Summary
Bu protokol, motor nöronların omurilik stimülasyonuna (SCS) elektriksel tepkilerini yüksek uzay-zamansal çözünürlükle incelemek için bir yama kelepçesi kullanan bir yöntemi açıklar ve bu da araştırmacıların omuriliği ayırma ve aynı anda hücre canlılığını sürdürme becerilerini geliştirmelerine yardımcı olabilir.
Abstract
Omurilik stimülasyonu (SCS), omurilik yaralanması (SCI) sonrası lokomotor fonksiyonu etkili bir şekilde geri yükleyebilir. Motor nöronlar, sensorimotor davranışları yürüten son birim olduğundan, motor nöronların elektriksel tepkilerini SCS ile doğrudan incelemek, spinal motor modülasyonunun altında yatan mantığı anlamamıza yardımcı olabilir. Farklı uyaran özelliklerini ve hücresel tepkileri aynı anda kaydetmek için, bir yama kelepçesi, elektrofizyolojik özellikleri tek hücre ölçeğinde incelemek için iyi bir yöntemdir. Bununla birlikte, hücre canlılığını korumak, omuriliği kemikli yapıdan hızlı bir şekilde ayırmak ve aksiyon potansiyellerini başarılı bir şekilde indüklemek için SCS'yi kullanmak da dahil olmak üzere bu hedefe ulaşmada hala bazı karmaşık zorluklar vardır. Burada, motor nöronların yüksek uzay-zamansal çözünürlükle SCS'ye elektriksel tepkilerini incelemek için yama-kelepçe kullanarak ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, bu da araştırmacının omuriliği ayırma ve hücre canlılığını koruma becerilerini geliştirmelerine yardımcı olabilir.
Introduction
Omurilik stimülasyonu (SCS), omurilik yaralanması (SCI) sonrası lokomotor fonksiyonu etkili bir şekilde geri yükleyebilir. Andreas Rowald ve ark. SCS'nin tek bir gün içinde alt ekstremite lokomotor ve gövde fonksiyonunu sağladığını bildirmiştir1. Lokomotor geri kazanım için SCS'nin biyolojik mekanizmasını keşfetmek, daha kesin bir SCS stratejisi geliştirmek için kritik ve trend olan bir araştırma alanıdır. Örneğin, Grégoire Courtine'in ekibi, omurilikteki uyarıcı Vsx2 internöron ve Hoxa10 nöronlarının SCS'ye yanıt veren anahtar nöronlar olduğunu ve hücreye özgü nöromodülasyonun SCI2'den sonra sıçan yürüme yeteneğini geri kazanmak için mümkün olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, az sayıda çalışma, tek hücre ölçeğinde SCS'nin elektriksel mekanizmasına odaklanmaktadır. Klasik kalamar deneyi 3,4,5'te eşik üstü doğru akım uyaranının aksiyon potansiyellerini (AP'ler) ortaya çıkarabileceği iyi bilinmesine rağmen, SCS gibi darbeli alternatif elektriksel stimülasyonun motor sinyal üretimini nasıl etkilediği hala belirsizdir.
İntraspinal nöral devrelerin karmaşıklığı göz önüne alındığında, SKS'nin elektriksel mekanizmasının araştırılmasında hücre popülasyonu için uygun seçim önemlidir. SCS, propriyoseptif yol6'yı aktive ederek motor fonksiyonunu geri yüklese de, motor nöronlar, propriyosepsiyon bilgisi afferent girdisinin7 entegre edilmesinden türetilen motor komutu yürüten son birimdir. Bu nedenle, SCS ile motor nöronların elektriksel özelliklerini doğrudan incelemek, spinal motor modülasyonun altında yatan mantığı anlamamıza yardımcı olabilir.
Bildiğimiz gibi, yama kelepçesi, son derece yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip hücresel elektrofizyolojik kayıt için altın standart yöntemdir8. Bu nedenle, bu çalışma, motor nöronların SCS'ye elektriksel tepkilerini incelemek için bir yama kelepçesi kullanan bir yöntemi açıklamaktadır. Beyin yama kelepçesi9 ile karşılaştırıldığında, omurilik yama kelepçesi aşağıdaki nedenlerden dolayı daha zordur: (1) Omurilik, daha iyi hücre canlılığı elde etmek için çok ince mikromanipülasyon ve titiz buz gibi bakım gerektiren küçük hacimli vertebral kanal tarafından korunur. (2) Omurilik, kesme tepsisine sabitlenemeyecek kadar ince olduğundan, düşük erime noktalı agaroza daldırılmalı ve katılaşmadan sonra kesilmelidir.
Bu nedenle, bu yöntem, SCS'nin motor nöronlar üzerindeki elektriksel mekanizmasını sorunsuz bir şekilde incelemek ve gereksiz denemelerden ve hatalardan kaçınmak için omuriliğin diseke edilmesinde ve aynı zamanda hücre canlılığının korunmasında teknik ayrıntılar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tüm hayvan deneylerini onayladı ve çalışmalar ilgili hayvan refahı yönetmeliklerine uygun olarak yürütüldü.
1. Hayvanların hazırlanması
- Hayvan
- Barınma bilgisi: Erkek Sprague-Dawley sıçanlarını (doğum sonrası 10-14 gün, P10-P14) belirli bir patojen içermeyen ortamda barındırın.
NOT: Oda koşulları 20 °C ± 2 °C, nem: %50-60 arasında, 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsüyle korunmuştur. Hayvanların yiyecek ve suya ücretsiz erişimi vardı. - Motor nöronları retrograd olarak etiketleyin: Fedakarlıktan 2 gün önce motor nöronları retrograd olarak etiketlemek için bilateral tibialis anterior ve gastroknemius kasına (steril salinde% 2, kas başına 50 μL) Floro-Altın (FG) enjekte edin.
