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Neuroscience

La preparación ex vivo del corte de la médula espinal para el registro de patch-clamp de células enteras en neuronas motoras durante la estimulación de la médula espinal

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65385
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,2
1National Engineering Research Center of Neuromodulation, School of Aerospace Engineering, Tsinghua University, 2IDG/McGovern Institute for Brain Research, Tsinghua University, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

Summary

Este protocolo describe un método que utiliza una pinza de parche para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras a la estimulación de la médula espinal (SCS) con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular simultáneamente.

Abstract

La estimulación de la médula espinal (SCS, por sus siglas en inglés) puede restaurar eficazmente la función locomotora después de una lesión de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés). Debido a que las neuronas motoras son la unidad final para ejecutar los comportamientos sensoriomotores, el estudio directo de las respuestas eléctricas de las neuronas motoras con SCS puede ayudarnos a comprender la lógica subyacente de la modulación motora espinal. Para registrar simultáneamente diversas características de estímulos y respuestas celulares, un patch-clamp es un buen método para estudiar las características electrofisiológicas a escala de una sola célula. Sin embargo, todavía existen algunas dificultades complejas para lograr este objetivo, incluido el mantenimiento de la viabilidad celular, la separación rápida de la médula espinal de la estructura ósea y el uso del SCS para inducir con éxito potenciales de acción. Aquí, presentamos un protocolo detallado que utiliza patch-clamp para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras al SCS con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular al mismo tiempo para estudiar sin problemas el mecanismo eléctrico del SCS en la neurona motora y evitar pruebas y errores innecesarios.

Introduction

La estimulación de la médula espinal (SCS, por sus siglas en inglés) puede restaurar eficazmente la función locomotora después de una lesión de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés). Andreas Rowald et al. informaron que el SCS permite la función locomotora y troncal de las extremidades inferiores en un solo día1. La exploración del mecanismo biológico del SCS para la recuperación locomotora es un campo de investigación crítico y de tendencia para desarrollar una estrategia de SCS más precisa. Por ejemplo, el equipo de Grégoire Courtine demostró que la interneurona excitadora Vsx2 y las neuronas Hoxa10 en la médula espinal son las neuronas clave para la respuesta al SCS, y la neuromodulación específica de la célula es factible para restaurar la capacidad de caminar de la rata después de la LME2. Sin embargo, pocos estudios se centran en el mecanismo eléctrico del SCS a escala de una sola célula. Aunque es bien sabido que el estímulo de corriente continua supraumbral puede provocar los potenciales de acción (AP) en el experimento clásico del calamar 3,4,5, aún no está claro cómo la estimulación eléctrica alterna pulsada, como la SCS, afecta a la generación de señales motoras.

Dada la complejidad de los circuitos neuronales intraespinales, la selección adecuada de la población celular es importante para investigar el mecanismo eléctrico del SCS. Aunque el SCS restaura la función motora mediante la activación de la vía propioceptiva6, las neuronas motoras son la unidad final para ejecutar el comando motor, derivado de la integración de la información de la propiocepción de entrada aferente7. Por lo tanto, el estudio directo de las características eléctricas de las neuronas motoras con SCS puede ayudarnos a comprender la lógica subyacente de la modulación motora espinal.

Como sabemos, el patch-clamp es el método de referencia para el registro electrofisiológico celular con una resolución espacio-temporal extremadamente alta8. Por lo tanto, este estudio describe un método que utiliza una pinza de parche para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras al SCS. En comparación con el parche cerebral9, el parche clamp de la médula espinal es más difícil debido a las siguientes razones: (1) La médula espinal está protegida por el canal vertebral con un volumen minúsculo, lo que requiere una micromanipulación muy fina y un riguroso mantenimiento en frío para obtener una mejor viabilidad celular. (2) Debido a que la médula espinal es demasiado delgada para asegurarla en la bandeja de corte, debe sumergirse en agarosa de bajo punto de fusión y recortarse después de la solidificación.

Por lo tanto, este método proporciona detalles técnicos para diseccionar la médula espinal y mantener la viabilidad celular al mismo tiempo para estudiar sin problemas el mecanismo eléctrico del SCS en las neuronas motoras y evitar pruebas y errores innecesarios.

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Protocol

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales aprobó todos los experimentos con animales y los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con las normas pertinentes de bienestar animal.

