Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة تستخدم مشبك رقعة لدراسة الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية لتحفيز الحبل الشوكي (SCS) بدقة زمانية مكانية عالية ، والتي يمكن أن تساعد الباحثين على تحسين مهاراتهم في فصل الحبل الشوكي والحفاظ على صلاحية الخلية في وقت واحد.
Abstract
يمكن لتحفيز الحبل الشوكي (SCS) استعادة الوظيفة الحركية بشكل فعال بعد إصابة الحبل الشوكي (SCI). نظرا لأن الخلايا العصبية الحركية هي الوحدة الأخيرة لتنفيذ السلوكيات الحسية الحركية ، فإن الدراسة المباشرة للاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية مع SCS يمكن أن تساعدنا في فهم المنطق الأساسي لتعديل الحركة الشوكية. لتسجيل خصائص التحفيز المتنوعة والاستجابات الخلوية في وقت واحد ، يعد مشبك التصحيح طريقة جيدة لدراسة الخصائص الفيزيولوجية الكهربية على نطاق خلية واحدة. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض الصعوبات المعقدة في تحقيق هذا الهدف ، بما في ذلك الحفاظ على صلاحية الخلية ، وفصل الحبل الشوكي بسرعة عن البنية العظمية ، واستخدام SCS لتحفيز جهود الفعل بنجاح. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا باستخدام patch-clamp لدراسة الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية ل SCS بدقة زمانية مكانية عالية ، والتي يمكن أن تساعد الباحثين على تحسين مهاراتهم في فصل الحبل الشوكي والحفاظ على صلاحية الخلية في نفس الوقت لدراسة الآلية الكهربائية ل SCS بسلاسة على الخلايا العصبية الحركية وتجنب التجربة والخطأ غير الضروريين.
Introduction
يمكن لتحفيز الحبل الشوكي (SCS) استعادة الوظيفة الحركية بشكل فعال بعد إصابة الحبل الشوكي (SCI). أفاد Andreas Rowald et al. أن SCS تمكن الطرف السفلي من وظيفة المحرك والجذع في غضون يوم واحد1. يعد استكشاف الآلية البيولوجية ل SCS للتعافي الحركي مجالا بحثيا مهما وشائعا لتطوير استراتيجية SCS أكثر دقة. على سبيل المثال ، أظهر فريق Grégoire Courtine أن الخلايا العصبية البينية Vsx2 المثيرة والخلايا العصبية Hoxa10 في الحبل الشوكي هي الخلايا العصبية الرئيسية للاستجابة ل SCS ، والتعديل العصبي الخاص بالخلية ممكن لاستعادة قدرة الفئران على المشي بعد SCI2. ومع ذلك ، تركز دراسات قليلة على الآلية الكهربائية ل SCS على نطاق خلية واحدة. على الرغم من أنه من المعروف أن محفز التيار المباشر فوق العتبة يمكن أن يثير جهود الفعل (APs) في تجربة الحبار الكلاسيكية3،4،5 ، إلا أن كيفية تأثير التحفيز الكهربائي المتناوب النبضي ، مثل SCS ، على توليد إشارة المحرك لا يزال غير واضح.
نظرا لتعقيد الدوائر العصبية داخل العمود الفقري ، فإن الاختيار المناسب لسكان الخلايا مهم للتحقيق في الآلية الكهربائية ل SCS. على الرغم من أن SCS يستعيد الوظيفة الحركية عن طريق تنشيط مسار الحس العميق6 ، فإن الخلايا العصبية الحركية هي الوحدة النهائية لتنفيذ الأمر الحركي ، المستمدة من دمج معلومات استقبال الحس العميق7. لذلك ، يمكن أن تساعدنا الدراسة المباشرة للخصائص الكهربائية للخلايا العصبية الحركية مع SCS في فهم المنطق الأساسي لتعديل المحرك الشوكي.
كما نعلم ، فإن مشبك التصحيح هو الطريقة القياسية الذهبية للتسجيل الكهربي الخلوي بدقة زمانية مكانية عالية للغاية8. لذلك ، تصف هذه الدراسة طريقة تستخدم مشبك رقعة لدراسة الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية ل SCS. بالمقارنة مع مشبك رقعة الدماغ9 ، فإن مشبك رقعة الحبل الشوكي أكثر صعوبة للأسباب التالية: (1) الحبل الشوكي محمي بواسطة القناة الفقرية ذات الحجم الصغير ، الأمر الذي يتطلب معالجة دقيقة للغاية وصيانة صارمة للجليد للحصول على صلاحية أفضل للخلايا. (2) نظرا لأن الحبل الشوكي نحيف جدا بحيث لا يمكن تثبيته على صينية القطع ، فيجب غمره في أغاروز منخفض نقطة الانصهار وتقليمه بعد التصلب.
ومن ثم ، توفر هذه الطريقة تفاصيل فنية في تشريح الحبل الشوكي والحفاظ على صلاحية الخلية في نفس الوقت وذلك لدراسة الآلية الكهربائية ل SCS بسلاسة على الخلايا العصبية الحركية وتجنب التجارب والأخطاء غير الضرورية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام على جميع التجارب على وأجريت الدراسات وفقا للوائح رعاية ذات الصلة.
1. إعداد
- معلومات السكن: إيواء ذكور فئران Sprague-Dawley (بعد الولادة 10-14 يوما ، P10-P14) في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض.