- Barınma bilgisi: Erkek Sprague-Dawley sıçanlarını (doğum sonrası 10-14 gün, P10-P14) belirli bir patojen içermeyen ortamda barındırın.
- Çözümleri
- Kesme çözeltisini hazırlayın: 120 mM Kolin Klorür, 2.6 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 0.5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl2, 1.3 mM Askorbik Asit, 15 mM Glikozu karıştırın. Çözeltiyi diseksiyon ve dilimlemeden önce 30 dakika boyunca %95 O2 ve %5CO2 (KOH ile pH 7.4'e ayarlayın) ile önceden köpürtün. Çözeltiyi kırılmış buzla soğutun.
- Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) hazırlayın: 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4'ü karıştırın; 1.3 mM MgCl 2, 2.4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ve 10 mM glikoz. Çözeltiyi inkübasyondan önce 30 dakika boyunca %95 O2 ve %5CO2 ile önceden köpürtün.
- Hücre içi çözelti hazırlayın: 126 mM K-Glukonat, 2 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na 2 ATP, 0.4 mM Na2GTP, 10 mM K-fosfokreatin ve% 0.5 Nörobiotin(pH 7.25 ve 305 mOsm / Kg). Çözeltiyi kırılmış buzla soğutun.
- Düşük erime noktalı agaroz jeli hazırlayın: 4 g agarozu 100 mL kesme çözeltisinde çözün ve tamamen çözmek için manyetik bir karıştırma rotoru kullanın. Gömmeden 30 dakika önce, düşük erime noktalı agarozu mikrodalga fırında yüksek güçte 1 dakika ısıtın ve ardından sıvı halini korumak için 39 °C'lik bir su banyosuna aktarın.
- Enstrüman hazırlığı
- Perfüzyondan 10 dakika önce kırılmış buzu perfüzyon tepsisine (Ek Şekil 1A) yerleştirin. Anatomik tepsiyi (Ek Şekil 1B) ve kesme tepsisini (Ek Şekil 1C) bir su bandı ile gece boyunca -80 °C'de yerleştirin.
- Naylon fileli inkübasyon odasını gece boyunca 45 °C'de fırına yerleştirin.
- 35°'lik bir eğimi ve 2 mm kalınlığında bir platformu prefabrike etmek için düşük erime noktalı agaroz kullanın (Ek Şekil 1D). Jel katılaşmasından sonra, sonraki prosedürlerde omuriliği desteklemek için bunları 35 mm'lik bir Petri kabının ortasına yerleştirin.
- İntrakardiyal perfüzyon
- Sıçanları intraperitoneal enjeksiyon yoluyla% 2.5 tribromoetanol (160 μL / 10 g) ile uyuşturun. Ayak parmağının hafifçe sıkışması gibi dış uyaranlara yanıt eksikliğini doğrulayarak sıçanların tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
- Uygun anestezi onaylandığında, sıçanları sırtüstü yatırın ve silika jel ile doldurulmuş Petri kabına hareketsiz hale getirin.
- Ksifoid işlemine kaudal olarak 5 mm'lik uzunlamasına bir cilt kesisi kesin, ardından deri altı boşluğunu tamamen genişletin. Dış göğüs duvarını tamamen ortaya çıkarmak için ventral orta hat boyunca 2 cm'lik uzunlamasına bir cilt kesisi kesin, yukarıda belirtilen kesiden başlayıp göğsün üst kısmı ile biter.
- Ksifoidi kaldırmak için dişli cımbız kullanın (Ek Şekil 2A) ve ardından diyaframı kesmek için ince makas kullanın. Göğsü açmak ve kalbi ortaya çıkarmak için sternumu ksifoid sürecin her iki tarafı boyunca kesin (Ek Şekil 2B).
NOT: Her iki taraftaki iç torasik damarları korumaya dikkat edin; Aksi takdirde, büyük kanamaya neden olabilir. - Sol ventrikülü kaldırmak için dişsiz cımbız kullanın. Sol ventrikülün uzunlamasına ekseni boyunca sol ventrikül apeksine 22 G'lik bir iğne yerleştirin (Ek Şekil 2C). Bu arada, perfüzyon tüpündeki ritmik kan nabzını gözlemleyin, aksi takdirde iğne sağ ventriküle delinebilir ve bu da zayıf bir perfüzyon etkisine yol açabilir.
NOT: Dişli cımbız kullanılmamalıdır; Aksi takdirde cımbız tutma yerinden fazladan kan sızmasına neden olabilir. - Sağ atriyumu kesmek için ince makas kullanın (Ek Şekil 2C), ardından 1 dakika içinde yaklaşık 2 mL/s hızında 100 mL buz gibi soğuk perfüzyon sıvısını manuel olarak enjekte edin.
NOT: Sıçanların karaciğeri ve pençeleri soluklaştığında ve sağ atriyumdan kan akmadığında, iyi perfüzyon sağlanabilir.
- Omurilik diseyonu (Şekil 1)
- Sıçanı yüzüstü pozisyona getirin ve omurgayı sırasıyla anterior superior iliak omurgada (yaklaşık L4 vertebral seviyede) ve torasik kolonun eğrilik kayma noktasında (yaklaşık T6 vertebral seviyede) kesin (Şekil 1A). Ardından, kalan kan ve yağ dokusunu yıkamak için izole edilmiş omurgayı hemen oksijenli buz gibi perfüzyon solüsyonuna yerleştirin; Bu prosedür, sonraki prosedürlerde ameliyat alanını temiz tutmak için faydalıdır.