1. Preparación de los animales

  1. Animales
    1. Información sobre el alojamiento: Aloje ratas macho Sprague-Dawley (Postnatal 10-14 días, P10-P14) en un ambiente específico libre de patógenos.
      NOTA: Las condiciones de la habitación se mantuvieron a 20 °C ± 2 °C, humedad: 50%-60%, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los animales tenían libre acceso a comida y agua.
    2. Etiquetar las neuronas motoras retrógradamente: Inyectar Fluoro-Gold (FG) en el tibial bilateral anterior y en el músculo gastrocnemio (2% en solución salina estéril, 50 μL por músculo) para etiquetar retrógradamente las neuronas motoras 2 días antes del sacrificio.
  2. Soluciones
    1. Prepare la solución de corte: Mezcle 120 mM de cloruro de colina, 2,6 mM de KCl, 26 mM de NaHCO 3, 1,25 mM de NaH 2 PO4, 0,5 mM de CaCl 2, 7 mM de MgCl 2, 1,3 mM de ácido ascórbico, 15 mM de glucosa. Pre-burbujee la solución con 95% deO2 y 5% de CO2 (ajuste a pH 7.4 con KOH) durante 30 minutos antes de la disección y el corte. Enfríe la solución con hielo picado.
    2. Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF): Mezclar 126 mM de NaCl, 3 mM de KCl, 1,2 mM de NaH2PO4; 1,3 mM de MgCl 2, 2,4 mM de CaCl2, 26 mM de NaHCO3 y 10 mM de glucosa. Preburbujee la solución con 95% deO2 y 5% de CO2 durante 30 minutos antes de la incubación.
    3. Preparar la solución intracelular: Mezclar 126 mM de K-gluconato, 2 mM de KCl, 2 mM de MgCl 2, 0,2 mM de EGTA, 10 mM de HEPES, 4 mM de Na 2 ATP, 0,4 mM de Na2GTP, 10 mM de K-fosfocreatina y0,5% de neurobiotina (pH 7,25 y 305 mOsm/kg). Enfríe la solución con hielo picado.
    4. Prepare gel de agarosa de bajo punto de fusión: Disuelva 4 g de agarosa en 100 ml de solución de corte y use un rotor de agitación magnética para disolverlo por completo. A los 30 minutos antes de la inmersión, calentar la agarosa de bajo punto de fusión en el horno microondas a alta potencia durante 1 min, y luego transferirla a un baño de agua a 39 °C para mantener el estado líquido.
  3. Preparación del instrumento
    1. Coloque hielo picado en la bandeja de perfusión (Figura suplementaria 1A) 10 min antes de la perfusión. Coloque la bandeja anatómica (Figura complementaria 1B) y la bandeja de corte (Figura complementaria 1C) con una banda de agua a -80 °C durante la noche con antelación.
    2. Coloque la cámara de incubación con malla de nailon en el horno a 45 °C durante la noche con anticipación.
    3. Utilice agarosa de bajo punto de fusión para prefabricar una pendiente de 35° y una plataforma de 2 mm de espesor (Figura complementaria 1D). Después de la solidificación del gel, colóquelos en el centro de una placa de Petri de 35 mm para sostener la médula espinal en los próximos procedimientos.
  4. Perfusión intracárdica
    1. Anestesiar a las ratas con tribromoetanol al 2,5% (160 μL/10 g) mediante inyección intraperitoneal. Asegúrese de que las ratas estén completamente anestesiadas verificando la falta de respuesta a estímulos externos, como un suave pellizco del dedo del pie.
    2. Cuando se confirme la anestesia adecuada, coloque a las ratas en decúbito supino e inmovilícelas en la placa de Petri llena de gel de sílice.
    3. Realice una incisión cutánea longitudinal de 5 mm caudalmente hasta la apófisis xifoides, luego expanda completamente el espacio subcutáneo. Realice una incisión longitudinal de 2 cm en la piel a lo largo de la línea media ventral para exponer completamente la pared torácica externa, comenzando con la incisión mencionada anteriormente y terminando con la parte superior del tórax.
    4. Use pinzas dentadas para levantar el xifoides (Figura complementaria 2A) y luego use tijeras finas para cortar el diafragma. Cortar el esternón a lo largo de ambos lados de la apófisis xifoides para abrir el tórax y exponer el corazón (Figura complementaria 2B).
      NOTA: Tenga cuidado de preservar los vasos torácicos internos en ambos lados; de lo contrario, puede causar un sangrado masivo.
    5. Use pinzas desdentadas para levantar el ventrículo izquierdo. Inserte una aguja de 22 G en el ápice del ventrículo izquierdo a lo largo del eje longitudinal del ventrículo izquierdo (Figura complementaria 2C). Mientras tanto, observe la pulsación rítmica de la sangre en el tubo de perfusión, o la aguja puede perforarse en el ventrículo derecho, lo que puede provocar un efecto de perfusión deficiente.
      NOTA: No se debe utilizar pinza dentada; de lo contrario, puede causar una fuga de sangre adicional del sitio de sujeción de la pinza.
    6. Use unas tijeras finas para cortar la aurícula derecha (Figura complementaria 2C), luego inyecte manualmente 100 ml de líquido perfundidor helado a una velocidad de aproximadamente 2 ml/s en 1 minuto.
