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Neuroscience

La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65385
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,2
1National Engineering Research Center of Neuromodulation, School of Aerospace Engineering, Tsinghua University, 2IDG/McGovern Institute for Brain Research, Tsinghua University, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

Summary

Questo protocollo descrive un metodo che utilizza un patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla stimolazione del midollo spinale (SCS) con un'elevata risoluzione spazio-temporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere contemporaneamente la vitalità cellulare.

Abstract

La stimolazione del midollo spinale (SCS) può ripristinare efficacemente la funzione locomotoria dopo una lesione del midollo spinale (SCI). Poiché i motoneuroni sono l'unità finale per eseguire i comportamenti sensomotori, studiare direttamente le risposte elettriche dei motoneuroni con SCS può aiutarci a comprendere la logica sottostante della modulazione motoria spinale. Per registrare simultaneamente diverse caratteristiche di stimolo e risposte cellulari, un patch-clamp è un buon metodo per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche su scala di singola cellula. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà complesse nel raggiungere questo obiettivo, tra cui il mantenimento della vitalità cellulare, la rapida separazione del midollo spinale dalla struttura ossea e l'utilizzo dell'SCS per indurre con successo potenziali d'azione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che utilizza patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni a SCS con un'elevata risoluzione spaziotemporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere la vitalità cellulare allo stesso tempo per studiare senza problemi il meccanismo elettrico di SCS sul motoneurone ed evitare inutili tentativi ed errori.

Introduction

La stimolazione del midollo spinale (SCS) può ripristinare efficacemente la funzione locomotoria dopo una lesione del midollo spinale (SCI). Andreas Rowald et al. hanno riportato che la SCS consente la funzione locomotoria e del tronco degli arti inferiori entro un solo giorno1. L'esplorazione del meccanismo biologico della SCS per il recupero locomotore è un campo di ricerca critico e di tendenza per lo sviluppo di una strategia SCS più precisa. Ad esempio, il team di Grégoire Courtine ha dimostrato che l'interneurone eccitatorio Vsx2 e i neuroni Hoxa10 nel midollo spinale sono i neuroni chiave per la risposta alla SCS e la neuromodulazione cellulo-specifica è fattibile per ripristinare la capacità di camminare del ratto dopo la lesione midollare2. Tuttavia, pochi studi si concentrano sul meccanismo elettrico della SCS su scala di una singola cellula. Sebbene sia ben noto che lo stimolo in corrente continua soprasoglia può suscitare i potenziali d'azione (AP) nel classico esperimento del calamaro 3,4,5, non è ancora chiaro come la stimolazione elettrica alternata pulsata, come la SCS, influenzi la generazione del segnale motorio.

Data la complessità dei circuiti neurali intraspinali, una selezione appropriata per la popolazione cellulare è importante per studiare il meccanismo elettrico della SCS. Sebbene la SCS ripristini la funzione motoria attivando la via propriocettiva6, i motoneuroni sono l'unità finale per eseguire il comando motorio, derivato dall'integrazione dell'input afferente alle informazioni sulla propriocezione7. Pertanto, studiare direttamente le caratteristiche elettriche dei motoneuroni con SCS può aiutarci a comprendere la logica sottostante alla modulazione motoria spinale.

Come sappiamo, il patch-clamp è il metodo gold standard per la registrazione elettrofisiologica cellulare con una risoluzione spazio-temporale estremamente elevata8. Pertanto, questo studio descrive un metodo che utilizza un patch clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla SCS. Rispetto al cerotto cerebrale9, il cerotto per il midollo spinale è più difficile per i seguenti motivi: (1) Il midollo spinale è protetto dal canale vertebrale con un volume minuscolo, che richiede una micromanipolazione molto fine e una rigorosa manutenzione ghiacciata per ottenere una migliore vitalità cellulare. (2) Poiché il midollo spinale è troppo sottile per essere fissato sul vassoio di taglio, deve essere immerso in agarosio a basso punto di fusione e tagliato dopo la solidificazione.

Quindi, questo metodo fornisce dettagli tecnici nella dissezione del midollo spinale e nel mantenimento della vitalità cellulare allo stesso tempo, in modo da studiare senza problemi il meccanismo elettrico della SCS sui motoneuroni ed evitare inutili prove ed errori.

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Protocol

Il Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali e gli studi sono stati condotti in conformità con le normative vigenti in materia di benessere degli animali.

