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Neuroscience

Préparation ex vivo d’une tranche de moelle épinière pour l’enregistrement d’un patch-clamp de cellules entières dans les motoneurones lors d’une stimulation de la moelle épinière

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65385
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,2
1National Engineering Research Center of Neuromodulation, School of Aerospace Engineering, Tsinghua University, 2IDG/McGovern Institute for Brain Research, Tsinghua University, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

Summary

Ce protocole décrit une méthode utilisant un patch-clamp pour étudier les réponses électriques des motoneurones à la stimulation de la moelle épinière (SCS) avec une résolution spatio-temporelle élevée, ce qui peut aider les chercheurs à améliorer leurs compétences en séparant la moelle épinière et en maintenant la viabilité cellulaire simultanément.

Abstract

La stimulation de la moelle épinière (SCS) peut restaurer efficacement la fonction locomotrice après une lésion de la moelle épinière (LME). Étant donné que les motoneurones sont l’unité finale pour exécuter les comportements sensori-moteurs, l’étude directe des réponses électriques des motoneurones avec SCS peut nous aider à comprendre la logique sous-jacente de la modulation motrice spinale. Pour enregistrer simultanément diverses caractéristiques de stimulus et réponses cellulaires, un patch-clamp est une bonne méthode pour étudier les caractéristiques électrophysiologiques à l’échelle d’une seule cellule. Cependant, il existe encore des difficultés complexes pour atteindre cet objectif, notamment le maintien de la viabilité cellulaire, la séparation rapide de la moelle épinière de la structure osseuse et l’utilisation du SCS pour induire avec succès des potentiels d’action. Ici, nous présentons un protocole détaillé utilisant patch-clamp pour étudier les réponses électriques des motoneurones à la SCS avec une résolution spatio-temporelle élevée, ce qui peut aider les chercheurs à améliorer leurs compétences dans la séparation de la moelle épinière et le maintien de la viabilité cellulaire en même temps pour étudier en douceur le mécanisme électrique de la SCS sur le motoneurone et éviter les essais et les erreurs inutiles.

Introduction

La stimulation de la moelle épinière (SCS) peut restaurer efficacement la fonction locomotrice après une lésion de la moelle épinière (LME). Andreas Rowald et al. ont rapporté que le SCS permet la fonction locomotrice et abdominale des membres inférieurs en un seul jour1. L’exploration du mécanisme biologique de la SCS pour la récupération locomotrice est un domaine de recherche critique et en vogue pour le développement d’une stratégie SCS plus précise. Par exemple, l’équipe de Grégoire Courtine a démontré que l’interneurone excitateur Vsx2 et les neurones Hoxa10 de la moelle épinière sont les neurones clés de la réponse au SCS, et que la neuromodulation spécifique aux cellules est réalisable pour restaurer la capacité de marche du rat après une lésion SCI2. Cependant, peu d’études se concentrent sur le mécanisme électrique du SCS à l’échelle d’une seule cellule. Bien qu’il soit bien connu que le stimulus à courant continu supraseuil peut provoquer les potentiels d’action (PA) dans l’expérience classique du calmar 3,4,5, la façon dont la stimulation électrique alternée pulsée, telle que SCS, affecte la génération du signal moteur n’est pas encore claire.

Compte tenu de la complexité des circuits neuronaux intraspinaux, une sélection appropriée pour la population cellulaire est importante pour étudier le mécanisme électrique du SCS. Bien que le SCS restaure la fonction motrice en activant la voie proprioceptive6, les motoneurones sont l’unité finale pour exécuter la commande motrice, dérivée de l’intégration de l’entrée afférente de l’information de proprioception7. Par conséquent, l’étude directe des caractéristiques électriques des motoneurones atteints de SCS peut nous aider à comprendre la logique sous-jacente de la modulation motrice spinale.

Comme nous le savons, le patch-clamp est la méthode de référence pour l’enregistrement électrophysiologique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle extrêmement élevée8. Par conséquent, cette étude décrit une méthode utilisant une pince de patch pour étudier les réponses électriques des motoneurones au SCS. Par rapport au patch-clamp cérébral9, le patch-clamp de la moelle épinière est plus difficile pour les raisons suivantes : (1) La moelle épinière est protégée par le canal vertébral de petit volume, ce qui nécessite une micromanipulation très fine et un entretien rigoureux à froid glacé pour obtenir une meilleure viabilité cellulaire. (2) Parce que la moelle épinière est trop mince pour être fixée sur le plateau de coupe, elle doit être immergée dans de l’agarose à bas point de fusion et taillée après solidification.

Par conséquent, cette méthode fournit des détails techniques pour disséquer la moelle épinière et maintenir la viabilité cellulaire en même temps afin d’étudier en douceur le mécanisme électrique de la SCS sur les motoneurones et d’éviter les essais et les erreurs inutiles.

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Protocol

Le Comité institutionnel sur les soins et l’utilisation des animaux a approuvé toutes les expériences sur les animaux et les études ont été menées conformément aux réglementations pertinentes en matière de bien-être animal.