      NOTA: Cuando el hígado y las patas de las ratas se vuelven pálidos y no fluye sangre por la aurícula derecha, se puede lograr una buena perfusión.
  5. Disección de la médula espinal (Figura 1)
    1. Coloque a la rata en decúbito prono y corte la columna vertebral en la espina ilíaca anterosuperior (aproximadamente a nivel vertebral L4) y el punto de desplazamiento de la curvatura de la columna torácica (aproximadamente el nivel vertebral T6), respectivamente (Figura 1A). Luego, coloque inmediatamente la columna vertebral aislada en la solución perfundida oxigenada helada para lavar la sangre residual y el tejido graso; Este procedimiento es beneficioso para mantener limpio el campo operativo en los procedimientos posteriores.
      NOTA: Los músculos paraespinales deben reservarse, lo que favorece la posterior fijación de la columna vertebral mediante el uso de un alfiler para insectos.
    2. Transfiera inmediatamente la columna vertebral aislada a la bandeja anatómica (Figura 1B) con el lado dorsal hacia arriba y el extremo rostral cerca del operador. Llene la bandeja anatómica con 50 ml de solución de corte helada oxigenada continuamente (Figura 1B).
    3. Use cuatro clavos de insectos para fijar la columna vertebral penetrando los músculos paraespinales (Figura 1B).
    4. Bajo el microscopio de disección, corte los pedículos vertebrales de ambos lados desde el extremo rostral con la microtijera, lo que se puede denominar "laminectomía" (Figura 1C). Preste atención para no dañar la médula espinal. Mientras tanto, use las pinzas microdentadas para levantar el cuerpo vertebral cortado.
    5. Después de la laminectomía, no separe la médula espinal del canal espinal inmediatamente. En su lugar, utilice una microtijera para cortar la duramadre a lo largo de la línea media dorsal, que favorece la absorción de nutrientes entre las células y la ACSF oxigenada (Figura 1D).
      NOTA: Nunca desgarre la duramadre. Solo se permite cortar la duramadre con una microtijera; De lo contrario, la raíz nerviosa y el parénquima espinal se dañarán gravemente.
    6. Levante la parte rostral de la médula espinal, luego corte con cuidado la raíz nerviosa con aproximadamente 1 mm reservado (Figura 1E). Después de separar la médula espinal del canal vertebral, use 2 clavos para insectos para fijar la médula espinal con el lado ventral hacia arriba (Figura 1F).
    7. Use una microtijera para cortar la duramadre a lo largo de la línea media ventral (Figura 1F). Corta las raíces nerviosas redundantes con aproximadamente 1 mm reservado.
      NOTA: El nervio es mucho más tenaz que la médula espinal. Si la raíz nerviosa reservada es demasiado larga (>1 mm), el vibrátomo no puede cortar la raíz nerviosa, lo que puede provocar un desgarro grave en el parénquima espinal.
    8. Utilice una microtijera para separar el agrandamiento lumbar a una longitud de 6-7 mm (Figura 1G).
  6. Incrustación en la agarosa de bajo punto de fusión
    1. Coloque el agrandamiento lumbar en la pendiente de 35 ° (Figura 1H) con el lado dorsal hacia arriba y el extremo caudal hacia abajo. Utilice un papel de filtro absorbente para eliminar la abundante agua de la superficie del tejido (Figura 1H).
    2. Vierta lentamente el gel de agarosa fundido en la placa de Petri que contiene el agrandamiento lumbar (Figura 1I).
      NOTA: No vierta demasiado rápido, o se acumularán burbujas en el gel.
    3. Coloque la placa de Petri anterior en la mezcla de agua helada para enfriar el gel lo antes posible, lo que favorece el mantenimiento de la actividad de las células.
    4. Recorte el gel en un cubo de 15 mm x 10 mm x 10 mm y móntelo en el disco de muestra con superpegamento (Figura 1J).
  7. Rebanar
    1. Coloque el disco de muestra en la bandeja de corte precongelada, luego vierta la solución de corte helada (Figura 1K). Burbujear continuamente con 95% de CO2 y 5% deO2 en la bandeja de corte.
    2. Ajuste los parámetros del vibratomo: espesor: 350 μm; velocidad: 0,14-0,16 mm/s, amplitud: 1,0 mm y frecuencia de vibración: 85 Hz.
    3. Coseche 2-3 rodajas adecuadas por animal. Registre 1-2 neuronas motoras FG+ sanas por corte, con un rango de 5-6 células por animal.
  8. Incubación
    1. Use pinzas deslizantes para sujetar una rebanada (Figura 1L) y colóquela en la cámara de incubación llena de ACSF oxigenado continuamente. Coloque la cámara de incubación en un baño de agua a 32 °C durante 30 minutos y luego continúe incubándola a temperatura ambiente (RT) durante otros 30 minutos antes del registro.
      NOTA: Los procedimientos anteriores, desde la anestesia hasta la obtención de la primera rebanada, deben completarse dentro de los 20-30 minutos para mantener la viabilidad de las células tanto como sea posible. Las neuronas motoras de cada corte pueden mantener su viabilidad durante aproximadamente 6-7 h.