1. Preparazione degli animali

  1. Animali
    1. Informazioni sull'alloggiamento: Ratti Sprague-Dawley maschi (10-14 giorni postnatali, P10-P14) in un ambiente specifico privo di agenti patogeni.
      NOTA: Le condizioni ambientali sono state mantenute a 20 °C ± 2 °C, umidità: 50%-60%, con un ciclo luce/buio di 12 ore. Gli animali avevano libero accesso al cibo e all'acqua.
    2. Etichettare i motoneuroni retrogradamente: iniettare fluoro-oro (FG) nel muscolo bilaterale tibiale anteriore e gastrocnemio (2% in soluzione fisiologica sterile, 50 μL per muscolo) per marcare retrogradamente i motoneuroni 2 giorni prima del sacrificio.
  2. Soluzioni
    1. Preparare la soluzione di taglio: mescolare 120 mM di cloruro di colina, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1,25 mM NaH 2 PO4, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl2, 1,3 mM di acido ascorbico, 15 mM di glucosio. Pre-bolle la soluzione con il 95% di O 2 e il 5% di CO2 (regolare a pH 7,4 con KOH) per 30 minuti prima della dissezione e dell'affettatura. Raffreddare la soluzione con ghiaccio tritato.
    2. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF): Mescolare 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4; 1,3 mM di MgCl 2, 2,4 mM di CaCl2, 26 mM di NaHCO3 e 10 mM di glucosio. Pre-bolle la soluzione con il 95% di O 2 e il 5% di CO2 per 30 minuti prima dell'incubazione.
    3. Preparare la soluzione intracellulare: Mescolare 126 mM di K-gluconato, 2 mM KCl, 2 mM di MgCl 2, 0,2 mM di EGTA, 10 mM di HEPES, 4 mM di Na 2 ATP, 0,4 mM di Na2GTP, 10 mM di K-fosfocreatina e 0,5% di Neurobiotina (pH 7,25 e 305 mOsm/Kg). Raffreddare la soluzione con ghiaccio tritato.
    4. Preparare il gel di agarosio a basso punto di fusione: sciogliere 4 g di agarosio in 100 ml di soluzione da taglio e utilizzare un rotore di agitazione magnetico per scioglierlo completamente. A 30 minuti prima dell'incorporazione, riscaldare l'agarosio a basso punto di fusione nel forno a microonde ad alta potenza per 1 minuto, quindi trasferirlo a bagnomaria a 39 °C per mantenere lo stato liquido.
  3. Preparazione dello strumento
    1. Posizionare il ghiaccio tritato sul vassoio di perfusione (Figura supplementare 1A) 10 minuti prima della perfusione. Posizionare il vassoio anatomico (Figura supplementare 1B) e il vassoio di taglio (Figura supplementare 1C) con una fascia d'acqua a -80 °C durante la notte in anticipo.
    2. Mettere la camera di incubazione con rete di nylon in forno a 45 °C per una notte in anticipo.
    3. Utilizzare agarosio a basso punto di fusione per prefabbricare una pendenza di 35° e una piattaforma di 2 mm di spessore (Figura supplementare 1D). Dopo la solidificazione del gel, posizionarli al centro di una capsula di Petri da 35 mm per sostenere il midollo spinale nelle successive procedure.
  4. Perfusione intracardica
    1. Anestetizzare i ratti con tribromoetanolo al 2,5% (160 μL/10 g) tramite iniezione intraperitoneale. Assicurarsi che i ratti siano completamente anestetizzati verificando la mancanza di risposta agli stimoli esterni, come un leggero pizzicotto del dito del piede.
    2. Quando l'anestesia corretta è confermata, posizionare i ratti in posizione supina e immobilizzarli nella capsula di Petri riempita di gel di silice.
    3. Praticare un'incisione cutanea longitudinale di 5 mm caudalmente al processo xifoideo, quindi espandere completamente lo spazio sottocutaneo. Praticare un'incisione cutanea longitudinale di 2 cm lungo la linea mediana ventrale per esporre completamente la parete toracica esterna, iniziando con l'incisione sopra menzionata e terminando con la parte superiore del torace.
    4. Utilizzare una pinzetta dentata per sollevare lo xifoide (Figura supplementare 2A), quindi utilizzare forbici sottili per tagliare il diaframma. Tagliare lo sterno lungo entrambi i lati del processo xifoideo per aprire il torace ed esporre il cuore (Figura 2B supplementare).
      NOTA: Fare attenzione a preservare i vasi toracici interni su entrambi i lati; in caso contrario, potrebbe causare un'emorragia massiccia.
    5. Usa una pinzetta senza denti per sollevare il ventricolo sinistro. Inserire un ago da 22 G nell'apice ventricolare sinistro lungo l'asse longitudinale del ventricolo sinistro (Figura 2C supplementare). Nel frattempo, osserva la pulsazione ritmica del sangue nel tubo di perfusione, altrimenti l'ago potrebbe perforare il ventricolo destro, il che potrebbe portare a uno scarso effetto di perfusione.
      NOTA: La pinzetta dentata non deve essere utilizzata; in caso contrario, potrebbe causare ulteriori perdite di sangue dal sito di tenuta della pinzetta.
    6. Utilizzare forbici sottili per tagliare l'atrio destro (Figura supplementare 2C), quindi iniettare manualmente 100 ml di fluido perfusivo ghiacciato a una velocità di circa 2 ml/s entro 1 minuto.