ملاحظة: تم الحفاظ على ظروف الغرفة عند 20 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية ، الرطوبة: 50٪ -60٪ ، مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة. كان للحيوانات حرية الوصول إلى الطعام والماء. - قم بتسمية الخلايا العصبية الحركية بأثر رجعي: حقن Fluoro-Gold (FG) في عضلة الظنبوب الأمامية الثنائية وعضلة الساق (2٪ في محلول ملحي معقم ، 50 ميكرولتر لكل عضلة) لتسمية الخلايا العصبية الحركية بأثر رجعي قبل يومين من التضحية.
- معلومات السكن: إيواء ذكور فئران Sprague-Dawley (بعد الولادة 10-14 يوما ، P10-P14) في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض.
- محاليل
- تحضير محلول القطع: مزيج 120 مليمول كلوريد الكولين, 2.6 ملليمتر كيل, 26 مليمتر NaHCO 3, 1.25 ملليمتر NaH 2 PO4, 0.5 ملليمتر كلوريد الكلور 2, 7 ملليمتر MgCl 2, 1.3 ملليمتر حمض الأسكوربيك, 15 ملليمتر الجلوكوز. قبل الفقاعة المحلول مع 95٪ O 2 و 5٪ CO2 (اضبط على درجة الحموضة 7.4 مع KOH) لمدة 30 دقيقة قبل التشريح والتقطيع. تبريد الحل مع الثلج المجروش.
- تحضير السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF): مزيج 126 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 3 مللي متر KCl ، 1.2 مللي متر NaH2PO4 ؛ 1.3 مللي مول MgCl 2 ، 2.4 mM CaCl2 ، 26 mM NaHCO3 ، و 10 mM الجلوكوز. قبل فقاعة الحل مع 95 ٪ O 2 و 5 ٪ CO2 لمدة 30 دقيقة قبل الحضانة.
- تحضير محلول داخل الخلايا: مزيج 126 مللي مول K-غلوكونات ، 2 مللي مول KCl ، 2 مللي مول MgCl 2 ، 0.2 مللي متر EGTA ، 10 mM HEPES ، 4 mMNa2 ATP ، 0.4 mM Na2 GTP ، 10 mM K-Phosphocreatine ، و 0.5٪ Neurobiotin (درجة الحموضة 7.25 و 305 mOsm / Kg). تبريد الحل مع الثلج المجروش.
- تحضير هلام الأغاروز منخفض الذوبان: قم بإذابة 4 جم من الأغاروز في 100 مل من محلول القطع ، واستخدم دوار تحريك مغناطيسي لإذابته بالكامل. في 30 دقيقة قبل التضمين ، سخني الأغاروز منخفض النقطة في فرن الميكروويف بقوة عالية لمدة 1 دقيقة ، ثم انقله إلى حمام مائي 39 درجة مئوية للحفاظ على الحالة السائلة.
- إعداد الصك
- ضع الثلج المجروش على صينية التروية (الشكل التكميلي 1 أ) قبل 10 دقائق من التروية. ضع الصينية التشريحية (الشكل التكميلي 1 ب) وصينية القطع (الشكل التكميلي 1 ج) مع شريط ماء عند -80 درجة مئوية طوال الليل مقدما.
- ضع حجرة الحضانة بشبكة من النايلون في الفرن على حرارة 45 درجة مئوية طوال الليل مقدما.
- استخدم أغاروز نقطة انصهار منخفضة لتصنيع منحدر 35 درجة ومنصة بسمك 2 مم (الشكل التكميلي 1D). بعد تصلب الجل ، ضعه في وسط طبق بتري 35 مم لدعم الحبل الشوكي في الإجراءات القادمة.
- التروية داخل القلب
- تخدير الفئران ب 2.5٪ ثلاثي برومو إيثانول (160 ميكرولتر / 10 جم) عن طريق الحقن داخل الصفاق. تأكد من تخدير الفئران بالكامل عن طريق التحقق من عدم الاستجابة للمحفزات الخارجية ، مثل قرصة لطيفة من إصبع القدم.
- عندما يتم تأكيد التخدير المناسب ، ضع الفئران مستلق وشل حركتها في طبق بتري المملوء بهلام السيليكا.
- قطع شق جلدي طولي 5 مم ذيليا لعملية الخنجري ، ثم قم بتوسيع المساحة تحت الجلد بالكامل. قم بقطع شق جلدي طولي بطول 2 سم على طول خط الوسط البطني لكشف جدار الصدر الخارجي بالكامل ، بدءا من الشق المذكور أعلاه وينتهي بالجزء العلوي من الصدر.
- استخدم ملاقط مسننة لرفع الخنجري (الشكل التكميلي 2 أ) ، ثم استخدم مقصا ناعما لقطع الحجاب الحاجز. قطع القص على طول جانبي عملية الخنجري لفتح الصدر وكشف القلب (الشكل التكميلي 2 ب).
ملاحظة: كن حذرا للحفاظ على الأوعية الصدرية الداخلية على كلا الجانبين. خلاف ذلك ، قد يسبب نزيف حاد. - استخدم ملاقط بلا أسنان لرفع البطين الأيسر. أدخل إبرة 22 G في قمة البطين الأيسر على طول المحور الطولي للبطين الأيسر (الشكل التكميلي 2C). في هذه الأثناء ، راقب نبض الدم الإيقاعي في أنبوب التروية ، أو قد تثقب الإبرة في البطين الأيمن ، مما قد يؤدي إلى تأثير نضح ضعيف.
