensninger: (1) Langdistanse langsgående kretsløp i ryggmargen er forstyrret, noe som resulterer i tap av innkommende informasjon fra motorcortex eller nedre ekstremitet; (2) Fordelingen av elektriske felt under in vitro-stimulering kan avvike fra fordelingen ved in vivo-stimulering. I denne studien var aktiveringsterskelen (omtrent i milliampere) for AP mye høyere enn for in vivo-eksperimentet (omtrent i mikroampere)15; Dette skyldtes at volumkapasiteten til ACSF-løsningen i opptakskammeret var mye høyere enn cerebrospinalvæsken i naturlig tilstand, og matematisk teori støtter at elektrisk felt dempes raskere i materialer med høy konduktivitet22. Derfor ble det meste av strømmen absorbert av badeløsningen, og vi spekulerer på at bare en liten del av det elektriske feltet kan diffundere til nerverøttene.
Derfor, med tanke på fordelene og ulempene ved in vivo stimulering og in vitro stimulering, kan det konkluderes med at in vitro patch-klemme er en fordelaktig metode for å studere synaptisk natur og/eller cellulære effekter av SCS hos nyfødte gnagere.
I klinisk praksis trekker elektroden ikke direkte sammen overflaten av ryggmargen eller nerveroten23. I stedet er den avhengig av den elektriske feltstrålingen generert av elektroden for indirekte å påvirke nervenes aktivitet1. Flere studier 1,23,24 har bekreftet at katodekontakten til SCS bør plasseres så nær ryggroten eller inngangssonen (DREZ) som mulig for å oppnå optimal selektivitet for å stimulere en bestemt muskel. Å øke avstanden mellom elektroden og nerveroten vil svekke stimuleringens spesifisitet. Derfor plasserer vi katoden direkte nær DREZ i stedet for å kontakte nerveroten eller ryggmargen direkte.
De afferente fibrene i dorsalroten projiserer først til sensoriske nevroner, deretter til interneuronene og motorneuronene. I tillegg til de tverrgående projeksjonskretsene, er det også kretser som projiserer mot rostral og kaudal ende. For eksempel kan motorneuroner som tilsvarer tibialis anterior muskel bli funnet på flere nivåer25. Derfor, selv om skrå forberedelse kan kutte de tverrgående projeksjonskretsene, vil den fortsatt bevare ikke-tverrgående fremspringende fibre, noe som tillater studiet av den premotoriske sensoriske kretsen. I tillegg til skrå og tverrgående forberedelse gir langsgående forberedelse forskjellige fordeler for bedre å bevare kretsene fra dorsalroten til motorneuronene og muliggjøre effektiv oppbevaring av ryggmargskretser over flere segmenter26, noe som gir en nærmere representasjon av de virkelige fysiologiske forholdene.
Ifølge simuleringsforskningen 6,27,28 aktiverer SCS hovedsakelig proprioseptive afferente fibre for å gjenopprette bevegelsen i underekstremitetene, inkludert Ia, Ib og II afferente fibre. Men i denne studien kan vi ikke trygt bekrefte hvilke typer fiber som ble spesifikt aktivert av SCS. Vi spekulerer på om et lignende mønster også kan eksistere i in vitro patch-klemmen. Vi vil løse dette problemet ved å gjennomføre matematisk modellering og simulering og innlemme det i vårt pågående arbeid.
Avslutningsvis kan denne protokollen hjelpe forskere med å forbedre sine operative ferdigheter og forstå det vesentlige ved å kombinere patch-clamp-opptak og SCS for å undersøke den elektriske mekanismen til SCS på en enkeltcelleskala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 og 82301657) og China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