      NOTA: Quando il fegato e le zampe dei ratti impallidiscono e il sangue non fuoriesce dall'atrio destro, è possibile ottenere una buona perfusione.
  5. Dissezione del midollo spinale (Figura 1)
    1. Posizionare il ratto in posizione prona e tagliare la colonna vertebrale rispettivamente in corrispondenza della spina iliaca anteriore superiore (circa il livello vertebrale L4) e del punto di spostamento della curvatura della colonna toracica (circa il livello vertebrale T6) (Figura 1A). Quindi, posizionare immediatamente la colonna vertebrale isolata nella soluzione di perfusione ghiacciata ossigenata per lavare via il sangue residuo e il tessuto adiposo; Questa procedura è utile per mantenere pulito il campo operatorio nelle procedure successive.
      NOTA: I muscoli paraspinali devono essere riservati, il che favorisce la successiva fissazione della colonna vertebrale utilizzando una spilla per insetti.
    2. Trasferire immediatamente la colonna vertebrale isolata nel vassoio anatomico (Figura 1B) con il lato dorsale rivolto verso l'alto e l'estremità rostrale vicino all'operatore. Riempire il vassoio anatomico con 50 ml di soluzione da taglio ghiacciata continuamente ossigenata (Figura 1B).
    3. Utilizzare quattro spilli per insetti per fissare la colonna vertebrale penetrando nei muscoli paraspinali (Figura 1B).
    4. Sotto il microscopio di dissezione, tagliare i peduncoli vertebrali di entrambi i lati dall'estremità rostrale con la microforbice, che può essere definita "laminectomia" (Figura 1C). Prestare attenzione a non danneggiare il midollo spinale. Nel frattempo, usa le pinzette micro-dentate per sollevare il corpo vertebrale tagliato.
    5. Dopo la laminectomia, non separare immediatamente il midollo spinale dal canale spinale. Invece, usa una microforbice per tagliare la dura madre lungo la linea mediana dorsale, che favorisce l'assorbimento dei nutrienti tra le cellule e l'ACSF ossigenato (Figura 1D).
      NOTA: Non strappare mai la dura madre. È consentito solo tagliare la dura madre con microforbici; in caso contrario, la radice nervosa e il parenchima spinale saranno seriamente danneggiati!
    6. Sollevare la parte rostrale del midollo spinale, quindi tagliare con cura la radice nervosa riservando circa 1 mm (Figura 1E). Dopo aver separato il midollo spinale dal canale vertebrale, utilizzare 2 spilli per insetti per fissare il midollo spinale con il lato ventrale rivolto verso l'alto (Figura 1F).
    7. Usa una microforbice per tagliare la dura madre lungo la linea mediana ventrale (Figura 1F). Tagliare le radici nervose ridondanti con circa 1 mm di riserva.
      NOTA: Il nervo è molto più tenace del midollo spinale. Se la radice nervosa riservata è troppo lunga (>1 mm), il vibratomo non può tagliare la radice nervosa, il che può portare a una grave lacerazione del parenchima spinale.
    8. Utilizzare una microforbice per separare l'allargamento lombare a una lunghezza di 6-7 mm (Figura 1G).
  6. Incorporazione nell'agarosio a basso punto di fusione
    1. Posizionare l'allargamento lombare sulla pendenza di 35° (Figura 1H) con il lato dorsale rivolto verso l'alto e l'estremità caudale verso il basso. Utilizzare una carta assorbente da filtro per rimuovere l'abbondante acqua sulla superficie del tessuto (Figura 1H).
    2. Versare lentamente il gel di agarosio fuso nella capsula di Petri contenente l'allargamento lombare (Figura 1I).
      NOTA: Non versare troppo velocemente, altrimenti si accumuleranno bolle nel gel.
    3. Mettere la capsula di Petri di cui sopra nella miscela di acqua ghiacciata per raffreddare il gel il prima possibile, il che favorisce il mantenimento dell'attività delle cellule.
    4. Tagliare il gel in un cubo di 15 mm x 10 mm x 10 mm e montarlo sul disco del campione con supercolla (Figura 1J).
  7. Affettamento
    1. Posizionare il disco portacampioni nel vassoio di taglio precongelato, quindi versare la soluzione di taglio ghiacciata (Figura 1K). Far bollire continuamente con il 95% di CO 2 e il 5% di O2 nel vassoio di taglio.
    2. Impostare i parametri del vibratomo: spessore: 350 μm; velocità: 0,14-0,16 mm/s, ampiezza: 1,0 mm e frequenza di vibrazione: 85 Hz.
    3. Raccogli 2-3 fette adatte per animale. Registra 1-2 motoneuroni FG+ sani per fetta, con un intervallo di 5-6 cellule per animale.
  8. Incubazione
    1. Utilizzare una pinzetta per vetrini di copertura per tagliare una fetta (Figura 1L) e posizionarla nella camera di incubazione riempita con ACSF continuamente ossigenato. Porre la camera di incubazione a bagnomaria a 32 °C per 30 minuti, quindi continuare a incubarla a temperatura ambiente (RT) per altri 30 minuti prima della registrazione.
      NOTA: Le procedure di cui sopra, dall'anestesia all'ottenimento della prima fetta, devono essere completate entro 20-30 minuti per mantenere il più possibile la vitalità delle cellule. I motoneuroni in ogni fetta possono mantenere la loro vitalità per circa 6-7 ore.