NOT: Paraspinal kaslar, bir böcek pimi kullanılarak omurganın daha sonra sabitlenmesi için elverişli olan ayrılmalıdır. - İzole omurgayı, dorsal tarafı yukarı ve rostral ucu operatöre yakın olacak şekilde hemen anatomik tepsiye (Şekil 1B) aktarın. Anatomik tepsiyi 50 mL sürekli oksijenli buz gibi kesme solüsyonu ile doldurun (Şekil 1B).
- Paraspinal kaslara nüfuz ederek omurgayı sabitlemek için dört böcek pimi kullanın (Şekil 1B).
- Diseksiyon mikroskobu altında her iki tarafın vertebral pedikülleri rostral uçtan mikro makas ile kesilerek "laminektomi" olarak adlandırılabilir (Şekil 1C). Omuriliğe zarar vermemeye dikkat edin. Bu arada, kesilen omur gövdesini kaldırmak için mikro dişli cımbız kullanın.
- Laminektomi sonrası omuriliği omurilik kanalından hemen ayırmayın. Bunun yerine, hücreler ve oksijenli ACSF arasında besin alımı için elverişli olan dorsal orta hat boyunca dura mater'i kesmek için bir mikro makas kullanın (Şekil 1D).
NOT: Dura mater'i asla yırtmayın. Dura mater'in sadece mikro makasla kesilmesine izin verilir; Aksi takdirde, sinir kökü ve omurilik parankimi ciddi şekilde hasar görür! - Omuriliğin rostral kısmını kaldırın, ardından sinir kökünü yaklaşık 1 mm ayrılmış olarak dikkatlice kesin (Şekil 1E). Omuriliği vertebral kanaldan ayırdıktan sonra, omuriliği ventral tarafı yukarı bakacak şekilde sabitlemek için 2 böcek pimi kullanın (Şekil 1F).
- Dura mater'i ventral orta hat boyunca kesmek için bir mikro makas kullanın (Şekil 1F). Gereksiz sinir köklerini yaklaşık 1 mm ayrılmış olarak kesin.
NOT: Sinir, omurilikten çok daha inatçıdır. Ayrılmış sinir kökü çok uzunsa (>1 mm), vibratom sinir kökünü kesemez ve bu da spinal parankimde ciddi bir yırtılmaya neden olabilir. - Bel genişlemesini 6-7 mm uzunluğa ayırmak için bir mikro makas kullanın (Şekil 1G).
- Sıçanı yüzüstü pozisyona getirin ve omurgayı sırasıyla anterior superior iliak omurgada (yaklaşık L4 vertebral seviyede) ve torasik kolonun eğrilik kayma noktasında (yaklaşık T6 vertebral seviyede) kesin (Şekil 1A). Ardından, kalan kan ve yağ dokusunu yıkamak için izole edilmiş omurgayı hemen oksijenli buz gibi perfüzyon solüsyonuna yerleştirin; Bu prosedür, sonraki prosedürlerde ameliyat alanını temiz tutmak için faydalıdır.
- Düşük erime noktalı agaroz içine gömme
- Bel genişlemesini sırt tarafı yukarı ve kuyruk ucu aşağı gelecek şekilde 35 ° eğime (Şekil 1H) yerleştirin. Doku yüzeyindeki bol suyu çıkarmak için emici bir filtre kağıdı kullanın (Şekil 1H).
- Erimiş agaroz jeli, bel genişlemesini içeren Petri kabına yavaşça dökün (Şekil 1I).
NOT: Çok hızlı dökmeyin, aksi takdirde jelde kabarcıklar birikir. - Jeli mümkün olan en kısa sürede soğutmak için yukarıdaki Petri kabını buzlu su karışımına yerleştirin, bu da hücrelerin aktivitesini korumaya elverişlidir.
- Jeli 15 mm x 10 mm x 10 mm'lik bir küp halinde kesin ve süper yapıştırıcı ile numune diskine monte edin (Şekil 1J).
- Dilimleme
- Numune diskini önceden dondurulmuş kesme tepsisine yerleştirin, ardından buz gibi kesme solüsyonunu dökün (Şekil 1K). Kesme tepsisine sürekli olarak %95 CO2 ve %5O2 ile köpürtün.
- Vibratom parametrelerini ayarlayın: kalınlık: 350 μm; hız: 0.14-0.16 mm/s, genlik: 1.0 mm ve titreşim frekansı: 85 Hz.
- Hayvan başına 2-3 uygun dilim hasat edin. Hayvan başına 5-6 hücre aralığı ile dilim başına 1-2 sağlıklı FG+ motor nöron kaydedin.
- Kuluçka
- Bir dilimi kırpmak için kapak sürgülü cımbız kullanın (Şekil 1L) ve sürekli oksijenli ACSF ile dolu inkübasyon odasına yerleştirin. İnkübasyon odasını 30 dakika boyunca 32 °C'de bir su banyosuna yerleştirin ve ardından kayıttan önce 30 dakika daha oda sıcaklığında (RT) inkübe etmeye devam edin.
NOT: Anesteziden ilk dilimin alınmasına kadar yukarıdaki prosedürler, hücrelerin canlılığını mümkün olduğunca korumak için 20-30 dakika içinde tamamlanmalıdır. Her dilimdeki motor nöronlar yaklaşık 6-7 saat canlılıklarını koruyabilirler.
- Bir dilimi kırpmak için kapak sürgülü cımbız kullanın (Şekil 1L) ve sürekli oksijenli ACSF ile dolu inkübasyon odasına yerleştirin. İnkübasyon odasını 30 dakika boyunca 32 °C'de bir su banyosuna yerleştirin ve ardından kayıttan önce 30 dakika daha oda sıcaklığında (RT) inkübe etmeye devam edin.