1. Préparation des animaux

  1. Animaux
    1. Informations sur le logement : Hébergez des rats Sprague-Dawley mâles (postnatal 10-14 jours, P10-P14) dans un environnement spécifique exempt d’agents pathogènes.
      REMARQUE : Les conditions ambiantes ont été maintenues à 20 °C ± 2 °C, humidité : 50 % à 60 %, avec un cycle lumière/obscurité de 12 h. Les animaux avaient libre accès à la nourriture et à l’eau.
    2. Marquer les motoneurones rétrogradement : Injecter du Fluoro-Gold (FG) dans le tibial antérieur et le muscle gastrocnémien bilatéral (2 % dans une solution saline stérile, 50 μL par muscle) pour marquer rétrogradablement les motoneurones 2 jours avant le sacrifice.
  2. Solutions
    1. Préparer la solution de coupe : Mélanger 120 mM de chlorure de choline, 2,6 mM de KCl, 26 mM de NaHCO 3, 1,25 mM de NaH 2 PO4, 0,5 mM de CaCl 2, 7 mM de MgCl2, 1,3 mM d’acide ascorbique, 15 mM de glucose. Pré-bullez la solution avec 95 % d’O 2 et 5 % de CO2 (ajustez à un pH de 7,4 avec KOH) pendant 30 minutes avant la dissection et le tranchage. Refroidissez la solution avec de la glace pilée.
    2. Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) : Mélanger 126 mM de NaCl, 3 mM de KCl, 1,2 mM de NaH2PO4 ; 1,3 mM de MgCl 2, 2,4 mM de CaCl2, 26 mM de NaHCO3 et 10 mM de glucose. Pré-buller la solution avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2 pendant 30 min avant l’incubation.
    3. Préparer la solution intracellulaire : Mélanger 126 mM de K-gluconate, 2 mM de KCl, 2 mM de MgCl 2, 0,2 mM d’EGTA, 10 mM d’HEPES, 4 mM de Na 2 ATP, 0,4 mMde Na2 GTP, 10 mM de K-phosphocréatine et 0,5 % de neurobiotine (pH 7,25 et 305 mOsm/Kg). Refroidissez la solution avec de la glace pilée.
    4. Préparez le gel d’agarose à bas point de fusion : Dissoudre 4 g d’agarose dans 100 mL de solution de coupe et utiliser un rotor d’agitation magnétique pour le dissoudre complètement. À 30 min avant l’enrobage, chauffer l’agarose à bas point de fusion dans le four à micro-ondes à haute puissance pendant 1 min, puis la transférer dans un bain-marie à 39 °C pour maintenir l’état liquide.
  3. Préparation de l’instrument
    1. Placer la glace pilée sur le plateau de perfusion (figure supplémentaire 1A) 10 minutes avant la perfusion. Placez le plateau anatomique (figure supplémentaire 1B) et le plateau de coupe (figure supplémentaire 1C) avec une bande d’eau à -80 °C pendant la nuit à l’avance.
    2. Placez la chambre d’incubation avec un treillis en nylon dans le four à 45 °C pendant la nuit à l’avance.
    3. Utiliser de l’agarose à bas point de fusion pour préfabriquer une pente de 35° et une plate-forme de 2 mm d’épaisseur (figure supplémentaire 1D). Après la solidification du gel, placez-les au centre d’une boîte de Pétri de 35 mm pour soutenir la moelle épinière lors des prochaines procédures à venir.
  4. Perfusion intracardique
    1. Anesthésier les rats avec 2,5 % de tribromoéthanol (160 μL/10 g) par injection intrapéritonéale. Assurez-vous que les rats sont complètement anesthésiés en vérifiant l’absence de réponse aux stimuli externes, tels qu’un léger pincement de l’orteil.
    2. Lorsque l’anesthésie correcte est confirmée, placez les rats en décubitus dorsal et immobilisez-les dans la boîte de Pétri remplie de gel de silice.
    3. Coupez une incision cutanée longitudinale de 5 mm dans le sens caudal jusqu’à l’apophyse xiphoïde, puis élargissez complètement l’espace sous-cutané. Coupez une incision cutanée longitudinale de 2 cm le long de la ligne médiane ventrale pour exposer complètement la paroi thoracique externe, en commençant par l’incision mentionnée ci-dessus et en terminant par le haut de la poitrine.
    4. Utilisez une pince à épiler dentée pour soulever le xiphoïde (figure supplémentaire 2A), puis utilisez des ciseaux fins pour couper le diaphragme. Coupez le sternum le long des deux côtés de l’apophyse xiphoïde pour ouvrir la poitrine et exposer le cœur (figure supplémentaire 2B).
      REMARQUE : Veillez à préserver les vaisseaux thoraciques internes des deux côtés ; sinon, cela peut provoquer des saignements massifs.
    5. Utilisez une pince à épiler sans dents pour soulever le ventricule gauche. Insérez une aiguille de 22 G dans l’apex ventriculaire gauche le long de l’axe longitudinal du ventricule gauche (figure supplémentaire 2C). Pendant ce temps, observez la pulsation rythmique du sang dans le tube de perfusion, sinon l’aiguille peut perforer le ventricule droit, ce qui peut entraîner un mauvais effet de perfusion.
      REMARQUE : La pince à épiler dentée ne doit pas être utilisée ; sinon, cela peut provoquer une fuite de sang supplémentaire du site de maintien de la pince à épiler.
    6. À l’aide de ciseaux fins, couper l’oreillette droite (figure supplémentaire 2C), puis injecter manuellement 100 mL de liquide perfusant glacé à un débit d’environ 2 mL/s en 1 min.