2. Registrazione patch-clamp con SCS (Figura 2)

  1. Preparazioni
    1. Perfondere la camera di registrazione con ACSF a bolle continue ad una velocità di circa 1-2 mL/min. Regolare la portata individualmente tramite il pannello di controllo sulla pompa peristaltica.
    2. Posizionare una fetta nella camera di registrazione. Usa il filo di platino a forma di U con fili di nylon per stabilizzare saldamente la fetta in posizione.
    3. Utilizzare un microscopio a contrasto a interferenza differenziale infrarossa (IR-DIC) per osservare la fetta. Sotto l'obiettivo 4x, verificare che la lunghezza della radice dorsale sia di circa 1 mm. Trova l'area in cui la radice dorsale entra nel parenchima, quindi sposta il campo visivo centrale in quest'area.
    4. Collegare il generatore di impulsi con elettrodi personalizzati (Figura 2A).
  2. Configurazione SCS
    1. Posizionare l'anodo di SCS vicino alla linea mediana dorsale tramite il sistema di micromanipolazione (Figura 2B).
    2. Posizionare il catodo di SCS vicino alla zona di ingresso della radice dorsale (DREZ) tramite il sistema di micromanipolazione (Figura 2B).
  3. Targeting cellulare e imaging
    1. Usa IR-DIC con un obiettivo 10x trova approssimativamente la regione dorsolaterale della colonna motoria, dove si trova la maggior parte dei motoneuroni. Quindi, sposta il campo visivo centrale in quest'area.
    2. Passa a una lente dell'obiettivo 60x per trovare un neurone sano con una superficie liscia e luminosa e nuclei invisibili (Figura 2C,F).
    3. Abbassare leggermente l'intensità IR e accendere la sorgente luminosa a fluorescenza. Passare dal filtro della luce al filtro di eccitazione ultravioletta a banda larga (Figura 2D,G), per selezionare un motoneurone FG-positivo (FG+) appropriato (Figura 2E,H).
    4. Utilizzare elettrodi di aspirazione per applicare 1x stimolazione di soglia motoria alla radice dorsale. Se viene rilevato un potenziale d'azione evocato nei motoneuroni (Figura supplementare 3), ciò conferma che l'attività della radice dorsale è intatta. In caso contrario, questa fetta deve essere scartata.
  4. Registrazione patch-clamp
    1. Riempire la micropipetta con la soluzione intracellulare e inserirla nel portaelettrodo. Utilizzare il sistema di micromanipolazione per abbassare la pipetta nel bagno ACSF. La resistenza della pipetta varia da 5 a 8 MΩ.
    2. Applicare una piccola quantità di pressione positiva alla pipetta per soffiare via la polvere e i detriti cellulari.
      1. Abbassare l'elettrodo per avvicinarlo alla cella. Quando la pipetta tocca la superficie del neurone FG+, una piccola rientranza della membrana diventa visibile a livello della punta. Rilasciare la pressione positiva.
      2. Quindi, applicare una piccola quantità di pressione negativa alla pipetta utilizzando una siringa. Questo crea una piccola quantità di aspirazione che tira la membrana cellulare a contatto con la pipetta di vetro. Prestare sempre attenzione alla resistenza totale sull'interfaccia software fino a quando il valore della resistenza non aumenta a gigaohm (>1 GΩ). Quindi, si forma il gigaseal.
    3. Bloccare il potenziale di membrana a -70 mV, quindi premere il pulsante di compensazione rapida della capacità sull'interfaccia software dell'amplificatore. Applicare delicatamente una pressione negativa transitoria per rompere la membrana cellulare, quindi premere il pulsante di compensazione della capacità lenta sull'interfaccia software dell'amplificatore. A questo punto, si ottiene una buona configurazione a cellula intera.
    4. Passare alla modalità di pinza amperometrica facendo clic sul pulsante IC sull'interfaccia software e registrare il potenziale di membrana a riposo (RMP).
    5. Applicare l'SCS per 1-2 s con l'ampiezza di 1-10 mA, mentre l'ampiezza e la frequenza dell'impulso sono fissate rispettivamente a 210 μs e 40 Hz. Determinare la soglia motoria aumentando lentamente l'ampiezza della stimolazione fino a quando non si osserva il primo AP.
    6. Distinguere i motoneuroni a fuoco ritardato e immediato utilizzando un'iniezione di corrente depolarizzante di 5 s attorno alla reobase nella modalità current-clamp10,11,12. Motoneuroni a fuoco immediato: una bassa reobase può indurre un'accensione immediata e ripetitiva con una frequenza di attivazione stabile; Motoneuroni a fuoco ritardato: un'elevata base reometrica può indurre un'insorgenza ritardata per l'accensione ripetitiva con una velocità di attivazione accelerata (Figura 3).
    7. Quando SCS è disattivato, continuare a registrare il potenziale di membrana per l'acquisizione dell'attivazione spontanea degli AP.
    8. Eseguire registrazioni voltage-clamp registrazioni voltage-clamp per la corrente postsinaptica eccitatoria (EPSC) quando SCS è acceso e spento. Il parametro di stimolazione è 1x soglia motoria, 210 μs, 2 Hz.

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Representative Results

Grazie al rigoroso mantenimento a bassa temperatura durante l'operazione fine (Figura 1 supplementare, Figura 2 supplementare e Figura 1), la vitalità cellulare è stata sufficiente per eseguire successive registrazioni elettrofisiologiche. Per simulare il più possibile lo scenario clinico, abbiamo utilizzato la micromanipolazione per posizionare il catodo e l'anodo SCS vicino alla linea mediana dorsale e DREZ, rispettivamente (Figura 2), che potrebbe avviare il segnale neurale nel corno dorsale per propagarsi ai motoneuroni nella regione dorsolaterale della colonna motoria. In questo studio, abbiamo utilizzato FG per localizzare i motoneuroni con un diametro di 20-50 μm. Come mostrato nella Figura 2D,G, abbiamo confermato con sicurezza un neurone FG+ sano come un motoneurone, il terminale del circuito spinale. Questo metodo di etichettatura ha aperto la strada allo studio di come l'SCS influisce sul modello di cottura. Le proprietà elettrofisiologiche dei motoneuroni a fuoco ritardato e immediato sono elencate nella Tabella supplementare 1 e nella Tabella supplementare 2. I metodi per il calcolo delle proprietà attive e passive sono forniti nel file supplementare 1.