2. SCS ile yama-kelepçe kaydı (Şekil 2)
- Hazırlık
- Kayıt odasını yaklaşık 1-2 mL/dk hızında sürekli kabarcıklı ACSF ile perfüze edin. Peristaltik pompa üzerindeki kontrol paneli aracılığıyla akış hızını ayrı ayrı ayarlayın.
- Kayıt odasına bir dilim yerleştirin. Dilimi yerinde sıkıca sabitlemek için naylon ipliklere sahip U şeklindeki platin teli kullanın.
- Dilimi gözlemlemek için bir kızılötesi diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (IR-DIC) kullanın. 4x objektif merceğin altında, sırt kökünün uzunluğunun yaklaşık 1 mm olduğunu onaylayın. Sırt kökünün parankimmaya girdiği alanı bulun, ardından merkezi görüş alanını bu bölgeye taşıyın.
- Darbe üretecini özel yapım elektrotlarla bağlayın (Şekil 2A).
- SCS yapılandırması
- SCS'nin anotunu mikromanipülasyon sistemi aracılığıyla dorsal orta hattın yakınına yerleştirin (Şekil 2B).
- SCS'nin katotunu mikromanipülasyon sistemi aracılığıyla dorsal kök giriş bölgesinin (DREZ) yakınına yerleştirin (Şekil 2B).
- Hücre hedefleme ve görüntüleme
- IR-DIC'yi 10x objektif lensle kabaca motor kolonun dorsolateral bölgesini bulun, çoğu motor nöronun bulunduğu yeri bulun. Ardından, merkezi görüş alanını bu alana taşıyın.
- Pürüzsüz ve parlak bir yüzeye ve görünmez çekirdeklere sahip sağlıklı bir nöron bulmak için 60x objektif merceğe geçin (Şekil 2C,F).
- IR yoğunluğunu hafifçe azaltın ve floresan ışık kaynağını açın. Uygun bir FG pozitif (FG+) motor nöron seçmek için ışık filtresini geniş bantlı ultraviyole uyarma filtresine (Şekil 2D, G) değiştirin (Şekil 2E, H).
- Dorsal köke 1x motor eşik stimülasyonu uygulamak için emme elektrotları kullanın. Motor nöronlarda uyarılmış bir aksiyon potansiyeli tespit edilirse (Ek Şekil 3), dorsal kökün aktivitesinin sağlam olduğunu doğrular. Değilse, bu dilim atılmalıdır.
- Yama kelepçesi kaydı
- Mikropipeti hücre içi solüsyonla doldurun ve elektrot tutucusuna yerleştirin. Pipeti ACSF banyosuna indirmek için mikromanipülasyon sistemini kullanın. Pipet direnci 5-8 MΩ arasında değişir.
- Tozu ve hücre kalıntılarını üflemek için pipete az miktarda pozitif basınç uygulayın.
- Hücreye yaklaşmak için elektrodu indirin. Pipet FG+ nöronun yüzeyine dokunduğunda, uç seviyesinde zarın küçük bir girintisi görünür hale gelir. Pozitif basıncı serbest bırakın.
- Ardından, bir şırınga kullanarak pipete az miktarda negatif basınç uygulayın. Bu, hücre zarını cam pipetle temas ettiren az miktarda emme oluşturur. Direnç değeri gigaohm'a (>1 GΩ) yükselene kadar her zaman yazılım arayüzündeki toplam dirence dikkat edin. Daha sonra gigaseal oluşturulur.
- Membran potansiyelini -70 mV'de sıkıştırın, ardından amplifikatörün yazılım arayüzündeki hızlı kapasitans dengeleme düğmesine basın. Hücre zarını yırtmak için yavaşça geçici olarak negatif bir basınç uygulayın, ardından amplifikatörün yazılım arayüzündeki yavaş kapasitans dengeleme düğmesine basın. Bu noktada, iyi bir tam hücre konfigürasyonu elde edilir.
- Yazılım arayüzündeki IC düğmesine tıklayarak akım kelepçesi moduna geçin ve dinlenme membran potansiyelini (RMP) kaydedin.
- SCS'yi 1-10 mA genlik ile 1-2 saniye boyunca uygulayın, darbe genişliği ve frekansı sırasıyla 210 μs ve 40 Hz'de sabitlenir. İlk AP gözlenene kadar stimülasyon genliğini yavaşça artırarak motor eşiği belirleyin.
- Akım kelepçesi modunda10,11,12 reobaz etrafına 5 s'lik bir depolarize akım enjeksiyonu kullanarak gecikmeli ve ani ateşleme motor nöronlarını ayırt edin. Anında ateşleme motor nöronları: Düşük reobaz, kararlı ateşleme frekansı ile anında ve tekrarlayan ateşlemeye neden olabilir; Gecikmeli ateşleme motor nöronları: Yüksek reobaz, hızlanan bir ateşleme hızı ile tekrarlayan ateşleme için gecikmeli bir başlangıca neden olabilir (Şekil 3).
- SCS kapatıldığında, kendiliğinden AP'lerin ateşlenmesini yakalamak için membran potansiyelini kaydetmeye devam edin.