2. Registro de patch-clamp con SCS (Figura 2)

  1. Preparativos
    1. Perfundir la cámara de grabación con ACSF de burbujas continuas a una velocidad de aproximadamente 1-2 ml/min. Ajuste el caudal individualmente a través del panel de control de la bomba peristáltica.
    2. Coloque una rebanada en la cámara de grabación. Use el alambre de platino en forma de U con hilos de nailon para estabilizar firmemente la rebanada en su lugar.
    3. Utilice un microscopio infrarrojo de contraste de interferencia diferencial (IR-DIC) para observar el corte. Bajo la lente del objetivo 4x, confirme que la longitud de la raíz dorsal es de aproximadamente 1 mm. Encuentre el área donde la raíz dorsal ingresa al parénquima, luego mueva el campo de visión central a esta área.
    4. Conecte el generador de impulsos con electrodos hechos a medida (Figura 2A).
  2. Configuración de SCS
    1. Coloque el ánodo de SCS cerca de la línea media dorsal a través del sistema de micromanipulación (Figura 2B).
    2. Coloque el cátodo de SCS cerca de la zona de entrada de la raíz dorsal (DREZ) a través del sistema de micromanipulación (Figura 2B).
  3. Focalización celular e imágenes
    1. Utilice IR-DIC con una lente de objetivo de 10x para encontrar aproximadamente la región dorsolateral de la columna motora, donde se encuentran la mayoría de las neuronas motoras. Luego, mueva el campo de visión central a esta área.
    2. Cambie a una lente de objetivo de 60x para encontrar una neurona sana con una superficie lisa y brillante y núcleos invisibles (Figura 2C, F).
    3. Baje ligeramente la intensidad de los infrarrojos y encienda la fuente de luz de fluorescencia. Cambie el filtro de luz al filtro de excitación ultravioleta de banda ancha (Figura 2D, G), para seleccionar una neurona motora FG positiva (FG+) adecuada (Figura 2E, H).
    4. Utilice electrodos de succión para aplicar 1 estimulación del umbral motor a la raíz dorsal. Si se detecta un potencial de acción evocado en las neuronas motoras (Figura suplementaria 3), se confirma que la actividad de la raíz dorsal está intacta. De lo contrario, esta porción debe descartarse.
  4. Grabación de patch-clamp
    1. Llene la micropipeta con la solución intracelular e insértela en el portaelectrodos. Utilice el sistema de micromanipulación para bajar la pipeta al baño ACSF. La resistencia de la pipeta oscila entre 5 y 8 MΩ.
    2. Aplique una pequeña cantidad de presión positiva a la pipeta para eliminar el polvo y los residuos celulares.
      1. Baje el electrodo para acercarse a la celda. Cuando la pipeta toca la superficie de la neurona FG+, se hace visible una pequeña hendidura de la membrana a nivel de la punta. Libere la presión positiva.
      2. A continuación, aplique una pequeña cantidad de presión negativa a la pipeta con una jeringa. Esto crea una pequeña cantidad de succión que hace que la membrana celular entre en contacto con la pipeta de vidrio. Siempre preste atención a la resistencia total en la interfaz del software hasta que el valor de resistencia aumente a gigaohmios (>1 GΩ). A continuación, se forma el gigaseal.
    3. Sujete el potencial de membrana a -70 mV, luego presione el botón de compensación rápida de capacitancia en la interfaz de software del amplificador. Aplique suavemente una presión negativa transitoria para romper la membrana celular, luego presione el botón de compensación de capacitancia lenta en la interfaz de software del amplificador. En este punto, se obtiene una buena configuración de la célula entera.
    4. Cambie al modo de pinza amperimétrica haciendo clic en el botón IC en la interfaz del software y registre el potencial de membrana en reposo (RMP).
    5. Aplique el SCS durante 1-2 s con una amplitud de 1-10 mA, mientras que el ancho de pulso y la frecuencia se fijan en 210 μs y 40 Hz, respectivamente. Determinar el umbral motor aumentando lentamente la amplitud de estimulación hasta que se observe el primer PA.
    6. Distinga las neuronas motoras de disparo retardado e inmediato utilizando una inyección de corriente despolarizante de 5 s alrededor de la reobase en el modo de pinza de corriente10,11,12. Activación inmediata de las neuronas motoras: Una reobase baja puede inducir una activación inmediata y repetitiva con una frecuencia de disparo estable; Neuronas motoras de disparo retardado: La reobase alta puede inducir un inicio tardío de disparo repetitivo con una velocidad de disparo acelerada (Figura 3).
    7. Cuando el SCS está apagado, continúe registrando el potencial de membrana para capturar el disparo espontáneo de los AP.
    8. Realice grabaciones de pinza amperimétrica para la corriente postsináptica excitatoria (EPSC) cuando SCS está encendido y apagado. El parámetro de estimulación es 1x umbral motor, 210 μs, 2 Hz.

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Representative Results

Gracias al riguroso mantenimiento a baja temperatura durante la operación fina (Figura suplementaria 1, Figura suplementaria 2 y Figura 1), la viabilidad de la celda fue lo suficientemente buena como para realizar registros electrofisiológicos posteriores. Para simular al máximo el escenario clínico, utilizamos la micromanipulación para colocar el cátodo y el ánodo del SCS cerca de la línea media dorsal y el DREZ, respectivamente (Figura 2), lo que podría iniciar la señal neuronal en el asta dorsal para propagarse a las neuronas motoras en la región dorsolateral de la columna motora. En este estudio, utilizamos FG para localizar las neuronas motoras con un diámetro de 20-50 μm. Como se muestra en la Figura 2D, G, confirmamos con confianza una neurona FG+ sana como una neurona motora, la terminal del circuito espinal. Este método de etiquetado allanó el camino para estudiar cómo el SCS afecta el patrón de disparo. Las propiedades electrofisiológicas de las neuronas motoras de disparo retardado e inmediato se enumeran en la Tabla Suplementaria 1 y en la Tabla Suplementaria 2. Los métodos para calcular las propiedades activas y pasivas se proporcionan en el Archivo Complementario 1.