ملاحظة: لا ينبغي أن تستخدم ملقط مسنن. وإلا فقد يتسبب ذلك في تسرب دم إضافي من موقع الملقط. - استخدم مقصا ناعما لقطع الأذين الأيمن (الشكل التكميلي 2C) ، ثم قم بحقن 100 مل يدويا من سائل الترشيح المثلج بمعدل حوالي 2 مل / ثانية في غضون دقيقة واحدة.
ملاحظة: عندما يتحول كبد الفئران ومخالبها إلى لون باهت ، ولا يتدفق الدم من الأذين الأيمن ، يمكن تحقيق نضح جيد.
- تشريح الحبل الشوكي (الشكل 1)
- ضع الجرذ في وضعية الانبطاح ، واقطع العمود الفقري عند العمود الفقري الحرقفي العلوي الأمامي (حوالي مستوى العمود الفقري L4) ونقطة تحول الانحناء للعمود الصدري (حوالي مستوى العمود الفقري T6) ، على التوالي (الشكل 1 أ). ثم ، ضع العمود الفقري المعزول على الفور في محلول الرش المثلج البارد المؤكسج لغسل الدم المتبقي والأنسجة الدهنية ؛ هذا الإجراء مفيد للحفاظ على نظافة مجال المنطوق في الإجراءات اللاحقة.
ملاحظة: يجب حجز العضلات المجاورة للعمود الفقري ، مما يساعد على التثبيت اللاحق للعمود الفقري باستخدام دبوس الحشرات. - انقل العمود الفقري المعزول على الفور إلى الدرج التشريحي (الشكل 1 ب) مع الجانب الظهري لأعلى ونهاية المنضدة بالقرب من المشغل. املأ الدرج التشريحي ب 50 مل من محلول القطع بالثلج البارد المؤكسج باستمرار (الشكل 1 ب).
- استخدم أربعة دبابيس حشرة لإصلاح العمود الفقري عن طريق اختراق عضلات العمود الفقري (الشكل 1 ب).
- تحت مجهر التشريح ، قم بقطع عنيق العمود الفقري لكلا الجانبين من نهاية المنضدة بالمقص الدقيق ، والذي يمكن تسميته "استئصال الصفيحة الفقرية" (الشكل 1C). انتبه لعدم إتلاف الحبل الشوكي. وفي الوقت نفسه ، استخدم الملقط ذو الأسنان الدقيقة لرفع الجسم الفقري المقطوع.
- بعد استئصال الصفيحة الفقرية ، لا تفصل الحبل الشوكي عن القناة الشوكية على الفور. بدلا من ذلك ، استخدم مقصا صغيرا لقطع الأم الجافية على طول خط الوسط الظهري ، مما يساعد على امتصاص العناصر الغذائية بين الخلايا و ACSF المؤكسج (الشكل 1 د).
ملاحظة: لا تمزق الأم الجافية أبدا. يسمح فقط بقطع الأم الجافية بواسطة مقص دقيق ؛ خلاف ذلك ، سوف يتضرر جذر العصب وحمة العمود الفقري بشكل خطير! - ارفع الجزء المنقاري من الحبل الشوكي ، ثم اقطع جذر العصب بعناية مع تخصيص حوالي 1 مم (الشكل 1E). بعد فصل الحبل الشوكي عن القناة الفقرية ، استخدم دبابيس حشرة لإصلاح الحبل الشوكي مع الجانب البطني لأعلى (الشكل 1F).
- استخدم مقصا صغيرا لقطع الأم الجافية على طول خط الوسط البطني (الشكل 1F). قطع جذور الأعصاب الزائدة عن الحاجة مع حوالي 1 مم محفوظة.
ملاحظة: العصب أكثر عنادا من الحبل الشوكي. إذا كان جذر العصب المحجوز طويلا جدا (>1 مم) ، فلن يتمكن الاهتزاز من قطع جذر العصب ، مما قد يؤدي إلى تمزق خطير في حمة العمود الفقري. - استخدم مقصا صغيرا لفصل التوسيع القطني بطول 6-7 مم (الشكل 1 ج).
- ضع الجرذ في وضعية الانبطاح ، واقطع العمود الفقري عند العمود الفقري الحرقفي العلوي الأمامي (حوالي مستوى العمود الفقري L4) ونقطة تحول الانحناء للعمود الصدري (حوالي مستوى العمود الفقري T6) ، على التوالي (الشكل 1 أ). ثم ، ضع العمود الفقري المعزول على الفور في محلول الرش المثلج البارد المؤكسج لغسل الدم المتبقي والأنسجة الدهنية ؛ هذا الإجراء مفيد للحفاظ على نظافة مجال المنطوق في الإجراءات اللاحقة.
- التضمين في الأغاروز منخفض الذوبان
- ضع التوسيع القطني على منحدر 35 درجة (الشكل 1H) مع الجانب الظهري لأعلى والنهاية الذيلية لأسفل. استخدم ورق ترشيح ماص لإزالة الماء الوفير على سطح الأنسجة (الشكل 1H).
- صب ببطء هلام الأغاروز المنصهر في طبق بتري الذي يحتوي على تضخم أسفل الظهر (الشكل 1I).
ملاحظة: لا تصب بسرعة كبيرة ، وإلا ستتراكم الفقاعات في الجل. - ضع طبق بتري أعلاه في خليط الماء المثلج لتبريد الجل في أسرع وقت ممكن ، مما يساعد على الحفاظ على نشاط الخلايا.