- SCS açık ve kapalıyken uyarıcı postsinaptik akım (EPSC) için voltaj-kelepçe kayıtları voltaj-kelepçe kayıtları gerçekleştirin. Stimülasyon parametresi 1x motor eşik, 210 μs, 2 Hz'dir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnce işlem sırasında titiz düşük sıcaklık bakımı sayesinde (Ek Şekil 1, Ek Şekil 2 ve Şekil 1), hücre canlılığı sonraki elektrofizyolojik kayıtları gerçekleştirmek için yeterince iyiydi. Klinik senaryoyu mümkün olduğunca simüle etmek için, SCS katotunu ve anodu sırasıyla dorsal orta hat ve DREZ'in yakınına yerleştirmek için mikromanipülasyon kullandık (Şekil 2), bu da dorsal kornadaki nöral sinyali başlatarak motor kolonun dorsolateral bölgesindeki motor nöronlara yayılabilir. Bu çalışmada, 20-50 μm çapındaki motor nöronları bulmak için FG kullandık. Şekil 2D, G'de gösterildiği gibi, sağlıklı bir FG+ nöronunun, omurilik devresinin terminali olan bir motor nöron olduğunu güvenle doğruladık. Bu etiketleme yöntemi, SCS'nin ateşleme düzenini nasıl etkilediğini incelemenin yolunu açtı. Gecikmiş ve ani ateşleme motor nöronlarının elektrofizyolojik özellikleri Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2'de listelenmiştir. Aktif ve pasif özellikleri hesaplama yöntemleri Ek Dosya 1'de verilmiştir.
SCS, spinal dilime darbeli bir alternatif elektrik alanı verdiğinde, membran potansiyelinin yanıtını kaydetmek için önce akım-kelepçe modunu kullandık (Şekil 4). Stimülasyon genliğini 1/3 motor eşikli bir adımla kademeli olarak arttırdığımızda (Şekil 4B,C), membran potansiyeli de onunla birlikte yükseldi, ancak sadece 1x motor eşiği Aps ortaya çıkarabildi (Şekil 4D). Şekil 4D, yaklaşık her 10-20 darbenin bir AP ortaya çıkarabileceğini göstermektedir, bu da SCS genliğine kesin bir AP yanıtı düzenliliğinin mevcut olabileceğini gösterir.
SCS kapatıldıktan sonra membran potansiyelini kaydetmeye devam ettik. Şekil 5 , membran potansiyelinin hafifçe -60 mV'a yükseldiğini ve nöronun bir dizi spontan AP'yi ateşlediğini gösterdi. Bu spontan AP'ler kısa bir süre (30-40 s) sürer, daha sonra membran potansiyeli -65 mV'a geri döner, bu da SCS'nin hücre uyarılabilirliğini geçici olarak artırabileceğini gösterir.
Ardından, SCS açık ve kapalıyken EPSC için voltaj-kelepçe kayıtları kullandık (Şekil 6). Her SCS darbesinden sonra, uyarılmış bir EPSC tespit edilebilir. Uyaran artefaktı ile EPSC arasındaki gecikme 2.64 ± 0.38 ms idi (Ek Şekil 4). Uyarılmış EPSC'lerin genliği 35.14 ± 12.73 pA idi (Ek Şekil 4). Uyarılmış EPSC'lerin frekansı SCS frekansı ile tutarlıdır. Pasif yük dengelemesi çıkarıldıktan sonra, uyarılmış EPSC, 1x motor eşik stimülasyonunu takiben canlı bir motor nöronda gözlemlenebilir (Ek Şekil 5A). Aynı hücrede perfüzyon 2 saat durdurulduktan sonra stimülasyon polaritesi tersine çevrildi. Stimülasyon, uyarılan EPSC'nin bir artefakt olmadığını doğrulayan herhangi bir EPSC'yi indüklemedi (Ek Şekil 5B).
Şekil 1: Omurilik diseksiyonu ve dilimleme . (A) Omurgayı sırasıyla anterior superior iliak omurgadan (yaklaşık L4 vertebral seviyede) ve torasik kolonun eğrilik kayma noktasından (yaklaşık T6 vertebral seviyede) kesin. (B) İzole edilmiş omurgayı, dorsal tarafı yukarı ve rostral ucu operatöre yakın olacak şekilde derhal anatomik tepsiye aktarın. Anatomik tepsiyi sürekli oksijenli buz gibi kesme solüsyonu ile doldurun. (C) Rostral uçtan her iki tarafa laminektomi yapın. (D) Hücreler ve oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) arasında besin alımına elverişli olan dorsal dura materyali kesin. (E) Sinir kökünü dikkatlice kesin. (F) Ventral dura materini kesin. (G) Lomber genişlemeyi 6-7 mm uzunluğa ayırın. (H) Lomber genişlemeyi sırt tarafı yukarı ve kuyruk ucu aşağı gelecek şekilde 35 ° eğime yerleştirin. Doku yüzeyindeki bol suyu çıkarmak için emici bir filtre kağıdı kullanın. (I) Erimiş agaroz jeli petri kabına yavaşça dökün. (J) Jeli bir küp halinde kesin ve süper yapıştırıcı ile numune diskine monte edin. (K) Numune diskini kesme tepsisine yerleştirin, ardından buz gibi kesme solüsyonunu dökün. (L) Bel genişlemesinde bir omurga dilimi örneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Omurilik stimülasyonu (SCS) konfigürasyonu ve motor nöron görüntüleme. (A) Özel yapım elektrotlara sahip darbe üreteci, genliği, darbe genişliğini ve frekansı ayrı ayrı ayarlayabilir. Giriş, bir elektrot temasının boyutsal spesifikasyonunun 800 μm x 500 μm x 300 μm olduğunu gösterdi. (B) Anot ve katodu mikromanipülasyon sistemi aracılığıyla sırasıyla dorsal orta hat ve dorsal kök giriş bölgesinin (DREZ) yakınına yerleştirin. Floro-Altın pozitif (FG+) motor nöronları sıkıştırmak için kayıt pipetini motor kolonunun dorsolateral bölgesine yerleştirin. (C) Kızılötesi diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (IR-DIC) görüntüleme (60x) ile sağlıklı bir anında ateşleme motor nöronu. (D) Sadece floresan görüntüleme (60x) ile aynı nöron, parlayan Floro-Altın (FG) parçacıkları, bu nöronun bir motor nöron olduğunu