Cuando el SCS suministró un campo eléctrico alterno pulsado al corte espinal, primero utilizamos el modo de pinza amperimétrica para registrar la respuesta del potencial de membrana (Figura 4). A medida que aumentamos gradualmente la amplitud de la estimulación con un paso de 1/3 del umbral motor (Figura 4B, C), el potencial de membrana también aumentó con él, pero solo 1x umbral motor pudo provocar Aps (Figura 4D). La Figura 4D muestra que aproximadamente cada 10-20 pulsos podrían provocar un AP, lo que indica que podría existir una regularidad definida de la respuesta del AP a la amplitud del SCS.

Después de que se apagó el SCS, continuamos registrando el potencial de membrana. La Figura 5 mostró que el potencial de membrana aumentó ligeramente a -60 mV, y la neurona disparó una serie de AP espontáneos. Estos AP espontáneos duran un corto período de tiempo (30-40 s), luego el potencial de membrana regresa a -65 mV, lo que indica que el SCS puede aumentar temporalmente la excitabilidad celular.

A continuación, utilizamos grabaciones de pinza de tensión para EPSC cuando el SCS estaba encendido y apagado (Figura 6). Después de cada pulso de SCS, se podía detectar un EPSC evocado. La latencia entre el artefacto estímulo y el EPSC fue de 2,64 ± 0,38 ms (Figura suplementaria 4). La amplitud de las EPSC evocadas fue de 35,14 ± 12,73 pA (Figura suplementaria 4). La frecuencia de las EPSC evocadas es coherente con la frecuencia de las SCS. Después de restar el equilibrio de carga pasiva, se puede observar la EPSC evocada en una neurona motora viable después de una estimulación del umbral motor 1x (Figura suplementaria 5A). La polaridad de estimulación se invirtió después de detener la perfusión durante 2 h en la misma célula. La estimulación no indujo ningún EPSC, lo que confirma que el EPSC evocado no era un artefacto (Figura suplementaria 5B).