      REMARQUE : Lorsque le foie et les pattes des rats pâlissent et qu’aucun sang ne s’écoule de l’oreillette droite, une bonne perfusion peut être obtenue.
  5. Dissection de la moelle épinière (Figure 1)
    1. Placez le rat en position couchée et coupez la colonne vertébrale au niveau de l’épine iliaque antéro-supérieure (environ L4 niveau vertébral) et du point de déplacement de la courbure de la colonne thoracique (environ T6 niveau vertébral), respectivement (Figure 1A). Ensuite, placez immédiatement la colonne vertébrale isolée dans la solution perfusante glacée oxygénée pour éliminer les résidus de sang et de tissu adipeux ; Cette procédure est bénéfique pour garder le champ opératoire propre dans les procédures ultérieures.
      REMARQUE : Les muscles paraspinaux doivent être réservés, ce qui est propice à la fixation ultérieure de la colonne vertébrale à l’aide d’une épingle à insectes.
    2. Transférez immédiatement la colonne vertébrale isolée sur le plateau anatomique (Figure 1B) avec la face dorsale vers le haut et l’extrémité rostrale près de l’opérateur. Remplir le plateau anatomique avec 50 mL de solution de coupe glacée oxygénée en continu (figure 1B).
    3. Utilisez quatre épingles à insectes pour fixer la colonne vertébrale en pénétrant dans les muscles paraspinaux (figure 1B).
    4. Au microscope à dissection, coupez les pédicules vertébraux des deux côtés de l’extrémité rostrale avec le micro-ciseaux, ce que l’on peut appeler « laminectomie » (Figure 1C). Faites attention à ne pas endommager la moelle épinière. Pendant ce temps, utilisez la pince à épiler micro-dentée pour soulever le corps vertébral coupé.
    5. Après la laminectomie, ne séparez pas immédiatement la moelle épinière du canal rachidien. Au lieu de cela, utilisez un micro-ciseaux pour couper la dure-mère le long de la ligne médiane dorsale, ce qui est propice à l’absorption des nutriments entre les cellules et l’ACSF oxygéné (Figure 1D).
      REMARQUE : Ne déchirez jamais la dure-mère. Seule la coupe de la dure-mère par micro-ciseaux est autorisée ; sinon, la racine nerveuse et le parenchyme spinal seront gravement endommagés !
    6. Soulevez la partie rostrale de la moelle épinière, puis coupez soigneusement la racine nerveuse avec environ 1 mm réservé (Figure 1E). Après avoir séparé la moelle épinière du canal vertébral, utilisez 2 épingles à insectes pour fixer la moelle épinière avec le côté ventral vers le haut (Figure 1F).
    7. À l’aide d’un micro-ciseaux, couper la dure-mère le long de la ligne médiane ventrale (figure 1F). Coupez les racines nerveuses redondantes avec environ 1 mm réservé.
      REMARQUE : Le nerf est beaucoup plus tenace que la moelle épinière. Si la racine nerveuse réservée est trop longue (>1 mm), le vibratome ne peut pas couper la racine nerveuse, ce qui peut entraîner une déchirure grave du parenchyme rachidien.
    8. À l’aide d’un micro-ciseau, séparez l’élargissement lombaire d’une longueur de 6 à 7 mm (Figure 1G).
  6. Enrobage dans l’agarose à bas point de fusion
    1. Placez l’élargissement lombaire sur la pente de 35° (Figure 1H) avec la face dorsale vers le haut et l’extrémité caudale vers le bas. Utilisez un papier filtre absorbant pour éliminer l’eau abondante à la surface du tissu (figure 1H).
    2. Versez lentement le gel d’agarose fondu dans la boîte de Pétri contenant l’hypertrophie lombaire (Figure 1I).
      REMARQUE : Ne versez pas trop vite ou des bulles s’accumuleront dans le gel.
    3. Placez la boîte de Pétri ci-dessus dans le mélange glace-eau pour refroidir le gel dès que possible, ce qui est propice au maintien de l’activité des cellules.
    4. Coupez le gel en un cube de 15 mm x 10 mm x 10 mm et montez-le sur le disque d’échantillon avec de la superglue (Figure 1J).
  7. Trancher
    1. Placez le disque d’échantillon dans le plateau de coupe précongelé, puis versez la solution de coupe glacée (Figure 1K). Faire bouillonner continuellement avec 95 % de CO 2 et 5 % d’O2 dans le plateau de coupe.
    2. Régler les paramètres du vibratome : épaisseur : 350 μm ; vitesse : 0,14-0,16 mm/s, amplitude : 1,0 mm et fréquence de vibration : 85 Hz.
    3. Récoltez 2 à 3 tranches appropriées par animal. Enregistrez 1 à 2 motoneurones FG+ sains par tranche, avec une plage de 5 à 6 cellules par animal.
  8. Incubation
    1. Utilisez une pince à épiler à coulisse pour couper une tranche (Figure 1L) et placez-la dans la chambre d’incubation remplie d’ACSF oxygéné en continu. Placez la chambre d’incubation dans un bain-marie à 32 °C pendant 30 minutes, puis continuez à l’incuber à température ambiante (RT) pendant encore 30 minutes avant l’enregistrement.
      REMARQUE : Les procédures ci-dessus, de l’anesthésie à l’obtention de la première tranche, doivent être terminées dans les 20 à 30 minutes pour conserver autant que possible la viabilité des cellules. Les motoneurones de chaque tranche peuvent maintenir leur viabilité pendant environ 6 à 7 heures.