temsil eder. (E) FG+ motor nöronunda IR-DIC ve floresansın birleştirilmiş görüntüsü. (F-H) IR-DIC görüntüleme (60x) ile sağlıklı bir gecikmeli ateşleme motor nöronu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 5 s'lik depolarize edici akım enjeksiyonu kullanarak gecikmeli ve ani ateşleme motor nöronlarını ayırt edin. (A) Anında ateşleme motor nöronları: Düşük reobaz, kararlı ateşleme frekansı ile ani ve tekrarlayan ateşlemeye neden olabilir; (B) Gecikmeli ateşleme motor nöronları: Yüksek reobaz, hızlanan bir ateşleme hızı ile tekrarlayan ateşleme için gecikmeli bir başlangıca neden olabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Omurilik stimülasyonu (SCS), motor nöronlarda ateşlenen aksiyon potansiyellerini (AP'ler) ortaya çıkardı . (A) Herhangi bir stimülasyon uygulanmadığında, dinlenme membran potansiyeli (RMP) -65 mV idi. (B) 1/3x motor eşik uyaranı AP'leri ortaya çıkaramaz. (C) 2/3x motor eşik uyaranı AP'leri ortaya çıkaramaz. (D) 1x motor eşik uyaranı AP'leri ortaya çıkarabilir ve her 10-20 darbe bir AP ortaya çıkarabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Omurilik stimülasyonundan (SCS) sonra ateşlenen spontan aksiyon potansiyelleri (AP'ler). SCS kapatıldıktan sonra, nöron kısa bir süre (30-40 s) için bir dizi spontan AP ateşledi, ardından dinlenme membran potansiyeli (RMP) -65 mV'ye geri döndü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Omurilik stimülasyonu (SCS) parametresi ve uyarılmış uyarıcı postsinaptik akımın (EPSC) gösterimi. (A) SCS parametresinin gösterimi; (B,C) Tek bir stimülasyon darbesini (1x motor eşik stimülasyonu) takiben, uyarılmış EPSC gözlenebilir; (D) Pasif yük dengelemesi çıkarıldıktan sonra, EPSC'nin gecikmesi ve genliği hesaplanabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Enstrüman hazırlığı. (A) Perfüzyon tepsisi: Perfüzyondan 10 dakika önce, silika jel ile doldurulmuş 10 cm'lik petri kabına kırılmış buz koyun. (B) Anatomik tepsi: Kurbandan önceki gece, silika jel ile doldurulmuş kendi yaptığınız anatomik tepsiyi -80 °C buzdolabına koyun. (C) Kesme tepsisi: Kurban kesmeden önceki gece, su bantlı kesme tepsisini -80 °C buzdolabına koyun. (D) Agaroz döküm eğimi: perfüzyondan 30 dakika önce, 35 mm'lik bir petri kabının ortasına taban plakaları ile 35°'lik bir agaroz eğimi yerleştirin. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: İntrakardiyal perfüzyon. (A) Ksifoid işlemini kaldırın. (B) Göğsü açmak ve kalbi ortaya çıkarmak için ksifoid sürecinin her iki tarafı boyunca sternumu kesin. İç torasik damarlara zarar vermemeye dikkat edin, aksi takdirde büyük kanama tüm çalışma alanını doldurur ve operatörün ventrikül apeksi veya sağ atriyumu tanımlamasını engeller. (C) Perfüzyon için sol ventrikül tepesine 22 G'lik bir iğne yerleştirin ve sıvı çıkışı için sağ atriyumu kesin. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: Dorsal kök aktivitesinin doğrulanması. Dorsal köke 1x motor eşik stimülasyonu uygulamak için emme elektrotları kullanın. Motor nöronlarda uyarılmış bir aksiyon potansiyeli tespit edilirse, dorsal kökün aktivitesinin sağlam olduğunu doğrulayabiliriz. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 4: SCS açıkken uyarılan EPSC'lerin gecikmesi ve genliği. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 5: Uyarılmış EPSC'nin geçerliliğinin gösterilmesi. (A) Pasif yük dengelemesi çıkarıldıktan sonra 1x motor eşik stimülasyonunu takiben, uyarılmış EPSC canlı bir motor nöronda gözlemlenebilir; (B) Aynı hücrede perfüzyonu 2 saat durdurduktan sonra, stimülasyon polaritesi tersine çevrildi, 1x motor eşik stimülasyonu herhangi bir EPSC'yi indüklemedi, bu da uyarılmış EPSC'nin bir artefakt olmadığını doğruladı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Aktif ve pasif özelliklerin hesaplama yöntemleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Motor nöronların pasif özellikleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 2: Motor nöronların aktif özellikleri Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SCS tarafından modüle edilen hareket bilgisi sonunda motor nöronlara yakınsar. Bu nedenle, motor nöronları araştırma hedefi olarak almak, çalışma tasarımını basitleştirebilir ve SKS'nin nöromodülasyon mekanizmasını daha doğrudan ortaya çıkarabilir. Farklı uyaran özelliklerini ve hücresel tepkileri aynı anda kaydetmek için, bir yama kelepçesi, elektrofizyolojik özellikleri tek hücre ölçeğinde incelemek için iyi bir yöntemdir. Bununla birlikte, hücre canlılığının nasıl korunacağı, omuriliğin kemik yapısından nasıl hızlı bir şekilde ayrılacağı ve AP'leri başarılı bir şekilde indüklemek için SCS'nin nasıl kullanılacağı dahil olmak üzere hala bazı zorluklar vardır. Bu nedenle, bu çalışma, araştırmacıların temel operatif becerileri hızlı bir şekilde kavramalarına, bazı olası tuzaklardan kaçınmalarına ve mümkün olduğunca erken metodolojiden ziyade çalışma tasarımına odaklanmalarına yardımcı olmayı amaçlamaktadır.