- قم بقص الجل إلى مكعب 15 مم × 10 مم × 10 مم وقم بتثبيته على قرص العينة باستخدام الغراء الفائق (الشكل 1J).
- تشريح
- ضع قرص العينة في صينية القطع المجمدة مسبقا ، ثم صب محلول القطع المثلج (الشكل 1K). فقاعة باستمرار مع 95٪ CO 2 و 5٪ O2 في صينية القطع.
- اضبط معلمات الاهتزاز: السماكة: 350 ميكرومتر ؛ السرعة: 0.14-0.16 مم / ثانية ، السعة: 1.0 مم ، وتردد الاهتزاز: 85 هرتز.
- حصاد 2-3 شرائح مناسبة لكل. سجل 1-2 خلية عصبية حركية FG + صحية لكل شريحة ، مع مجموعة من 5-6 خلايا لكل.
- حضانة المرض
- استخدم ملاقط انزلاق الغطاء لقص شريحة (الشكل 1 ل) ووضعها في غرفة الحضانة المملوءة ب ACSF المؤكسج باستمرار. ضع غرفة الحضانة في حمام مائي على حرارة 32 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم استمر في احتضانها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة أخرى قبل التسجيل.
ملاحظة: يجب إكمال الإجراءات المذكورة أعلاه ، من التخدير إلى الحصول على الشريحة الأولى ، في غضون 20-30 دقيقة للاحتفاظ بصلاحية الخلايا قدر الإمكان. يمكن للخلايا العصبية الحركية في كل شريحة الحفاظ على صلاحيتها لمدة 6-7 ساعات تقريبا.
- استخدم ملاقط انزلاق الغطاء لقص شريحة (الشكل 1 ل) ووضعها في غرفة الحضانة المملوءة ب ACSF المؤكسج باستمرار. ضع غرفة الحضانة في حمام مائي على حرارة 32 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم استمر في احتضانها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة أخرى قبل التسجيل.
2. تسجيل المشبك التصحيح مع SCS (الشكل 2)
- التحضيرات
- قم بتهوية غرفة التسجيل بفقاعات ACSF باستمرار بمعدل حوالي 1-2 مل / دقيقة. اضبط معدل التدفق بشكل فردي عبر لوحة التحكم في المضخة التمعجية.
- ضع شريحة في حجرة التسجيل. استخدم سلك البلاتين على شكل حرف U مع خيوط النايلون لتثبيت الشريحة بإحكام في مكانها.
- استخدم مجهر تباين التداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) لمراقبة الشريحة. تحت العدسة الموضوعية 4x ، تأكد من أن طول الجذر الظهري حوالي 1 مم. ابحث عن المنطقة التي يدخل فيها الجذر الظهري إلى الحمة ، ثم انقل مجال الرؤية المركزي إلى هذه المنطقة.
- قم بتوصيل مولد النبض بأقطاب كهربائية مخصصة (الشكل 2 أ).
- تكوين SCS
- ضع أنود SCS بالقرب من خط الوسط الظهري عبر نظام المعالجة الدقيقة (الشكل 2 ب).
- ضع كاثود SCS بالقرب من منطقة دخول الجذر الظهري (DREZ) عبر نظام المعالجة الدقيقة (الشكل 2B).
- استهداف الخلايا وتصويرها
- استخدم IR-DIC مع عدسة موضوعية 10x تقريبا ابحث عن المنطقة الظهرية الجانبية للعمود الحركي ، حيث توجد معظم الخلايا العصبية الحركية. ثم انقل مجال الرؤية المركزي إلى هذه المنطقة.
- قم بالتبديل إلى عدسة موضوعية 60x للعثور على خلية عصبية صحية ذات سطح أملس ومشرق ونوى غير مرئية (الشكل 2C ، F).
- قم بخفض شدة الأشعة تحت الحمراء قليلا وقم بتشغيل مصدر الضوء الفلوري. قم بتبديل مرشح الضوء إلى مرشح الإثارة فوق البنفسجية واسع النطاق (الشكل 2D ، G) ، لتحديد خلية عصبية حركية مناسبة موجبة ل FG (FG +) (الشكل 2E ، H).
- استخدم أقطاب الشفط لتطبيق تحفيز عتبة المحرك 1x على الجذر الظهري. إذا تم الكشف عن جهد فعل مستثار في الخلايا العصبية الحركية (الشكل التكميلي 3) ، فإنه يؤكد أن نشاط الجذر الظهري سليم. إذا لم يكن كذلك ، يجب التخلص من هذه الشريحة.
- تسجيل المشبك التصحيح
- املأ الماصة الدقيقة بالمحلول داخل الخلايا وأدخله في حامل القطب. استخدم نظام المعالجة الدقيقة لخفض الماصة في حمام ACSF. تتراوح مقاومة الماصة من 5-8 MΩ.
- ضع كمية صغيرة من الضغط الإيجابي على الماصة لإزالة الغبار وحطام الخلايا.
- اخفض القطب للاقتراب من الخلية. عندما تلامس الماصة سطح الخلايا العصبية FG + ، تصبح المسافة البادئة الصغيرة للغشاء مرئية على مستوى الطرف. حرر الضغط الإيجابي.