Figure 1
Figura 1: Disección y corte de la médula espinal . (A) Cortar la columna vertebral en la espina ilíaca anterosuperior (aproximadamente el nivel vertebral L4) y el punto de cambio de curvatura de la columna torácica (aproximadamente el nivel vertebral T6), respectivamente. (B) Transfiera inmediatamente la columna vertebral aislada a la bandeja anatómica con el lado dorsal hacia arriba y el extremo rostral cerca del operador. Llene la bandeja anatómica con la solución de corte continuamente oxigenada y helada. (C) Realizar laminectomía en ambos lados desde el extremo rostral. (D) Cortar la duramadre dorsal, que es propicia para la absorción de nutrientes entre las células y el líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado (ACSF). (E) Cortar con cuidado la raíz nerviosa. (F) Cortar la duramadre ventral. (G) Separe el agrandamiento lumbar a una longitud de 6-7 mm. (H) Coloque el agrandamiento lumbar en la pendiente de 35 ° con el lado dorsal hacia arriba y el extremo caudal hacia abajo. Use un papel de filtro absorbente para eliminar abundante agua en la superficie del tejido. (I) Vierta lentamente el gel de agarosa fundido en la placa de Petri. (J) Recorte el gel en un cubo y móntelo en el disco de muestra con superpegamento. (K) Coloque el disco de muestra en la bandeja de corte, luego vierta la solución de corte helada. (L) Un ejemplo de un corte espinal en el agrandamiento lumbar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Configuración de la estimulación de la médula espinal (SCS) e imágenes de la neurona motora. (A) El generador de pulsos con electrodos hechos a medida puede ajustar por separado la amplitud, el ancho de pulso y la frecuencia. La entrada mostró que la especificación dimensional de un contacto de electrodo es de 800 μm x 500 μm x 300 μm. (B) Coloque el ánodo y el cátodo cerca de la línea media dorsal y la zona de entrada de la raíz dorsal (DREZ) a través del sistema de micromanipulación, respectivamente. Coloque la pipeta de registro en la región dorsolateral de la columna motora para sujetar las neuronas motoras positivas de oro fluorado (FG+). (C) Una neurona motora sana de disparo inmediato con imágenes de microscopio de contraste de interferencia diferencial infrarroja (IR-DIC) (60x). (D) La misma neurona con solo imágenes de fluorescencia (60x), partículas brillantes de Fluoro-Oro (FG) representan que esta neurona es una neurona motora. (E) Imagen combinada de IR-DIC y fluorescencia en neurona motora FG+. (F-H) Una neurona motora sana de disparo retardado con imágenes IR-DIC (60x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Distinga las neuronas motoras de disparo retardado e inmediato utilizando una inyección de corriente despolarizante de 5 s. (A) Neuronas motoras de disparo inmediato: la reobase baja puede inducir un disparo inmediato y repetitivo con una frecuencia de disparo estable; (B) Neuronas motoras de disparo retardado: La reobase alta puede inducir un inicio tardío de disparo repetitivo con una velocidad de disparo acelerada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La estimulación de la médula espinal (SCS) provocó la activación de potenciales de acción (AP) en las neuronas motoras . (A) Cuando no se aplicó estimulación, el potencial de membrana en reposo (RMP) fue de -65 mV. (B) El estímulo de umbral motor de 1/3x no puede provocar AP. (C) El estímulo de umbral motor 2/3x no puede provocar AP. (D) 1x estímulo de umbral motor puede provocar AP, y cada 10-20 pulsos puede provocar un AP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Activación de potenciales de acción espontánea (PA) después de la estimulación de la médula espinal (SCS). Después de que se apagó el SCS, la neurona disparó una serie de AP espontáneos durante un corto período de tiempo (30-40 s), luego el potencial de membrana en reposo (RMP) volvió a -65 mV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Ilustración del parámetro de estimulación de la médula espinal (SCS) y de la corriente postsináptica excitatoria evocada (EPSC). (A) Ilustración del parámetro SCS; (B,C) Después de un solo pulso de estimulación (1x estimulación del umbral motor), se puede observar el EPSC evocado; (D) Después de restar el equilibrio de carga pasiva, se puede calcular la latencia y la amplitud del EPSC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Preparación del instrumento. (A) Bandeja de perfusión: 10 min antes de la perfusión, colocar hielo picado sobre la placa de Petri de 10 cm llena de gel de sílice. (B) Bandeja anatómica: en la noche anterior al sacrificio, coloque la bandeja anatómica de fabricación propia llena de gel de sílice en el refrigerador a -80 ° C. (C) Bandeja de corte: en la noche anterior al sacrificio, coloque la bandeja de corte con banda de agua en el refrigerador a -80 °C. (D) Pendiente de fundición de agarosa: 30 min antes de la perfusión, colocar una pendiente de agarosa de 35° con placas base en el centro de una placa de Petri de 35 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Perfusión intracárdica. (A) Levantar la apófisis xifoides. (B) Cortar el esternón a lo largo de ambos lados de la apófisis xifoides para abrir el tórax y exponer el corazón. Tenga cuidado de no dañar los vasos torácicos internos, o una hemorragia masiva llenará todo el campo quirúrgico e impedirá que el operador identifique el ápice del ventrículo o la aurícula derecha. (C) Inserte una aguja de 22 G en el ápice del ventrículo izquierdo para la perfusión y corte la aurícula derecha para la salida de líquido. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Confirmación de la actividad radicular dorsal. Utilice electrodos de succión para aplicar 1 estimulación del umbral motor a la raíz dorsal. Si se detecta un potencial de acción evocado en las neuronas motoras, podemos confirmar que la actividad de la raíz dorsal está intacta. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Latencia y amplitud de las EPSC evocadas cuando el SCS estaba activado. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Demostración de la validez del EPSC evocado. (A) Después de una estimulación de umbral motor 1x después de restar el equilibrio de carga pasiva, se puede observar la EPSC evocada en una neurona motora viable; (B) Después de detener la perfusión durante 2 h en la misma célula, la polaridad de la estimulación se invirtió, la estimulación del umbral motor 1x no indujo ningún EPSC, lo que confirmó que el EPSC evocado no era un artefacto. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Ficha complementaria 1: Métodos de cálculo de las propiedades activas y pasivas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Propiedades pasivas de las neuronas motoras. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 2: Propiedades activas de las neuronas motoras Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La información de movimiento modulada por el SCS finalmente converge a las neuronas motoras. Por lo tanto, tomar las neuronas motoras como objetivo de investigación puede simplificar el diseño del estudio y revelar el mecanismo de neuromodulación del SCS de manera más directa. Para registrar simultáneamente diversas características de estímulos y respuestas celulares, un patch-clamp es un buen método para estudiar las características electrofisiológicas a escala de una sola célula. Sin embargo, todavía existen algunas dificultades, incluida la forma de mantener la viabilidad celular, cómo separar rápidamente la médula espinal de la estructura ósea y cómo usar el SCS para inducir PA con éxito. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo ayudar a los investigadores a comprender rápidamente las habilidades operativas esenciales, evitar algunos posibles escollos y centrarse en el diseño del estudio en lugar de la metodología lo antes posible.

Para obtener una buena viabilidad celular, siempre se debe prestar atención a los siguientes detalles: (1) Mantener la médula espinal a una temperatura helada es muy importante porque la baja temperatura puede inhibir la muerte celular y ralentizar la tasa metabólica, lo que puede proteger a la neurona del daño mecánico durante la perfusión, la disección y el corte13; (2) La extracción delicada de la duramadre con una microtijera puede mejorar la absorción de nutrientes neuronales de las soluciones circundantes. Nunca despegue directamente la duramadre; de lo contrario, la médula espinal se dañará gravemente. Además, si se olvida de limpiar la duramadre, el proceso de corte posterior puede ser difícil porque es posible que la cuchilla no corte completamente la duramadre y luego arranque la médula espinal restante de la agarosa, lo que puede provocar el fracaso del corte. (3) En comparación con el corte transversal convencional, los cortes oblicuos aumentan el área de materia gris, y puede encontrar más neuronas motoras FG + en un solo corte9. (4) Debido a que la médula espinal por sí sola no se puede fijar firmemente en el disco de muestra como el cerebro, incrustarlo en gel de agarosa es eficaz para resolver este problema sin disminuir la viabilidad celular. Recomendamos utilizar agarosa de bajo punto de fusión (punto de gel 26-30 °C) en lugar de agarosa convencional (punto de gel 38-43 °C), ya que la alta temperatura puede dañar la viabilidad celular. (5) Recomendamos que la distancia entre dos hilos de nailon de alambre de platino en forma de U sea de 1 a 1,5 mm porque los hilos sueltos no pueden inmovilizar firmemente la médula espinal y los hilos densos pueden aplastar la célula.