İyi bir hücre canlılığı elde etmek için, her zaman aşağıdaki ayrıntılara dikkat edilmelidir: (1) Omuriliği buz gibi soğuk sıcaklıkta tutmak çok önemlidir, çünkü düşük sıcaklık hücre ölümünü engelleyebilir ve metabolik hızı yavaşlatabilir, bu da nöronu perfüzyon, diseksiyon ve dilimleme sırasında mekanik hasardan koruyabilir13; (2) Dura mater'in mikro makasla hassas bir şekilde çıkarılması, çevredeki çözeltilerden nöronal besin alımını artırabilir. Dura mater'i asla doğrudan soymayın; Aksi takdirde, omurilik ciddi şekilde hasar görecektir. Ek olarak, dura mater'i temizlemeyi unutursanız, sonraki dilimleme işlemi zor olabilir, çünkü bıçak dura mater'i tamamen kesmeyebilir ve daha sonra kalan omuriliği agarozdan koparabilir, bu da dilimlemenin başarısız olmasına neden olabilir. (3) Geleneksel enine dilim ile karşılaştırıldığında, eğik dilimler gri madde alanını arttırır ve tek bir dilimde daha fazla FG + motor nöron bulabilirsiniz9. (4) Omurilik tek başına beyin gibi numune diskine sıkıca sabitlenemediğinden, onu agaroz jele gömmek, hücre canlılığını azaltmadan bu sorunu çözmede etkilidir. Geleneksel agaroz (jel noktası 38-43 °C) yerine düşük erime noktalı agaroz (jel noktası 26-30 °C) kullanmanızı öneririz, çünkü yüksek sıcaklık hücre canlılığına zarar verebilir. (5) U-şekilli platin telin iki naylon ipliği arasındaki mesafenin 1 ila 1,5 mm olmasını öneririz, çünkü gevşek iplikler omuriliği sıkıca hareketsiz hale getiremez ve yoğun iplikler hücreyi ezebilir.
Temel araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bipolar kanca elektrotları gibi geleneksel stimülasyon cihazlarıyla karşılaştırıldığında, bu çalışmadaki SCS elektrotu önceki klinik çalışmamızdan14 ve temel araştırmamızdan15 türetilmiştir. SCS teslimatları, çeşitli parametre ayarlama boyutları sağlayan darbeli alternatif elektrik stimülasyonu. Bu SCS cihazı ayrıca doku elektrolizini önlemek için bir yük dengesi işlevine sahiptir ve nöral dokuya doğrudan temas etmez; bu nedenle, bu SCS, in vivo uygulamalar için iyi bir güvenliğe sahiptir.
SCS tedavisinden sonra, motor nöronların spontan AP'leri aşağıdaki nedenlere bağlanabilir: (1) SCS, yükün hücre gövdesinde ve nöronların aksonal kollikulusunda birikmesine neden olarak RMP16'nın artmasına neden olur. Bu fenomen, SCS'nin, Nav 1.1 17, K v 2.1 18 veya Cav 2.3 19 gibi SCS'den sonra iyon kanallarının iletkenliğinin değişmesiyle ilişkili olabilecek nöronun uyarılabilirliğini artırabileceğini gösterir. (2) SCS, motor nöronlara propriyoseptif geri bildirimi kolaylaştırmak için dorsal GABAerjik nöronları aktive edebilir. Duyusal nöronlar ve motor nöronlar arasında nöral iletimin sürekli olarak var olabileceğini ve SCS sonrası motor nöronlarda spontan AP'lere yol açabileceğini öne sürüyoruz. Spontan AP'ler, sensorimotor davranışları yürütmek için içsel bir hazır olma durumunu koruyabilir20. Bu nedenle, spontan AP'lerin aktive edilmesi veya inhibe edilmesi, spinal nörolojik hastalıkların tedavisi için faydalı olabilir.
Bildiğimiz gibi, in vivo elektrofizyolojik kayıt, elektrik alanının doğal dağılımı ve elektrotların yerleştirilmesi altında elektrofizyolojik yanıtı tespit etmek için daha iyidir. Ayrıca, in vivo motonöron kayıtları, motonöron kimliğinin tanımlanmasına izin verir. Bu, kas lifi kuvveti ölçümü21 ile birlikte motor aksonların antidromik tanımlanması yoluyla yapılabilir. Ancak in vivo omurilik kayıtları aşağıdaki dezavantajlara da sahiptir: (1) Motor nöron, omuriliğin dorsal yüzeyinden 2-3 mm uzakta bulunur, en gelişmiş iki fotonlu konfokal görüntüleme kullanılarak bile, gözlem derinliği sadece 500-800 μm'dir, bu nedenle mevcut yöntemleri kullanarak bunları in vivo olarak optik olarak gözlemlemek zordur. Bu nedenle, tek bir motor nöronu in vivo olarak tam olarak kenetlemek istiyorsak, cam pipetin görünmez motor nörona ulaşmak için dorsal kolondan geçmesi gerekir; In vivo yama kelepçesi yalnızca "kör" bir şekilde gerçekleştirilebilir, bu da önemli bir belirsizlik ve başarısızlık oranına neden olur. (2) İn vivo yama kelepçesi dışında, silikon elektrot kayıtları, Utah dizisi veya Neuropixels elektrotu gibi alternatif yöntem olabilir. Bununla birlikte, silikon elektrotlar tarafından kaydedilen sinyaller, tek aksiyon potansiyelinden ziyade çoğunlukla bileşik aksiyon potansiyelidir. Tek nöronların aktivitesi spike sıralama algoritmaları kullanılarak çözülmüş olsa da, sıralama algoritmalarının doğruluğu ve güvenilirliği hala iyileştirilmelidir.