Quando SCS ha erogato un campo elettrico alternato pulsato alla fetta spinale, abbiamo utilizzato per la prima volta la modalità di pinza di corrente per registrare la risposta del potenziale di membrana (Figura 4). Man mano che aumentavamo gradualmente l'ampiezza della stimolazione con un passo di 1/3 della soglia motoria (Figura 4B,C), anche il potenziale di membrana aumentava con essa, ma solo la soglia motoria 1x poteva suscitare Aps (Figura 4D). La Figura 4D mostra che circa ogni 10-20 impulsi potrebbe suscitare un AP, il che indica che potrebbe esistere una regolarità di risposta AP definita all'ampiezza dell'SCS.

Dopo che l'SCS è stato spento, abbiamo continuato a registrare il potenziale di membrana. La Figura 5 ha mostrato che il potenziale di membrana è leggermente aumentato a -60 mV e il neurone ha sparato una serie di AP spontanei. Questi AP spontanei durano per un breve periodo di tempo (30-40 s), quindi il potenziale di membrana è tornato a -65 mV, indicando che l'SCS può aumentare temporaneamente l'eccitabilità cellulare.

Quindi, abbiamo utilizzato registrazioni voltage-clamp per EPSC quando SCS era acceso e spento (Figura 6). Dopo ogni impulso SCS, è stato possibile rilevare un EPSC evocato. La latenza tra l'artefatto dello stimolo e l'EPSC è stata di 2,64 ± 0,38 ms (Figura 4 supplementare). L'ampiezza delle EPSC evocate è stata di 35,14 ± 12,73 pA (Figura 4 supplementare). La frequenza delle EPSC evocate è coerente con la frequenza delle SCS. Dopo aver sottratto il bilanciamento della carica passiva, l'EPSC evocata può essere osservata in un motoneurone vitale dopo la stimolazione della soglia motoria 1x (Figura 5A supplementare). La polarità della stimolazione è stata invertita dopo aver interrotto la perfusione per 2 ore nella stessa cellula. La stimolazione non ha indotto alcuna EPSC, confermando che l'EPSC evocata non era un artefatto (Figura 5B supplementare).