2. Enregistrement patch-clamp avec SCS (Figure 2)

  1. Préparatifs
    1. Perfuser la chambre d’enregistrement avec de l’ACSF à bulles continues à un débit d’environ 1 à 2 mL/min. Réglez le débit individuellement via le panneau de commande de la pompe péristaltique.
    2. Placez une tranche dans la chambre d’enregistrement. Utilisez le fil de platine en forme de U avec des fils de nylon pour stabiliser fermement la tranche en place.
    3. Utilisez un microscope à contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC) pour observer la tranche. Sous la lentille de l’objectif 4x, vérifiez que la longueur de la racine dorsale est d’environ 1 mm. Trouvez la zone où la racine dorsale pénètre dans le parenchyme, puis déplacez le champ de vision central vers cette zone.
    4. Connectez le générateur d’impulsions à des électrodes sur mesure (Figure 2A).
  2. Configuration de SCS
    1. Placez l’anode de SCS près de la ligne médiane dorsale via le système de micromanipulation (Figure 2B).
    2. Placez la cathode de SCS près de la zone d’entrée de la racine dorsale (DREZ) via le système de micromanipulation (Figure 2B).
  3. Ciblage et imagerie cellulaire
    1. Utilisez l’IR-DIC avec une lentille d’objectif 10x pour trouver grossièrement la région dorsolatérale de la colonne motrice, où se trouvent la plupart des motoneurones. Ensuite, déplacez le champ de vision central vers cette zone.
    2. Passez à une lentille d’objectif 60x pour trouver un neurone sain avec une surface lisse et brillante et des noyaux invisibles (Figure 2C,F).
    3. Diminuez légèrement l’intensité IR et allumez la source de lumière à fluorescence. Basculez le filtre de lumière sur le filtre d’excitation ultraviolette à large bande (Figure 2D,G), pour sélectionner un motoneurone FG-positif (FG+) approprié (Figure 2E,H).
    4. Utilisez des électrodes d’aspiration pour appliquer une stimulation du seuil moteur 1x à la racine dorsale. Si un potentiel d’action évoqué est détecté dans les motoneurones (Figure supplémentaire 3), cela confirme que l’activité de la racine dorsale est intacte. Si ce n’est pas le cas, cette tranche doit être jetée.
  4. Enregistrement patch-clamp
    1. Remplissez la micropipette avec la solution intracellulaire et insérez-la dans le porte-électrode. Utilisez le système de micromanipulation pour abaisser la pipette dans le bain ACSF. La résistance de la pipette varie de 5 à 8 MΩ.
    2. Appliquez une petite quantité de pression positive sur la pipette pour souffler la poussière et les débris cellulaires.
      1. Abaissez l’électrode pour vous approcher de la cellule. Lorsque la pipette touche la surface du neurone FG+, une petite indentation de la membrane devient visible au niveau de la pointe. Relâchez la pression positive.
      2. Ensuite, appliquez une petite quantité de pression négative sur la pipette à l’aide d’une seringue. Cela crée une petite quantité d’aspiration qui met la membrane cellulaire en contact avec la pipette en verre. Faites toujours attention à la résistance totale sur l’interface logicielle jusqu’à ce que la valeur de résistance atteigne des gigaohms (>1 GΩ). Ensuite, le gigaseal est formé.
    3. Fixez le potentiel de membrane à -70 mV, puis appuyez sur le bouton de compensation rapide de la capacité sur l’interface logicielle de l’amplificateur. Appliquez doucement une pression négative transitoire pour rompre la membrane cellulaire, puis appuyez sur le bouton de compensation de capacité lente sur l’interface logicielle de l’amplificateur. À ce stade, une bonne configuration de cellules entières est obtenue.
    4. Passez en mode pince de courant en cliquant sur le bouton IC de l’interface logicielle et enregistrez le potentiel de membrane au repos (RMP).
    5. Appliquez le SCS pendant 1 à 2 s avec une amplitude de 1 à 10 mA, tandis que la largeur et la fréquence d’impulsion sont fixées à 210 μs et 40 Hz, respectivement. Déterminez le seuil moteur en augmentant lentement l’amplitude de stimulation jusqu’à ce que le premier PA soit observé.
    6. Distinguer les motoneurones à déclenchement retardé et immédiat à l’aide d’une injection de courant dépolarisant de 5 s autour de la rhéobase en mode pince de courant10,11,12. Motoneurones à déclenchement immédiat : Une faible rhéobase peut induire un déclenchement immédiat et répétitif avec une fréquence de tir stable ; Motoneurones à décharge retardée : Une rhéobase élevée peut induire un début retardé de déclenchement répétitif avec une cadence de déclenchement accélérée (Figure 3).
    7. Lorsque SCS est désactivé, continuez à enregistrer le potentiel de membrane pour capturer le déclenchement spontané des points d’accès.
    8. Effectuez des enregistrements à pince de tension : des enregistrements à pince de tension pour le courant postsynaptique excitateur (EPSC) lorsque SCS est activé et désactivé. Le paramètre de stimulation est 1x seuil moteur, 210 μs, 2 Hz.

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Representative Results

Grâce à l’entretien rigoureux à basse température pendant l’opération fine (Figure supplémentaire 1, Figure supplémentaire 2 et Figure 1), la viabilité de la cellule était suffisamment bonne pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques ultérieurs. Pour simuler le scénario clinique autant que possible, nous avons utilisé la micromanipulation pour placer la cathode et l’anode SCS près de la ligne médiane dorsale et de la DREZ, respectivement (Figure 2), ce qui pourrait initier un signal neuronal dans la corne dorsale pour se propager aux motoneurones dans la région dorsolatérale de la colonne motrice. Dans cette étude, nous avons utilisé FG pour localiser les motoneurones d’un diamètre de 20 à 50 μm. Comme le montre la figure 2D, G, nous avons confirmé avec certitude qu’un neurone FG+ sain était un motoneurone - la terminaison du circuit rachidien. Cette méthode d’étiquetage a ouvert la voie à l’étude de l’effet du SCS sur le modèle de cuisson. Les propriétés électrophysiologiques des motoneurones à déclenchement retardé et immédiat sont énumérées dans les tableaux supplémentaires 1 et 2. Les méthodes de calcul des propriétés actives et passives sont fournies dans le fichier supplémentaire 1.