- ثم ، ضع كمية صغيرة من الضغط السلبي على الماصة باستخدام حقنة. هذا يخلق كمية صغيرة من الشفط الذي يسحب غشاء الخلية إلى اتصال مع ماصة الزجاج. انتبه دائما إلى المقاومة الكلية على واجهة البرنامج حتى تزداد قيمة المقاومة إلى جيجاأوم (>1 GΩ). ثم ، يتم تشكيل gigaseal.
- قم بتثبيت جهد الغشاء عند -70 مللي فولت ، ثم اضغط على زر تعويض السعة السريع على واجهة برنامج مكبر الصوت. قم بتطبيق ضغط سلبي عابر برفق لتمزق غشاء الخلية ، ثم اضغط على زر تعويض السعة البطيئة على واجهة برنامج مكبر الصوت. في هذه المرحلة ، يتم الحصول على تكوين جيد للخلية الكاملة.
- قم بالتبديل إلى وضع المشبك الحالي بالنقر فوق الزر IC على واجهة البرنامج ، وسجل إمكانات غشاء الراحة (RMP).
- قم بتطبيق SCS لمدة 1-2 ثانية بسعة 1-10 مللي أمبير ، بينما يتم تثبيت عرض النبضة وترددها عند 210 ميكروثانية و 40 هرتز على التوالي. حدد عتبة المحرك عن طريق زيادة سعة التحفيز ببطء حتى يتم ملاحظة نقطة الوصول الأولى.
- التمييز بين الخلايا العصبية الحركية المتأخرة والفورية باستخدام حقن تيار إزالة الاستقطاب لمدة 5 ثوان حول قاعدة ريوبيس في وضع المشبك الحالي10،11،12. الخلايا العصبية الحركية ذات الإطلاق الفوري: يمكن أن تؤدي القاعدة المنخفضة إلى إطلاق فوري ومتكرر بتردد إطلاق مستقر ؛ تأخر إطلاق الخلايا العصبية الحركية: يمكن أن تؤدي قاعدة الريو العالية إلى تأخر ظهور إطلاق النار المتكرر بمعدل إطلاق متسارع (الشكل 3).
- عند إيقاف تشغيل SCS ، استمر في تسجيل إمكانات الغشاء لالتقاط إطلاق APs التلقائي.
- قم بإجراء تسجيلات مشبك الجهد لتسجيلات مشبك الجهد للتيار المشبكي المثير (EPSC) عند تشغيل SCS وإيقاف تشغيله. معلمة التحفيز هي عتبة محرك 1x ، 210 μs ، 2 هرتز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بفضل الصيانة الصارمة لدرجات الحرارة المنخفضة أثناء التشغيل الجيد (الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2 والشكل 1) ، كانت صلاحية الخلية جيدة بما يكفي لإجراء التسجيلات الكهربية اللاحقة. لمحاكاة السيناريو السريري قدر الإمكان ، استخدمنا المعالجة الدقيقة لوضع كاثود SCS والأنود بالقرب من خط الوسط الظهري و DREZ ، على التوالي (الشكل 2) ، والذي يمكن أن يبدأ إشارة عصبية في القرن الظهري للانتشار إلى الخلايا العصبية الحركية في المنطقة الظهرية الجانبية للعمود الحركي. في هذه الدراسة ، استخدمنا FG لتحديد موقع الخلايا العصبية الحركية التي يبلغ قطرها 20-50 ميكرومتر. كما هو موضح في الشكل 2D ، G ، أكدنا بثقة وجود خلية عصبية FG + صحية كخلية عصبية حركية - طرف الدائرة الشوكية. مهدت طريقة وضع العلامات هذه الطريق لدراسة كيفية تأثير SCS على نمط إطلاق النار. يتم سرد الخصائص الكهربية للخلايا العصبية الحركية المتأخرة والفورية في الجدول التكميلي 1 والجدول التكميلي 2. يتم توفير طرق حساب الخصائص النشطة والسلبية في الملف التكميلي 1.
عندما سلم SCS مجالا كهربائيا متناوبا نابضا إلى شريحة العمود الفقري ، استخدمنا أولا وضع المشبك الحالي لتسجيل استجابة جهد الغشاء (الشكل 4). نظرا لأننا قمنا بزيادة سعة التحفيز تدريجيا بخطوة 1/3 عتبة المحرك (الشكل 4B ، C) ، ارتفعت إمكانات الغشاء أيضا معها ، ولكن عتبة المحرك 1x فقط يمكن أن تثير Aps (الشكل 4D). يوضح الشكل 4D أن كل 10-20 نبضة تقريبا يمكن أن تثير AP ، مما يشير إلى أنه قد يكون هناك انتظام محدد لاستجابة AP لسعة SCS.
بعد إيقاف تشغيل SCS ، واصلنا تسجيل إمكانات الغشاء. يوضح الشكل 5 أن جهد الغشاء زاد قليلا إلى -60 mV ، وأطلقت الخلية العصبية سلسلة من APs التلقائية. تستمر نقاط الوصول التلقائية هذه لفترة قصيرة من الزمن (30-40 ثانية) ، ثم عادت إمكانات الغشاء إلى -65 مللي فولت ، مما يشير إلى أن SCS يمكن أن يزيد مؤقتا من استثارة الخلية.