Figure 1
Figura 1: Dissezione e taglio del midollo spinale . (A) Tagliare la colonna vertebrale in corrispondenza della spina iliaca superiore anteriore (circa il livello vertebrale L4) e il punto di spostamento della curvatura della colonna toracica (circa il livello vertebrale T6), rispettivamente. (B) Trasferire immediatamente la colonna vertebrale isolata nel vassoio anatomico con il lato dorsale rivolto verso l'alto e l'estremità rostrale vicino all'operatore. Riempire la vaschetta anatomica con la soluzione di taglio ghiacciata continuamente ossigenata. (C) Eseguire la laminectomia su entrambi i lati dall'estremità rostrale. (D) Tagliare la dura madre dorsale, che favorisce l'assorbimento dei nutrienti tra le cellule e il liquido cerebrospinale artificiale ossigenato (ACSF). (E) Tagliare con cura la radice nervosa. (F) Tagliare la dura madre ventrale. (G) Separare l'allargamento lombare a una lunghezza di 6-7 mm. (H) Posizionare l'allargamento lombare sull'inclinazione di 35° con il lato dorsale rivolto verso l'alto e l'estremità caudale verso il basso. Utilizzare una carta assorbente da filtro per rimuovere l'abbondante acqua sulla superficie del tessuto. (I) Versare lentamente il gel di agarosio fuso nella capsula di Petri. (J) Tagliare il gel in un cubo e montarlo sul disco del campione con super colla. (K) Posizionare il disco campione nel vassoio di taglio, quindi versare la soluzione di taglio ghiacciata. (L) Un esempio di una fetta spinale all'allargamento lombare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Configurazione della stimolazione del midollo spinale (SCS) e imaging dei motoneuroni. (A) Il generatore di impulsi con elettrodi personalizzati può regolare separatamente l'ampiezza, l'ampiezza dell'impulso e la frequenza. L'ingresso ha mostrato che la specifica dimensionale di un contatto dell'elettrodo è 800 μm x 500 μm x 300 μm. (B) Posizionare l'anodo e il catodo vicino alla linea mediana dorsale e alla zona di ingresso della radice dorsale (DREZ) tramite il sistema di micromanipolazione, rispettivamente. Posizionare la pipetta di registrazione nella regione dorsolaterale della colonna motoria per bloccare i motoneuroni Fluoro-Gold positivi (FG+). (C) Un motoneurone sano a fuoco immediato con imaging al microscopio a contrasto a interferenza differenziale infrarossa (IR-DIC) (60x). (D) Lo stesso neurone con solo imaging a fluorescenza (60x), particelle brillanti di Fluoro-Gold (FG) rappresentano che questo neurone è un motoneurone. (E) Immagine fusa di IR-DIC e fluorescenza nel motoneurone FG+. (F-H) Un motoneurone sano a fuoco ritardato con imaging IR-DIC (60x). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Distinguere i motoneuroni a fuoco ritardato e immediato utilizzando un'iniezione di corrente depolarizzante di 5 s. (A) Motoneuroni a fuoco immediato: la bassa reobase può indurre l'accensione immediata e ripetitiva con frequenza di accensione stabile; (B) Motoneuroni a fuoco ritardato: un'elevata reobase può indurre un inizio ritardato per l'accensione ripetitiva con una velocità di attivazione accelerata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: La stimolazione del midollo spinale (SCS) ha suscitato potenziali d'azione (AP) nei motoneuroni. (A) Quando non è stata applicata alcuna stimolazione, il potenziale di membrana a riposo (RMP) era -65 mV. (B) 1/3 dello stimolo della soglia motoria non può suscitare AP. (C) Lo stimolo della soglia motoria 2/3x non può suscitare AP. (D) 1x lo stimolo di soglia motoria può suscitare AP e ogni 10-20 impulsi può suscitare un AP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Potenziali d'azione spontanei (AP) che si attivano dopo la stimolazione del midollo spinale (SCS). Dopo che l'SCS è stato spento, il neurone ha sparato una serie di AP spontanei per un breve periodo di tempo (30-40 s), quindi il potenziale di membrana a riposo (RMP) è tornato a -65 mV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Illustrazione del parametro di stimolazione del midollo spinale (SCS) e della corrente postsinaptica eccitatoria evocata (EPSC). (A) Illustrazione del parametro SCS; (B,C) A seguito di un singolo impulso di stimolazione (1x stimolazione a soglia motoria), è possibile osservare l'EPSC evocata; (D) Dopo aver sottratto il bilanciamento della carica passiva, è possibile calcolare la latenza e l'ampiezza dell'EPSC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Preparazione dello strumento. (A) Vassoio di perfusione: 10 minuti prima della perfusione, posizionare il ghiaccio tritato sulla capsula di Petri da 10 cm riempita di gel di silice. (B) Vassoio anatomico: la notte prima del sacrificio, posizionare il vassoio anatomico autocostruito riempito di gel di silice nel frigorifero a -80 °C. (C) Vassoio di taglio: la sera prima del sacrificio, posizionare il vassoio di taglio con la fascetta d'acqua nel frigorifero a -80 °C. (D) Pendenza di colata di agarosio: 30 minuti prima della perfusione, posizionare una pendenza di agarosio di 35° con piastre di base al centro di una capsula di Petri da 35 mm. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 2 supplementare: Perfusione intracardica. (A) Sollevare il processo xifoideo. (B) Tagliare lo sterno lungo entrambi i lati del processo xifoideo per aprire il torace ed esporre il cuore. Fare attenzione a non danneggiare i vasi toracici interni, altrimenti un'emorragia massiccia riempirà l'intero campo operatorio e impedirà all'operatore di identificare l'apice del ventricolo o l'atrio destro. (C) Inserire un ago da 22 G all'apice del ventricolo sinistro per la perfusione e tagliare l'atrio destro per l'uscita del fluido. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura supplementare 3: Conferma dell'attività della radice dorsale. Utilizzare elettrodi di aspirazione per applicare 1x stimolazione di soglia motoria alla radice dorsale. Se un potenziale d'azione evocato viene rilevato nei motoneuroni, possiamo confermare che l'attività della radice dorsale è intatta. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 4 supplementare: Latenza e ampiezza delle EPSC evocate quando la SCS era attiva. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura supplementare 5: Dimostrazione della validità dell'EPSC evocato. (A) A seguito di una stimolazione della soglia motoria 1x dopo aver sottratto il bilanciamento della carica passiva, l'EPSC evocata può essere osservata in un motoneurone vitale; (B) Dopo aver interrotto la perfusione per 2 ore nella stessa cellula, la polarità della stimolazione è stata invertita, la stimolazione della soglia motoria 1x non ha indotto alcuna EPSC, il che ha confermato che l'EPSC evocata non era un artefatto. Fare clic qui per scaricare il file.

File supplementare 1: Metodi di calcolo delle proprietà attive e passive. Fare clic qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 1: Proprietà passive dei motoneuroni. Fare clic qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 2: Proprietà attive dei motoneuroni Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Le informazioni di movimento modulate da SCS vengono infine condivise nei motoneuroni. Pertanto, prendere i motoneuroni come obiettivo di ricerca può semplificare il disegno dello studio e rivelare il meccanismo di neuromodulazione della SCS in modo più diretto. Per registrare simultaneamente diverse caratteristiche di stimolo e risposte cellulari, un patch-clamp è un buon metodo per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche su scala di singola cellula. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà, tra cui come mantenere la vitalità cellulare, come separare rapidamente il midollo spinale dalla struttura ossea e come utilizzare l'SCS per indurre AP con successo. Pertanto, questo studio mira ad aiutare i ricercatori a cogliere rapidamente le competenze operative essenziali, evitare alcune possibili insidie e concentrarsi sul disegno dello studio piuttosto che sulla metodologia il prima possibile.