Lorsque SCS a délivré un champ électrique alternatif pulsé à la tranche vertébrale, nous avons d’abord utilisé le mode pince de courant pour enregistrer la réponse du potentiel membranaire (Figure 4). Au fur et à mesure que nous augmentions l’amplitude de stimulation par pas de 1/3 du seuil moteur (Figure 4B,C), le potentiel membranaire augmentait également avec lui, mais seul un seuil moteur 1x pouvait provoquer Aps (Figure 4D). La figure 4D montre qu’environ toutes les 10 à 20 impulsions peuvent provoquer un PA, ce qui indique qu’il pourrait exister une certaine régularité de la réponse AP à l’amplitude SCS.

Après l’arrêt du SCS, nous avons continué à enregistrer le potentiel de la membrane. La figure 5 a montré que le potentiel membranaire a légèrement augmenté jusqu’à -60 mV, et que le neurone a déclenché une série de PA spontanés. Ces PA spontanés durent une courte période de temps (30-40 s), puis le potentiel membranaire est revenu à -65 mV, ce qui indique que le SCS peut augmenter temporairement l’excitabilité cellulaire.

Ensuite, nous avons utilisé des enregistrements à pince de tension pour EPSC lorsque SCS était activé et désactivé (Figure 6). Après chaque impulsion SCS, un EPSC évoqué pouvait être détecté. La latence entre l’artefact de stimulus et l’EPSC était de 2,64 ± 0,38 ms (figure supplémentaire 4). L’amplitude des EPSC évoqués était de 35,14 ± 12,73 pA (Figure 4 supplémentaire). La fréquence des EPSC évoqués est cohérente avec la fréquence SCS. Après soustraction de l’équilibrage passif de la charge, l’EPSC évoqué peut être observé dans un motoneurone viable après une stimulation du seuil moteur 1x (Figure supplémentaire 5A). La polarité de stimulation a été inversée après l’arrêt de la perfusion pendant 2 h dans la même cellule. La stimulation n’a pas induit d’EPSC, ce qui confirme que l’EPSC évoqué n’était pas un artefact (Figure supplémentaire 5B).