En comparación con los dispositivos de estimulación convencionales, como los electrodos de gancho bipolar ampliamente utilizados en la investigación básica, el electrodo SCS en este estudio se deriva de nuestro trabajo clínico previo14 y de la investigación básica15. SCS suministra estimulación eléctrica alterna pulsada, que proporciona diversas dimensiones de ajuste de parámetros. Este dispositivo SCS también tiene una función de equilibrio de carga para evitar la electrólisis tisular y no entra en contacto directo con el tejido neural; por lo tanto, este SCS tiene una buena seguridad para aplicaciones in vivo .

Después del tratamiento con SCS, los PA espontáneos de las neuronas motoras pueden atribuirse a las siguientes razones: (1) El SCS induce que la carga se acumule en el cuerpo celular y el colículo axonal de las neuronas, lo que conduce al aumento de RMP16. Este fenómeno indica que el SCS puede mejorar la excitabilidad de la neurona, lo que puede estar relacionado con el cambio de conductividad de los canales iónicos después del SCS, como Na v 1.117, K v 2.1 18 o Ca v 2.319. (2) El SCS puede activar las neuronas GABAérgicas dorsales para facilitar la retroalimentación propioceptiva a las neuronas motoras. Sugerimos que la transmisión neuronal puede existir continuamente entre las neuronas sensoriales y las neuronas motoras, lo que conduce a PA espontáneos en las neuronas motoras después del SCS. Los PA espontáneos pueden mantener un estado intrínseco de preparación para ejecutar conductas sensoriomotoras20. Por lo tanto, la activación o inhibición de los PA espontáneos puede ser beneficiosa para el tratamiento de las enfermedades neurológicas de la columna vertebral.

Como sabemos, el registro electrofisiológico in vivo es mejor para detectar la respuesta electrofisiológica bajo la distribución natural del campo eléctrico y la colocación de electrodos. Además, los registros in vivo de motoneuronas permiten la identificación de la identidad de motoneuronas. Esto se puede hacer a través de la identificación antidrómica de los axones motores junto con la medición de la fuerza de las fibras musculares21. Pero los registros de la médula espinal in vivo también tienen los siguientes inconvenientes: (1) La neurona motora se encuentra a 2-3 mm de distancia de la superficie dorsal de la médula espinal, incluso utilizando las imágenes confocales de dos fotones más avanzadas, la profundidad de observación es de solo 500-800 μm, por lo que es difícil observarlas ópticamente in vivo utilizando los métodos existentes. Por lo tanto, si queremos sujetar exactamente una sola neurona motora in vivo, la pipeta de vidrio debe pasar a través de la columna dorsal para llegar a la neurona motora invisible; El patch-clamp in vivo solo se puede realizar de manera "ciega", lo que resulta en una incertidumbre significativa y una tasa de fallas. (2) A excepción de la abrazadera de parche in vivo, los registros de electrodos de silicio pueden ser el método alternativo, como la matriz Utah o el electrodo Neuropixels. Sin embargo, las señales registradas por los electrodos de silicio son en su mayoría de potencial de acción compuesto en lugar de potencial de acción simple. Aunque la actividad de las neuronas individuales se ha resuelto utilizando algoritmos de clasificación de picos, aún es necesario mejorar la precisión y la fiabilidad de los algoritmos de clasificación.

En comparación con los registros in vivo, el mayor beneficio de los registros in vitro frente a los in vivo es el uso de pinzas de voltaje, que permite una comprensión única de las vías sinápticas activadas por SCS. Además, también permitiría el uso de herramientas de imágenes en vivo. Especulamos que el SCS induce la liberación de neurotransmisores como el GABA y el glutamato de las neuronas de nivel superior a las neuronas motoras, lo que da lugar a una respuesta excitatoria general de EPSC7. Por lo tanto, en nuestra próxima investigación, incorporaremos la detección de IPSC, mini EPSC (mEPSC) y EPSC evocada inducida por SCS para aclarar los patrones de liberación de neurotransmisores inhibidores y excitatorios de las neuronas premotoras o interneuronas. Reconocimos plenamente que la estimulación in vitro también tiene algunas limitaciones: (1) se interrumpe el circuito longitudinal de largo alcance de la médula espinal, lo que resulta en la pérdida de información entrante de la corteza motora o de la extremidad inferior; (2) La distribución de los campos eléctricos durante la estimulación in vitro puede diferir de la de la estimulación in vivo. En este estudio, el umbral de activación (aproximadamente en miliamperios) para los PA fue mucho más alto que el del experimento in vivo (aproximadamente en microamperios)15; esto se debió a que la capacidad volumétrica de la solución ACSF en la cámara de registro era mucho mayor que la del líquido cefalorraquídeo en estado natural, y la teoría matemática sostiene que el campo eléctrico se atenúa más rápido en materiales de alta conductividad22. Por lo tanto, la mayor parte de la corriente fue absorbida por la solución de baño, y especulamos que solo una pequeña porción del campo eléctrico puede difundirse a las raíces nerviosas.