Per ottenere una buona vitalità cellulare, si dovrebbe sempre prestare attenzione ai seguenti dettagli: (1) Mantenere il midollo spinale a temperatura glaciale è molto importante perché la bassa temperatura può inibire la morte cellulare e rallentare il tasso metabolico, che può proteggere il neurone da danni meccanici durante la perfusione, la dissezione e il taglio13; (2) La rimozione delicata della dura madre mediante microforbice può migliorare l'assorbimento dei nutrienti neuronali dalle soluzioni circostanti. Non staccare mai direttamente la dura madre; In caso contrario, il midollo spinale sarà gravemente danneggiato. Inoltre, se dimentichi di pulire la dura madre, il successivo processo di affettatura potrebbe essere difficile perché la lama potrebbe non tagliare completamente la dura madre e quindi strappare il restante midollo spinale dall'agarosio, il che potrebbe portare al fallimento dell'affettatura. (3) Rispetto alla fetta trasversale convenzionale, le fette oblique aumentano l'area della materia grigia e puoi trovare più motoneuroni FG+ in una singola fetta9. (4) Poiché il midollo spinale da solo non può essere fissato saldamente sul disco del campione come il cervello, incorporarlo nel gel di agarosio è efficace nel risolvere questo problema senza diminuire la vitalità cellulare. Si consiglia di utilizzare agarosio a basso punto di fusione (punto di gel 26-30 °C) piuttosto che agarosio convenzionale (punto di gel 38-43 °C), perché l'alta temperatura può danneggiare la vitalità cellulare. (5) Si consiglia che la distanza tra due fili di nylon del filo di platino a forma di U sia compresa tra 1 e 1,5 mm perché i fili sciolti non possono immobilizzare saldamente il midollo spinale e i fili densi possono schiacciare la cellula.

Rispetto ai dispositivi di stimolazione convenzionali, come gli elettrodi a uncino bipolare ampiamente utilizzati nella ricerca di base, l'elettrodo SCS in questo studio deriva dal nostro precedente lavoro clinico14 e dalla ricerca di base15. SCS eroga una stimolazione elettrica alternata pulsata, che fornisce diverse dimensioni di regolazione dei parametri. Questo dispositivo SCS ha anche una funzione di bilanciamento della carica per evitare l'elettrolisi dei tessuti e non entra direttamente in contatto con il tessuto neurale; pertanto, questo SCS ha una buona sicurezza per le applicazioni in vivo .

Dopo il trattamento con SCS, gli AP spontanei dei motoneuroni possono essere attribuiti ai seguenti motivi: (1) SCS induce la carica ad accumularsi nel corpo cellulare e nel collicolo assonale dei neuroni, portando all'aumento di RMP16. Questo fenomeno indica che la SCS può migliorare l'eccitabilità del neurone, che può essere correlata al cambiamento di conduttività dei canali ionici dopo la SCS, come Na v 1.117, K v 2.1 18 o Ca v 2.319. (2) La SCS può attivare i neuroni GABAergici dorsali per facilitare il feedback propriocettivo ai motoneuroni. Suggeriamo che la trasmissione neurale possa esistere continuamente tra i neuroni sensoriali e i motoneuroni, portando ad AP spontanei nei motoneuroni dopo SCS. Gli AP spontanei possono mantenere uno stato intrinseco di prontezza ad eseguire comportamenti sensomotori20. Pertanto, l'attivazione o l'inibizione di AP spontanei può essere utile per il trattamento delle malattie neurologiche spinali.

Come sappiamo, la registrazione elettrofisiologica in vivo è migliore per rilevare la risposta elettrofisiologica sotto la distribuzione naturale del campo elettrico e il posizionamento degli elettrodi. Inoltre, le registrazioni in vivo dei motoneuroni consentono l'identificazione dell'identità dei motoneuroni. Questo può essere fatto attraverso l'identificazione antidromica degli assoni motori accoppiata con la misurazione della forza delle fibre muscolari21. Ma le registrazioni del midollo spinale in vivo presentano anche i seguenti inconvenienti: (1) Il motoneurone si trova a 2-3 mm di distanza dalla superficie dorsale del midollo spinale, anche utilizzando l'imaging confocale a due fotoni più avanzato, la profondità di osservazione è di soli 500-800 μm, quindi è difficile osservarli otticamente in vivo utilizzando i metodi esistenti. Pertanto, se vogliamo bloccare esattamente un singolo motoneurone in vivo, la pipetta di vetro deve passare attraverso la colonna dorsale per raggiungere il motoneurone invisibile; Il patch-clamp in vivo può essere eseguito solo in modo "cieco", con conseguente incertezza e tasso di guasto significativi. (2) Fatta eccezione per il patch-clamp in vivo , le registrazioni con elettrodi di silicio possono essere il metodo alternativo, come l'array Utah o l'elettrodo Neuropixels. Tuttavia, i segnali registrati dagli elettrodi di silicio sono per lo più potenziali d'azione composti piuttosto che potenziali d'azione singoli. Sebbene l'attività dei singoli neuroni sia stata risolta utilizzando algoritmi di spike-sorting, l'accuratezza e l'affidabilità degli algoritmi di ordinamento devono ancora essere migliorate.

Rispetto alle registrazioni in vivo, il più grande vantaggio della registrazione in vitro rispetto a quella in vivo è l'uso del voltage clamp, che consente una comprensione unica delle vie sinaptiche attivate da SCS. Inoltre, consentirebbe anche l'uso di strumenti di imaging dal vivo. Ipotizziamo che la SCS induca il rilascio di neurotrasmettitori come il GABA e il glutammato dai neuroni di livello superiore sui motoneuroni, con conseguente risposta eccitatoria complessivadell'EPSC 7. Pertanto, nella nostra prossima ricerca, incorporeremo il rilevamento di IPSC, mini EPSC (mEPSC) e EPSC evocate indotte da SCS per chiarire i modelli di rilascio di neurotrasmettitori inibitori ed eccitatori da neuroni o interneuroni pre-motori. Abbiamo pienamente riconosciuto che la stimolazione in vitro ha anche alcune limitazioni: (1) i circuiti longitudinali a lungo raggio del midollo spinale sono interrotti, con conseguente perdita di informazioni in entrata dalla corteccia motoria o dagli arti inferiori; (2) La distribuzione dei campi elettrici durante la stimolazione in vitro può differire da quella della stimolazione in vivo. In questo studio, la soglia di attivazione (approssimativamente in milliampere) per gli AP era molto più alta di quella dell'esperimento in vivo (approssimativamente in microampere)15; ciò era dovuto al fatto che la capacità volumetrica della soluzione ACSF nella camera di registrazione era molto più alta del liquido cerebrospinale allo stato naturale e la teoria matematica sostiene che il campo elettrico si attenua più velocemente nei materiali ad alta conduttività22. Pertanto, la maggior parte della corrente è stata assorbita dalla soluzione del bagno e ipotizziamo che solo una piccola parte del campo elettrico possa diffondersi alle radici nervose.