Figure 1
Figure 1 : Dissection et tranchage de la moelle épinière. (A) Couper la colonne vertébrale au niveau de l’épine iliaque antéro-supérieure (environ le niveau vertébral L4) et le point de déplacement de la courbure de la colonne thoracique (environ le niveau vertébral T6), respectivement. (B) Transférez immédiatement l’épine isolée dans le plateau anatomique avec la face dorsale vers le haut et l’extrémité rostrale près de l’opérateur. Remplissez le plateau anatomique avec la solution de coupe glacée oxygénée en continu. (C) Effectuer une laminectomie des deux côtés à partir de l’extrémité rostrale. (D) Couper la dure-mère dorsale, qui est propice à l’absorption des nutriments entre les cellules et le liquide céphalorachidien artificiel oxygéné (ACSF). (E) Coupez soigneusement la racine nerveuse. (F) Couper la dure-mère ventrale. (G) Séparez l’élargissement lombaire sur une longueur de 6-7 mm. (H) Placez l’élargissement lombaire sur la pente de 35° avec le côté dorsal vers le haut et l’extrémité caudale vers le bas. Utilisez un papier filtre absorbant pour éliminer l’eau abondante à la surface du tissu. (I) Versez lentement le gel d’agarose fondu dans la boîte de Pétri. (J) Coupez le gel en cube et montez-le sur le disque d’échantillon avec de la super colle. (K) Placez le disque d’échantillon dans le plateau de coupe, puis versez la solution de coupe glacée. (L) Un exemple de tranche vertébrale lors d’une hypertrophie lombaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Configuration de la stimulation de la moelle épinière (SCS) et imagerie des motoneurones. (A) Le générateur d’impulsions avec des électrodes sur mesure peut régler séparément l’amplitude, la largeur d’impulsion et la fréquence. Inlet a montré que la spécification dimensionnelle d’un contact d’électrode est de 800 μm x 500 μm x 300 μm. (B) Placez l’anode et la cathode près de la ligne médiane dorsale et de la zone d’entrée de la racine dorsale (DREZ) via le système de micromanipulation, respectivement. Placez la pipette enregistreuse dans la région dorsolatérale de la colonne motrice pour clamper les motoneurones Fluoro-Gold positifs (FG+). (C) Un motoneurone sain à déclenchement immédiat avec imagerie au microscope à contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC) (60x). (D) Le même neurone avec seulement l’imagerie par fluorescence (60x), des particules brillantes de fluoro-or (FG) représentent que ce neurone est un motoneurone. (E) Image fusionnée de l’IR-DIC et de la fluorescence dans le motoneurone FG+. (F-H) Un motoneurone sain à décharge retardée avec imagerie IR-DIC (60x). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Distinguer les motoneurones à déclenchement retardé et immédiat à l’aide d’une injection de courant dépolarisant de 5 s. (A) Motoneurones à déclenchement immédiat : Une faible rhéobase peut induire un déclenchement immédiat et répétitif avec une fréquence de tir stable ; (B) Motoneurones à décharge retardée : Une rhéobase élevée peut induire un début retardé de déclenchement répétitif avec une cadence de tir accélérée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : La stimulation de la moelle épinière (SCS) a provoqué des potentiels d’action (PA) dans les motoneurones. (A) Lorsqu’aucune stimulation n’a été appliquée, le potentiel membranaire au repos (RMP) était de -65 mV. (B) Le stimulus de seuil moteur 1/3x ne peut pas provoquer de PA. (C) Le stimulus de seuil moteur 2/3x ne peut pas provoquer de PA. (D) Un stimulus de seuil moteur x1x peut provoquer des PA, et toutes les 10 à 20 impulsions peuvent provoquer un PA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Déclenchement des potentiels d’action spontanés (PA) après une stimulation de la moelle épinière (SCS). Après l’arrêt du SCS, le neurone a déclenché une série de PA spontanés pendant une courte période de temps (30-40 s), puis le potentiel membranaire au repos (RMP) est revenu à -65 mV. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Illustration du paramètre de stimulation de la moelle épinière (SCS) et du courant postsynaptique excitateur évoqué (EPSC). (A) Illustration du paramètre SCS ; (B,C) À la suite d’une seule impulsion de stimulation (1x stimulation du seuil moteur), l’EPSC évoqué peut être observé ; (D) Après avoir soustrait l’équilibrage passif de la charge, la latence et l’amplitude de l’EPSC peuvent être calculées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Préparation de l’instrument. (A) Plateau de perfusion : 10 min avant la perfusion, déposer de la glace pilée sur la boîte de Pétri de 10 cm remplie de gel de silice. (B) Plateau anatomique : la veille du sacrifice, placez le plateau anatomique rempli de gel de silice dans le réfrigérateur à -80 °C. (C) Plateau de découpe : la veille du sacrifice, placez le plateau de découpe avec bande d’eau dans le réfrigérateur à -80 °C. (D) Pente de coulée d’agarose : 30 min avant la perfusion, placer une pente d’agarose de 35° avec des plaques de base au centre d’une boîte de Pétri de 35 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 2 supplémentaire : Perfusion intracardique. (A) Soulevez le processus xiphoïde. (B) Coupez le sternum le long des deux côtés de l’apophyse xiphoïde pour ouvrir la poitrine et exposer le cœur. Veillez à ne pas endommager les vaisseaux thoraciques internes, sinon des saignements massifs rempliront tout le champ opératoire et empêcheront l’opérateur d’identifier l’apex du ventricule ou l’oreillette droite. (C) Insérez une aiguille de 22 G à l’apex du ventricule gauche pour la perfusion et coupez l’oreillette droite pour la sortie du liquide. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 3 supplémentaire : Confirmation de l’activité de la racine dorsale. Utilisez des électrodes d’aspiration pour appliquer une stimulation du seuil moteur 1x à la racine dorsale. Si un potentiel d’action évoqué est détecté dans les motoneurones, nous pouvons confirmer que l’activité de la racine dorsale est intacte. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 4 supplémentaire : Latence et amplitude des EPSC évoqués lorsque SCS était activé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : Démonstration de la validité de l’EPSC évoqué. (A) Après 1x stimulation du seuil moteur après soustraction de l’équilibrage passif de la charge, l’EPSC évoqué peut être observé dans un motoneurone viable ; (B) Après l’arrêt de la perfusion pendant 2 h dans la même cellule, la polarité de stimulation a été inversée, la stimulation du seuil moteur 1x n’a induit aucun EPSC, ce qui a confirmé que l’EPSC évoqué n’était pas un artefact. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier complémentaire 1 : Méthodes de calcul des propriétés actives et passives. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Propriétés passives des motoneurones. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Propriétés actives des motoneurones Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

L’information de mouvement modulée par SCS est finalement convergée vers les motoneurones. Par conséquent, prendre les motoneurones comme cible de recherche peut simplifier la conception de l’étude et révéler plus directement le mécanisme de neuromodulation du SCS. Pour enregistrer simultanément diverses caractéristiques de stimulus et réponses cellulaires, un patch-clamp est une bonne méthode pour étudier les caractéristiques électrophysiologiques à l’échelle d’une seule cellule. Cependant, il y a encore quelques difficultés, notamment comment maintenir la viabilité cellulaire, comment séparer rapidement la moelle épinière de la structure osseuse et comment utiliser le SCS pour induire des PA avec succès. Par conséquent, cette étude vise à aider les chercheurs à saisir rapidement les compétences opérationnelles essentielles, à éviter certains pièges possibles et à se concentrer le plus tôt possible sur la conception de l’étude plutôt que sur la méthodologie.

Pour obtenir une bonne viabilité cellulaire, il faut toujours faire attention aux détails suivants : (1) Maintenir la moelle épinière à une température glaciale est très important car une basse température peut inhiber la mort cellulaire et ralentir le taux métabolique, ce qui peut protéger le neurone des dommages mécaniques pendant la perfusion, la dissection et le tranchage13 ; (2) L’ablation délicate de la dure-mère par micro-ciseaux peut améliorer l’absorption neuronale des nutriments des solutions environnantes. Ne décollez jamais directement la dure-mère ; sinon, la moelle épinière sera gravement endommagée. De plus, si vous oubliez de nettoyer la dure-mère, le processus de tranchage ultérieur peut être difficile car la lame peut ne pas couper complètement la dure-mère et ensuite arracher la moelle épinière restante de l’agarose, ce qui peut entraîner l’échec du tranchage. (3) Par rapport à la tranche transversale conventionnelle, les tranches obliques augmentent la zone de matière grise, et vous pouvez trouver plus de motoneurones FG+ dans une seule tranche9. (4) Parce que la moelle épinière seule ne peut pas être fermement fixée sur le disque de l’échantillon comme le cerveau, l’enrober dans du gel d’agarose est efficace pour résoudre ce problème sans diminuer la viabilité cellulaire. Nous recommandons d’utiliser de l’agarose à faible point de fusion (point de gel 26-30 °C) plutôt que de l’agarose conventionnelle (point de gel 38-43 °C), car une température élevée peut endommager la viabilité cellulaire. (5) Nous recommandons que la distance entre deux fils de nylon de fil de platine en forme de U soit de 1 à 1,5 mm, car les fils lâches ne peuvent pas immobiliser fermement la moelle épinière et les fils denses peuvent écraser la cellule.