Por lo tanto, considerando las ventajas y desventajas de la estimulación in vivo y la estimulación in vitro , se puede concluir que el patch-clamp in vitro es un método ventajoso para estudiar la naturaleza sináptica y/o los efectos celulares del SCS en roedores neonatos.

En la práctica clínica, el electrodo no contrae directamente la superficie de la médula espinal ni la raíz nerviosa23. En cambio, se basa en la radiación del campo eléctrico generado por el electrodo para afectar indirectamente la actividad de los nervios. Múltiples estudios 1,23,24 han confirmado que el contacto catódico del SCS debe colocarse lo más cerca posible de la raíz dorsal o de la zona de entrada (DREZ) para lograr una selectividad óptima para estimular un músculo específico. Aumentar la distancia entre el electrodo y la raíz nerviosa debilitará la especificidad de la estimulación. Por lo tanto, colocamos directamente el cátodo cerca del DREZ en lugar de entrar en contacto directo con la raíz nerviosa o la médula espinal.

Las fibras aferentes de la raíz dorsal se proyectan primero a las neuronas sensoriales, luego a las interneuronas y a las neuronas motoras. Además de los circuitos de proyección transversal, también hay circuitos que se proyectan hacia el extremo rostral y caudal. Por ejemplo, las neuronas motoras correspondientes al músculo tibial anterior se pueden encontrar en múltiples niveles25. Por lo tanto, aunque la preparación oblicua puede cortar los circuitos de proyección transversal, aún conservará las fibras de proyección no transversales, lo que permitirá el estudio de los circuitos sensoriales premotores. Además de la preparación oblicua y transversal, la preparación longitudinal ofrece claras ventajas para preservar mejor los circuitos desde la raíz dorsal hasta las neuronas motoras y permitir la retención efectiva de los circuitos de la médula espinal a través de múltiples segmentos26, lo que proporciona una representación más cercana de las condiciones fisiológicas reales.

De acuerdo con la investigación de simulación 6,27,28, el SCS activa principalmente las fibras aferentes propioceptivas para restaurar el movimiento de las extremidades inferiores, incluidas las fibras aferentes Ia, Ib y II. Sin embargo, en este estudio, no podemos confirmar con certeza qué tipos de fibra fueron activados específicamente por el SCS. Especulamos que un patrón similar también puede existir en la pinza de parche in vitro. Abordaremos este problema mediante la realización de modelos matemáticos y simulaciones y su incorporación a nuestro trabajo en curso.

En conclusión, este protocolo puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades operativas y comprender los aspectos esenciales de la combinación de registros de patch-clamp y SCS para investigar el mecanismo eléctrico del SCS a escala de una sola célula.

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Disclosures

Ninguno

Acknowledgments

Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China para Jóvenes Académicos (52207254 y 82301657) y el Fondo de Ciencias Postdoctorales de China (2022M711833).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Ascorbic Acid Sigma A4034
CaCl2·2H2O Sigma C5080
Choline Chloride Sigma C7527
Cover slide tweezers VETUS 36A-SA Clip a slice
D-Glucose Sigma G8270
EGTA Sigma E4378
Fine scissors RWD Life Science S12006-10 Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source Olympus  U-HGLGPS
Fluoro-Gold Fluorochrome Fluorochrome Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877
HEPES Sigma H3375
infrared CCD camera Dage-MTI IR-1000E
KCl Sigma P5405
K-gluconate Sigma P1847
Low melting point agarose Sigma A9414
MgSO4·7H2O Sigma M2773
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-200
Micropipette puller Sutter instrument P1000
Micro-scissors  Jinzhong wa1020 Laminectomy
Microscope for anatomy Olympus  SZX10
Microscope for ecletrophysiology Olympus  BX51WI
Micro-toothed tweezers RWD Life Science F11008-09 Lift the cut vertebral body
NaCl Sigma S5886
NaH2PO4 Sigma S8282
NaHCO3 Sigma V900182
Na-Phosphocreatine Sigma P7936
Objective lens for ecletrophysiology Olympus  LUMPLFLN60XW working distance 2 mm 
Osmometer  Advanced  FISKE 210
Patch-clamp amplifier  Axon  Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer Axon  Digidata 1550B
pH meter  Mettler Toledo  FE28
Slice Anchor Multichannel system SHD-27H
Spinal cord stimulatior PINS T901
Toothed tweezer RWD Life Science F13030-10 Lift the xiphoid
Vibratome Leica VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter Olympus  U-MF2

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References

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Ex Vivo Preparación Corte de la Médula Espinal Registro de Pinza de Parche de Célula Entera Neuronas Motoras Estimulación de la Médula Espinal Función Locomotora Lesión de la Médula Espinal Respuestas Eléctricas Comportamientos Sensoriomotores Características del Estímulo Respuestas Celulares Método de Patch-Clamp Características Electrofisiológicas Viabilidad Celular Separación de la Médula Espinal Estructura Ósea Potenciales de Acción Protocolo Resolución Espacio-Temporal Mecanismo Eléctrico
La preparación <em>ex vivo</em> del corte de la médula espinal para el registro de patch-clamp de células enteras en neuronas motoras durante la estimulación de la médula espinal
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Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L.… More

Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L. The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation. J. Vis. Exp. (199), e65385, doi:10.3791/65385 (2023).

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