Pertanto, considerando i vantaggi e gli svantaggi della stimolazione in vivo e della stimolazione in vitro , si può concludere che il patch-clamp in vitro è un metodo vantaggioso per studiare la natura sinaptica e/o gli effetti cellulari della SCS nei roditori neonatali.

Nella pratica clinica, l'elettrodo non contrae direttamente la superficie del midollo spinale o la radice nervosa23. Invece, si basa sulla radiazione del campo elettrico generato dall'elettrodo per influenzare indirettamente l'attività dei nervi1. Diversi studi 1,23,24 hanno confermato che il contatto catodico di SCS dovrebbe essere posizionato il più vicino possibile alla radice dorsale o alla zona di ingresso (DREZ) per ottenere una selettività ottimale per la stimolazione di un muscolo specifico. L'aumento della distanza tra l'elettrodo e la radice nervosa indebolirà la specificità della stimolazione. Pertanto, posizioniamo direttamente il catodo vicino al DREZ piuttosto che entrare direttamente in contatto con la radice nervosa o il midollo spinale.

Le fibre afferenti della radice dorsale proiettano prima ai neuroni sensoriali, poi agli interneuroni e ai motoneuroni. Oltre ai circuiti di proiezione trasversale, ci sono anche circuiti che proiettano verso l'estremità rostrale e caudale. Ad esempio, i motoneuroni corrispondenti al muscolo tibiale anteriore possono essere trovati a più livelli25. Pertanto, sebbene la preparazione obliqua possa recidere i circuiti di proiezione trasversali, preserverà comunque le fibre di proiezione non trasversali, consentendo lo studio dei circuiti sensoriali pre-motori. Oltre alla preparazione obliqua e trasversale, la preparazione longitudinale offre vantaggi distinti per preservare meglio i circuiti dalla radice dorsale ai motoneuroni e consentire l'efficace ritenzione dei circuiti del midollo spinale su più segmenti26, il che fornisce una rappresentazione più fedele delle condizioni fisiologiche reali.

Secondo la ricerca di simulazione 6,27,28, la SCS attiva principalmente le fibre afferenti propriocettive per ripristinare il movimento degli arti inferiori, comprese le fibre afferenti Ia, Ib e II. Tuttavia, in questo studio, non possiamo confermare con sicurezza quali tipi di fibre sono stati specificamente attivati da SCS. Ipotizziamo che un modello simile possa esistere anche nel patch clamp in vitro. Affronteremo questo problema conducendo modelli e simulazioni matematiche e incorporandoli nel nostro lavoro in corso.

In conclusione, questo protocollo può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità operative e a comprendere gli elementi essenziali della combinazione di registrazioni patch-clamp e SCS per studiare il meccanismo elettrico della SCS su scala di singola cellula.

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Disclosures

Nessuno

Acknowledgments

Questo studio è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 e 82301657) e dal China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Ascorbic Acid Sigma A4034
CaCl2·2H2O Sigma C5080
Choline Chloride Sigma C7527
Cover slide tweezers VETUS 36A-SA Clip a slice
D-Glucose Sigma G8270
EGTA Sigma E4378
Fine scissors RWD Life Science S12006-10 Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source Olympus  U-HGLGPS
Fluoro-Gold Fluorochrome Fluorochrome Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877
HEPES Sigma H3375
infrared CCD camera Dage-MTI IR-1000E
KCl Sigma P5405
K-gluconate Sigma P1847
Low melting point agarose Sigma A9414
MgSO4·7H2O Sigma M2773
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-200
Micropipette puller Sutter instrument P1000
Micro-scissors  Jinzhong wa1020 Laminectomy
Microscope for anatomy Olympus  SZX10
Microscope for ecletrophysiology Olympus  BX51WI
Micro-toothed tweezers RWD Life Science F11008-09 Lift the cut vertebral body
NaCl Sigma S5886
NaH2PO4 Sigma S8282
NaHCO3 Sigma V900182
Na-Phosphocreatine Sigma P7936
Objective lens for ecletrophysiology Olympus  LUMPLFLN60XW working distance 2 mm 
Osmometer  Advanced  FISKE 210
Patch-clamp amplifier  Axon  Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer Axon  Digidata 1550B
pH meter  Mettler Toledo  FE28
Slice Anchor Multichannel system SHD-27H
Spinal cord stimulatior PINS T901
Toothed tweezer RWD Life Science F13030-10 Lift the xiphoid
Vibratome Leica VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter Olympus  U-MF2

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References

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La preparazione <em>ex vivo</em> di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale
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Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L.… More

Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L. The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation. J. Vis. Exp. (199), e65385, doi:10.3791/65385 (2023).

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