Par rapport aux dispositifs de stimulation conventionnels, tels que les électrodes à crochet bipolaires largement utilisées dans la recherche fondamentale, l’électrode SCS de cette étude est dérivée de nos travaux cliniques antérieurs14 et de la recherche fondamentale15. SCS délivre une stimulation électrique alternée pulsée, qui fournit diverses dimensions de réglage des paramètres. Ce dispositif SCS dispose également d’une fonction d’équilibrage de charge pour éviter l’électrolyse tissulaire et n’entre pas directement en contact avec le tissu neural ; par conséquent, ce SCS a une bonne sécurité pour les applications in vivo .

Après le traitement par SCS, les PA spontanés des motoneurones peuvent être attribués aux raisons suivantes : (1) Le SCS induit l’accumulation de la charge dans le corps cellulaire et le colliculus axonal des neurones, conduisant à l’augmentation de RMP16. Ce phénomène indique que la SCS peut améliorer l’excitabilité du neurone, ce qui peut être lié au changement de conductivité des canaux ioniques après la SCS, tels que Na v 1.117, K v 2.1 18, ou Ca v 2.319. (2) Le SCS peut activer les neurones GABAergiques dorsaux pour faciliter la rétroaction proprioceptive aux motoneurones. Nous suggérons que la transmission neuronale peut exister en continu entre les neurones sensoriels et les motoneurones, conduisant à des PA spontanés dans les motoneurones après SCS. Les PA spontanés peuvent maintenir un état intrinsèque de préparation à l’exécution de comportements sensori-moteurs20. Par conséquent, l’activation ou l’inhibition des PA spontanés peut être bénéfique pour le traitement des maladies neurologiques de la colonne vertébrale.

Comme nous le savons, l’enregistrement électrophysiologique in vivo est préférable pour détecter la réponse électrophysiologique sous la distribution naturelle du champ électrique et le placement des électrodes. De plus, les enregistrements in vivo des motoneurones permettent d’identifier l’identité des motoneurones. Cela peut se faire par l’identification antidromique des axones moteurs couplée à la mesure de la force des fibres musculaires21. Mais les enregistrements in vivo de la moelle épinière présentent également les inconvénients suivants : (1) Le motoneurone se trouve à 2-3 mm de la surface dorsale de la moelle épinière, même en utilisant l’imagerie confocale à deux photons la plus avancée, la profondeur d’observation n’est que de 500 à 800 μm, il est donc difficile de les observer optiquement in vivo en utilisant les méthodes existantes. Par conséquent, si nous voulons clamper exactement un seul motoneurone in vivo, la pipette en verre doit passer à travers la colonne dorsale pour atteindre le motoneurone invisible ; Le patch-clamp in vivo ne peut être réalisé qu’à l’aveugle, ce qui entraîne une incertitude et un taux de défaillance importants. (2) À l’exception du patch-clamp in vivo, les enregistrements d’électrodes de silicium peuvent être la méthode alternative, telle que l’électrode Utah array ou Neuropixels. Cependant, les signaux enregistrés par les électrodes en silicium sont principalement des potentiels d’action composés plutôt que des potentiels d’action unique. Bien que l’activité des neurones individuels ait été résolue à l’aide d’algorithmes de tri par pics, la précision et la fiabilité des algorithmes de tri doivent encore être améliorées.

Par rapport aux enregistrements in vivo, le plus grand avantage de l’in vitro par rapport à l’in vivo est l’utilisation d’une pince de tension, qui permet une compréhension unique des voies synaptiques activées par le SCS. De plus, il permettrait également l’utilisation d’outils d’imagerie en direct. Nous supposons que le SCS induit la libération de neurotransmetteurs tels que le GABA et le glutamate des neurones de niveau supérieur sur les motoneurones, ce qui entraîne une réponse EPSC excitatrice globale7. Par conséquent, dans nos recherches à venir, nous intégrerons la détection de l’IPSC, de la mini EPSC (mEPSC) et de l’EPSC évoquée induite par la SCS pour clarifier les modèles de libération de neurotransmetteurs inhibiteurs et excitateurs par les neurones pré-moteurs ou les interneurones. Nous avons pleinement reconnu que la stimulation in vitro présente également certaines limites : (1) les circuits longitudinaux à longue portée de la moelle épinière sont perturbés, ce qui entraîne la perte d’informations entrantes du cortex moteur ou des membres inférieurs ; (2) La distribution des champs électriques pendant la stimulation in vitro peut différer de celle de la stimulation in vivo. Dans cette étude, le seuil d’activation (environ en milliampères) pour les PA était beaucoup plus élevé que celui de l’expérience in vivo (environ en microampères)15 ; cela s’explique par le fait que la capacité volumique de la solution ACSF dans la chambre d’enregistrement était beaucoup plus élevée que celle du liquide céphalo-rachidien à l’état naturel, et la théorie mathématique soutient que le champ électrique s’atténue plus rapidement dans les matériaux à haute conductivité22. Par conséquent, la majeure partie du courant a été absorbée par la solution de bain, et nous supposons que seule une petite partie du champ électrique peut diffuser vers les racines nerveuses.