بعد ذلك ، استخدمنا تسجيلات مشبك الجهد ل EPSC عندما كان SCS قيد التشغيل والإيقاف (الشكل 6). بعد كل نبضة SCS ، يمكن اكتشاف EPSC مستثار. كان الكمون بين قطعة التحفيز و EPSC 2.64 ± 0.38 مللي ثانية (الشكل التكميلي 4). وكانت سعة EPSCs المستثارة 35.14 ± 12.73 pA (الشكل التكميلي 4). ويتسق تواتر EPSCs المستثارة مع تردد SCS. بعد طرح موازنة الشحنة السلبية ، يمكن ملاحظة EPSC المستثار في خلية عصبية حركية قابلة للحياة بعد تحفيز عتبة المحرك 1x (الشكل التكميلي 5A). تم عكس قطبية التحفيز بعد إيقاف التروية لمدة 2 ساعة في نفس الخلية. لم يحث التحفيز على أي EPSC ، مما يؤكد أن EPSC المستثار لم يكن قطعة أثرية (الشكل التكميلي 5B).
الشكل 1: تشريح الحبل الشوكي وتقطيعه . (أ) قطع العمود الفقري عند العمود الفقري الحرقفي العلوي الأمامي (حوالي مستوى العمود الفقري L4) ونقطة إزاحة انحناء العمود الصدري (حوالي مستوى العمود الفقري T6) ، على التوالي. (ب) انقل العمود الفقري المعزول على الفور إلى الدرج التشريحي بحيث يكون الجانب الظهري لأعلى ونهاية المنضدة قريبة من المشغل. املأ الدرج التشريحي بمحلول القطع بالثلج البارد المؤكسج باستمرار. ج: إجراء استئصال الصفيحة الفقرية على كلا الجانبين من طرف المنضدة. د: قطع الأم الظهرية الجافية، وهو ما يساعد على امتصاص المغذيات بين الخلايا والسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي المؤكسج (ACSF). ه: قطع جذر العصب بعناية. (و) قطع الأم الجافية البطنية. (ز) افصل التوسيع القطني بطول 6-7 مم. (H) ضع التوسيع القطني على منحدر 35 درجة مع الجانب الظهري لأعلى والنهاية الذيلية لأسفل. استخدم ورق ترشيح ماص لإزالة الماء الوفير على سطح الأنسجة. (ط) صب جل الأغاروز المنصهر ببطء في طبق بتري. (ي) قم بقص الجل إلى مكعب وتثبيته على قرص العينة باستخدام غراء فائق. (ك) ضع قرص العينة في صينية التقطيع ، ثم صب محلول القطع المثلج. (ل) مثال على شريحة العمود الفقري في تضخم أسفل الظهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تكوين تحفيز الحبل الشوكي (SCS) وتصوير الخلايا العصبية الحركية. (أ) يمكن لمولد النبضات المزود بأقطاب كهربائية مخصصة ضبط السعة وعرض النبضة والتردد بشكل منفصل. أظهر المدخل أن مواصفات الأبعاد لملامسة القطب هي 800 ميكرومتر × 500 ميكرومتر × 300 ميكرومتر. (ب) ضع الأنود والكاثود بالقرب من خط الوسط الظهري ومنطقة دخول الجذر الظهري (DREZ) عبر نظام المعالجة الدقيقة ، على التوالي. ضع ماصة التسجيل في المنطقة الظهرية الجانبية للعمود الحركي لتثبيت الخلايا العصبية الحركية الموجبة للفلورو الذهبي (FG +). (ج) خلية عصبية حركية صحية فورية الإطلاق مزودة بتصوير مجهر تباين التداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) (60x). (د) تمثل الخلية العصبية نفسها المزودة بالتصوير الفلوري فقط (60x)، وهي جسيمات الفلورو-الذهبي الساطعة (FG) أن هذه الخلية العصبية خلية عصبية حركية. (ه) صورة مدمجة ل IR-DIC والتألق في الخلايا العصبية الحركية FG +. (ف-ح) خلية عصبية حركية صحية متأخرة الإطلاق مع التصوير بالأشعة تحت الحمراء (60x). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التمييز بين الخلايا العصبية الحركية المتأخرة والفورية باستخدام حقن تيار إزالة الاستقطاب لمدة 5 ثوان. (أ) الخلايا العصبية الحركية ذات الإطلاق الفوري: يمكن أن تؤدي القاعدة المنخفضة إلى إطلاق فوري ومتكرر بتردد إطلاق مستقر ؛ (ب) تأخر إطلاق الخلايا العصبية الحركية: يمكن أن تؤدي القاعدة المتغيرة العالية إلى تأخر ظهور الحرق المتكرر بمعدل إطلاق متسارع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحفيز الحبل الشوكي (SCS) مستحث جهود الفعالية (APs) التي تطلق في الخلايا العصبية الحركية. (أ) عندما لم يطبق أي تحفيز، كان جهد غشاء الراحة (RMP) -65 mV. (ب) لا يمكن لمحفز عتبة المحرك 1/3x أن يثير نقاط الوصول. (ج) لا يمكن لمحفز عتبة المحرك 2/3x أن يثير نقاط الوصول. (د) يمكن أن يثير حافز عتبة المحرك 1x نقاط وصول ، وكل 10-20 نبضة يمكن أن تثير AP. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: إطلاق جهود الفعالية التلقائية (APs) بعد تحفيز الحبل الشوكي (SCS). بعد إيقاف تشغيل SCS ، أطلقت الخلايا العصبية سلسلة من نقاط الوصول التلقائية لفترة قصيرة من الزمن (30-40 ثانية) ، ثم عادت إمكانات غشاء الراحة (RMP) إلى -65 مللي فولت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: رسم توضيحي لمعلمة تحفيز الحبل الشوكي (SCS) والتيار الاستثاري بعد المشبكي (EPSC). (أ) توضيح معلمة SCS؛ (ب، ج) بعد نبضة تحفيز واحدة (تحفيز عتبة المحرك 1x) ، يمكن ملاحظة EPSC المستثار ؛ (د) بعد طرح موازنة الشحنة السلبية ، يمكن حساب زمن انتقال وسعة EPSC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: إعداد الأداة. (أ) صينية التروية: قبل التروية ب 10 دقائق ، ضع الثلج المجروش على طبق بتري 10 سم مملوء بهلام السيليكا. (ب) صينية تشريحية: في الليلة التي تسبق التضحية ، ضع الصينية التشريحية ذاتية الصنع المملوءة بهلام السيليكا في الثلاجة -80 درجة مئوية. (ج) صينية القطع: في الليلة التي تسبق التضحية ، ضع صينية التقطيع مع شريط الماء في الثلاجة -80 درجة مئوية. (د) منحدر صب الأغاروز: قبل 30 دقيقة من التروية ، ضع منحدر أغاروز 35 درجة مع ألواح قاعدة في وسط طبق بتري 35 مم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: التروية داخل القلب. أ: رفع عملية الخنجري. ب: قطع القص على جانبي العملية الخنجرية لفتح الصدر وكشف القلب. احرص على عدم إتلاف الأوعية الصدرية الداخلية ، وإلا فإن النزيف الحاد سيملأ مجال التشغيل بأكمله ويعيق المشغل من تحديد قمة البطين أو الأذين الأيمن. (ج) أدخل إبرة 22 G في قمة البطين الأيسر للتروية واقطع الأذين الأيمن لإخراج السوائل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: تأكيد نشاط الجذر الظهري. استخدم أقطاب الشفط لتطبيق تحفيز عتبة المحرك 1x على الجذر الظهري. إذا تم اكتشاف جهد فعالية مستثار في الخلايا العصبية الحركية ، فيمكننا التأكد من أن نشاط الجذر الظهري سليم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 4: زمن انتقال وسعة EPSCs المستثارة عندما كان SCS قيد التشغيل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 5: إثبات صحة EPSC المستثار. (أ) بعد تحفيز عتبة المحرك 1x بعد طرح موازنة الشحنة السلبية ، يمكن ملاحظة EPSC المستثار في خلية عصبية حركية قابلة للحياة ؛ (ب) بعد إيقاف التروية لمدة 2 ساعة في نفس الخلية ، تم عكس قطبية التحفيز ، ولم يحفز تحفيز عتبة المحرك 1x أي EPSC ، مما أكد أن EPSC المستثار لم يكن قطعة أثرية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 1: طرق حساب الخصائص النشطة والسلبية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: الخصائص السلبية للخلايا العصبية الحركية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 2: الخصائص النشطة للخلايا العصبية الحركية الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتقارب معلومات الحركة المعدلة بواسطة SCS أخيرا مع الخلايا العصبية الحركية. لذلك ، فإن أخذ الخلايا العصبية الحركية كهدف للبحث قد يبسط تصميم الدراسة ويكشف عن آلية التعديل العصبي ل SCS بشكل مباشر أكثر. لتسجيل خصائص التحفيز المتنوعة والاستجابات الخلوية في وقت واحد ، يعد مشبك التصحيح طريقة جيدة لدراسة الخصائص الفيزيولوجية الكهربية على نطاق خلية واحدة. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض الصعوبات ، بما في ذلك كيفية الحفاظ على صلاحية الخلية ، وكيفية فصل الحبل الشوكي بسرعة عن البنية العظمية ، وكيفية استخدام SCS للحث على APs بنجاح. لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى مساعدة الباحثين على فهم المهارات التشغيلية الأساسية بسرعة ، وتجنب بعض المزالق المحتملة ، والتركيز على تصميم الدراسة بدلا من المنهجية في أقرب وقت ممكن.
للحصول على صلاحية جيدة للخلية ، يجب على المرء دائما الانتباه إلى التفاصيل التالية: (1) يعد الحفاظ على الحبل الشوكي في درجة حرارة باردة أمرا مهما للغاية لأن درجة الحرارة المنخفضة يمكن أن تمنع موت الخلايا وتبطئ معدل الأيض ، والذي يمكن أن يحمي الخلايا العصبية من التلف الميكانيكي أثناء التروية والتشريح والتقطيع13 ؛ (2) يمكن أن تؤدي إزالة الأم الجافية بدقة بواسطة مقص دقيق إلى تعزيز امتصاص المغذيات العصبية من المحاليل المحيطة. لا تقشر الأم الجافية مباشرة ؛ خلاف ذلك ، سوف يتضرر الحبل الشوكي بشكل خطير. بالإضافة إلى ذلك ، إذا نسيت مسح الأم الجافية ، فقد تكون عملية التقطيع اللاحقة صعبة لأن الشفرة قد لا تقطع الأم الجافية تماما ثم تمزق الحبل الشوكي المتبقي من الأغاروز ، مما قد يؤدي إلى فشل التقطيع. (3) بالمقارنة مع الشريحة المستعرضة التقليدية ، تزيد الشرائح المائلة من مساحة المادة الرمادية ، ويمكنك العثور على المزيد من الخلايا العصبية الحركية FG + في شريحة واحدة9. (4) نظرا لأن الحبل الشوكي وحده لا يمكن تثبيته بإحكام على قرص العينة مثل الدماغ ، فإن تضمينه في هلام الأغاروز فعال في حل هذه المشكلة دون تقليل صلاحية الخلية. نوصي باستخدام الأغاروز منخفض الذوبان (نقطة الهلام 26-30 درجة مئوية) بدلا من الأغاروز التقليدي (نقطة الهلام 38-43 درجة مئوية) ، لأن درجة الحرارة المرتفعة قد تلحق الضرر بصلاحية الخلية. (5) نوصي بأن تكون المسافة بين خيطين من النايلون من سلك البلاتين على شكل حرف U من 1 إلى 1.5 مم لأن الخيوط السائبة لا يمكنها شل حركة الحبل الشوكي بإحكام ، وقد تسحق الخيوط الكثيفة الخلية.