İn vivo kayıtlarla karşılaştırıldığında, in vitro in vivo'ya karşı en büyük faydası, SCS tarafından aktive edilen sinaptik yolların benzersiz bir şekilde anlaşılmasını sağlayan voltaj kelepçesinin kullanılmasıdır. Ayrıca, canlı görüntüleme araçlarının kullanımına da izin verecektir. SCS'nin GABA ve glutamat gibi nörotransmiterlerin üst düzey nöronlardan motor nöronlara salınmasını indüklediğini ve bunun da genel bir uyarıcı EPSC yanıtı ile sonuçlandığını tahmin ediyoruz7. Bu nedenle, yaklaşmakta olan araştırmamızda, pre-motor nöronlardan veya internöronlardan inhibitör ve uyarıcı nörotransmitter salınım modellerini açıklığa kavuşturmak için SCS tarafından indüklenen IPSC, mini EPSC (mEPSC) ve uyarılmış EPSC'nin tespitini dahil edeceğiz. İn vitro stimülasyonun da bazı sınırlamaları olduğunu tamamen kabul ettik: (1) Omuriliğin uzun menzilli uzunlamasına devresi bozulur, bu da motor korteksten veya alt ekstremiteden gelen bilgilerin kaybolmasına neden olur; (2) İn vitro stimülasyon sırasında elektrik alanlarının dağılımı, in vivo stimülasyondakinden farklı olabilir. Bu çalışmada, AP'ler için aktivasyon eşiği (yaklaşık olarak miliamper cinsinden), in vivo deneyinkinden (yaklaşık olarak mikroamper cinsinden) çok daha yüksekti15; Bunun nedeni, kayıt odasındaki ACSF çözeltisinin hacim kapasitesinin doğal durumdaki beyin omurilik sıvısından çok daha yüksek olmasıydı ve matematiksel teori, yüksek iletkenliğe sahip malzemelerde elektrik alanının daha hızlı zayıfladığını destekliyor22. Bu nedenle, akımın çoğu banyo çözeltisi tarafından emildi ve elektrik alanının sadece küçük bir kısmının sinir köklerine yayılabileceğini tahmin ediyoruz.
Bu nedenle, in vivo stimülasyon ve in vitro stimülasyonun avantaj ve dezavantajları göz önüne alındığında, yenidoğan kemirgenlerinde SKS'nin sinaptik yapısını ve/veya hücresel etkilerini incelemek için in vitro yama-klempin avantajlı bir yöntem olduğu sonucuna varılabilir.
Klinik uygulamada, elektrot omuriliğin veya sinir kökünün yüzeyini doğrudan kasmaz23. Bunun yerine, sinirlerin aktivitesini dolaylı olarak etkilemek için elektrot tarafından üretilen elektrik alan radyasyonuna dayanır1. Çoklu çalışmalar 1,23,24, belirli bir kası uyarmak için optimal seçiciliği elde etmek için SCS'nin katot temasının dorsal köke veya giriş bölgesine (DREZ) mümkün olduğunca yakın yerleştirilmesi gerektiğini doğrulamıştır. Elektrot ile sinir kökü arasındaki mesafenin arttırılması, stimülasyonun özgüllüğünü zayıflatacaktır. Bu nedenle, katodu doğrudan sinir köküne veya omuriliğe temas etmek yerine doğrudan DREZ'in yakınına yerleştiriyoruz.
Dorsal kökün afferent lifleri önce duyusal nöronlara, daha sonra internöronlara ve motor nöronlara projekte olur. Enine çıkıntı devrelerinin yanı sıra, rostral ve kaudal uca doğru çıkıntı yapan devreler de vardır. Örneğin, tibialis anterior kasına karşılık gelen motor nöronlar birden fazla seviyede bulunabilir25. Bu nedenle, eğik hazırlık enine çıkıntı devrelerini kesebilse de, yine de enine çıkıntılı olmayan lifleri koruyacak ve motor öncesi duyusal devrenin incelenmesine izin verecektir. Eğik ve enine preparasyona ek olarak, uzunlamasına preparasyon, dorsal kökten motor nöronlara kadar devreleri daha iyi korumak ve omurilik devrelerinin birden fazla segmentte etkili bir şekilde tutulmasını sağlamak için belirgin avantajlar sunar26, bu da gerçek fizyolojik koşulların daha yakın bir temsilini sağlar.
Simülasyon araştırmasınagöre 6,27,28, SCS esas olarak Ia, Ib ve II afferent lifleri dahil olmak üzere alt ekstremite hareketini eski haline getirmek için proprioseptif afferent lifleri aktive eder. Bununla birlikte, bu çalışmada, SCS tarafından hangi tür liflerin özel olarak aktive edildiğini güvenle doğrulayamayız. Benzer bir modelin in vitro yama kelepçesinde de mevcut olabileceğini düşünüyoruz. Bu konuyu matematiksel modelleme ve simülasyon yaparak ve devam eden çalışmalarımıza dahil ederek ele alacağız.
Sonuç olarak, bu protokol araştırmacıların çalışma becerilerini geliştirmelerine ve SCS'nin elektriksel mekanizmasını tek hücre ölçeğinde araştırmak için yama-kelepçe kayıtlarını ve SCS'yi birleştirmenin temellerini kavramalarına yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiç kimse
Acknowledgments
Bu çalışma, Genç Akademisyenler için Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (52207254 ve 82301657) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Fonu (2022M711833) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