Par conséquent, compte tenu des avantages et des inconvénients de la stimulation in vivo et de la stimulation in vitro , on peut conclure que le patch-clamp in vitro est une méthode avantageuse pour étudier la nature synaptique et/ou les effets cellulaires du SCS chez les rongeurs nouveau-nés.

En pratique clinique, l’électrode ne contracte pas directement la surface de la moelle épinière ou de la racine nerveuse23. Au lieu de cela, il s’appuie sur le rayonnement du champ électrique généré par l’électrode pour affecter indirectement l’activité des nerfs1. De multiples études 1,23,24 ont confirmé que le contact cathodique du SCS doit être placé le plus près possible de la racine dorsale ou de la zone d’entrée (DREZ) afin d’obtenir une sélectivité optimale pour la stimulation d’un muscle spécifique. L’augmentation de la distance entre l’électrode et la racine nerveuse affaiblira la spécificité de la stimulation. Par conséquent, nous plaçons directement la cathode près de la DREZ plutôt que d’entrer directement en contact avec la racine nerveuse ou la moelle épinière.

Les fibres afférentes de la racine dorsale se projettent d’abord vers les neurones sensoriels, puis vers les interneurones et les motoneurones. Outre les circuits de projection transverse, il existe également des circuits qui se projettent vers l’extrémité rostrale et caudale. Par exemple, les motoneurones correspondant au muscle tibial antérieur peuvent être trouvés à plusieurs niveaux25. Par conséquent, bien que la préparation oblique puisse sectionner les circuits de projection transverse, elle préservera toujours les fibres de projection non transversales, permettant l’étude des circuits sensoriels pré-moteurs. En plus de la préparation oblique et transversale, la préparation longitudinale offre des avantages distincts pour mieux préserver les circuits de la racine dorsale aux motoneurones et permettre la rétention efficace des circuits de la moelle épinière sur plusieurs segments26, ce qui fournit une représentation plus proche des conditions physiologiques réelles.

Selon la recherche de simulation 6,27,28, SCS active principalement les fibres afférentes proprioceptives pour restaurer le mouvement des membres inférieurs, y compris les fibres afférentes Ia, Ib et II. Cependant, dans cette étude, nous ne pouvons pas confirmer avec certitude quels types de fibres ont été spécifiquement activés par SCS. Nous supposons qu’un modèle similaire peut également exister dans la pince de raccordement in vitro. Nous aborderons ce problème en effectuant des modélisations et des simulations mathématiques et en les intégrant dans nos travaux en cours.

En conclusion, ce protocole peut aider les chercheurs à améliorer leurs compétences opératoires et à comprendre les éléments essentiels de la combinaison d’enregistrements patch-clamp et de SCS pour étudier le mécanisme électrique de SCS à l’échelle d’une seule cellule.

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Disclosures

Aucun

Acknowledgments

Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine pour les jeunes chercheurs (52207254 et 82301657) et le Fonds chinois pour les sciences postdoctorales (2022M711833).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Ascorbic Acid Sigma A4034
CaCl2·2H2O Sigma C5080
Choline Chloride Sigma C7527
Cover slide tweezers VETUS 36A-SA Clip a slice
D-Glucose Sigma G8270
EGTA Sigma E4378
Fine scissors RWD Life Science S12006-10 Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source Olympus  U-HGLGPS
Fluoro-Gold Fluorochrome Fluorochrome Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877
HEPES Sigma H3375
infrared CCD camera Dage-MTI IR-1000E
KCl Sigma P5405
K-gluconate Sigma P1847
Low melting point agarose Sigma A9414
MgSO4·7H2O Sigma M2773
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-200
Micropipette puller Sutter instrument P1000
Micro-scissors  Jinzhong wa1020 Laminectomy
Microscope for anatomy Olympus  SZX10
Microscope for ecletrophysiology Olympus  BX51WI
Micro-toothed tweezers RWD Life Science F11008-09 Lift the cut vertebral body
NaCl Sigma S5886
NaH2PO4 Sigma S8282
NaHCO3 Sigma V900182
Na-Phosphocreatine Sigma P7936
Objective lens for ecletrophysiology Olympus  LUMPLFLN60XW working distance 2 mm 
Osmometer  Advanced  FISKE 210
Patch-clamp amplifier  Axon  Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer Axon  Digidata 1550B
pH meter  Mettler Toledo  FE28
Slice Anchor Multichannel system SHD-27H
Spinal cord stimulatior PINS T901
Toothed tweezer RWD Life Science F13030-10 Lift the xiphoid
Vibratome Leica VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter Olympus  U-MF2

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References

  1. Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
  2. Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
  3. Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
  4. Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
  5. Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
  6. Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
  7. Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  9. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
  10. Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
  11. Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
  12. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
  13. Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
  14. Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
  15. Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
  16. Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
  17. Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
  18. Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
  19. Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
  20. Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
  21. Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
  22. Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
  23. Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
  24. Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
  25. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  26. Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
  27. Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
  28. Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).

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Préparation <em>ex vivo</em> d’une tranche de moelle épinière pour l’enregistrement d’un patch-clamp de cellules entières dans les motoneurones lors d’une stimulation de la moelle épinière
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Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L.… More

Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L. The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation. J. Vis. Exp. (199), e65385, doi:10.3791/65385 (2023).

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