بالمقارنة مع أجهزة التحفيز التقليدية ، مثل أقطاب الخطاف ثنائية القطب المستخدمة على نطاق واسع في الأبحاث الأساسية ، فإن قطب SCS في هذه الدراسة مشتق من عملنا السريري السابق14 والبحث الأساسي15. تقوم SCS بتوصيل التحفيز الكهربائي المتناوب النبضي ، والذي يوفر أبعادا متنوعة لضبط المعلمات. يحتوي جهاز SCS هذا أيضا على وظيفة توازن الشحن لتجنب التحليل الكهربائي للأنسجة ولا يتصل مباشرة بالأنسجة العصبية. لذلك ، يتمتع SCS بأمان جيد للتطبيقات في الجسم الحي .
بعد علاج SCS ، يمكن أن تعزى APs التلقائية للخلايا العصبية الحركية إلى الأسباب التالية: (1) يحفز SCS الشحنة على التراكم في جسم الخلية والقولون المحوري للخلايا العصبية ، مما يؤدي إلى زيادة RMP16. تشير هذه الظاهرة إلى أن SCS قد يحسن استثارة الخلايا العصبية ، والتي قد تكون مرتبطة بتغيير الموصلية للقنوات الأيونية بعد SCS ، مثل Na v 1.117 أو K v 2.1 18 أو Ca v 2.3 19. (2) قد يقوم SCS بتنشيط الخلايا العصبية الظهرية GABAergic لتسهيل ردود الفعل التحسسية للخلايا العصبية الحركية. نقترح أن الانتقال العصبي قد يكون موجودا باستمرار بين الخلايا العصبية الحسية والخلايا العصبية الحركية ، مما يؤدي إلى APs تلقائية في الخلايا العصبية الحركية بعد SCS. يمكن أن تحافظ نقاط الوصول التلقائية على حالة جوهرية من الاستعداد لتنفيذ السلوكيات الحسيةالحركية 20. لذلك ، قد يكون تنشيط أو تثبيط APs العفوية مفيدا لعلاج الأمراض العصبية في العمود الفقري.
كما نعلم ، فإن التسجيل الفيزيولوجي الكهربي في الجسم الحي أفضل للكشف عن الاستجابة الفيزيولوجية الكهربية تحت التوزيع الطبيعي للمجال الكهربائي ووضع الأقطاب الكهربائية. علاوة على ذلك ، تسمح تسجيلات الخلايا العصبية المتحركة في الجسم الحي بتحديد هوية الخلايا العصبية المتحركة. يمكن القيام بذلك من خلال التعرف المضاد للعضلات على المحاور الحركية إلى جانب قياس قوة الألياف العضلية21. ولكن في تسجيلات الحبل الشوكي في الجسم الحي لها أيضا العيوب التالية: (1) تقع الخلايا العصبية الحركية على بعد 2-3 مم من السطح الظهري للحبل الشوكي ، حتى باستخدام التصوير البؤري ثنائي الفوتون الأكثر تقدما ، فإن عمق المراقبة هو 500-800 ميكرومتر فقط ، لذلك من الصعب مراقبتها بصريا في الجسم الحي باستخدام الطرق الحالية. لذلك ، إذا أردنا تثبيت خلية عصبية حركية واحدة بالضبط في الجسم الحي ، فيجب أن تمر الماصة الزجاجية عبر العمود الظهري للوصول إلى الخلية العصبية الحركية غير المرئية. لا يمكن إجراء مشبك التصحيح في الجسم الحي إلا بطريقة "عمياء" ، مما يؤدي إلى عدم يقين كبير ومعدل فشل. (2) باستثناء مشبك التصحيح في الجسم الحي ، يمكن أن تكون تسجيلات قطب السيليكون هي الطريقة البديلة ، مثل مصفوفة يوتا أو قطب Neuropixels. ومع ذلك ، فإن الإشارات التي تسجلها أقطاب السيليكون هي في الغالب جهد فعل مركب بدلا من جهد فعل واحد. على الرغم من أن نشاط الخلايا العصبية المفردة قد تم حله باستخدام خوارزميات فرز السنبلة ، إلا أن دقة وموثوقية خوارزميات الفرز لا تزال بحاجة إلى تحسين.
بالمقارنة مع التسجيلات في الجسم الحي ، فإن أكبر فائدة في المختبر ضد في الجسم الحي هي استخدام مشبك الجهد ، والذي يسمح بفهم فريد للمسارات المشبكية التي يتم تنشيطها بواسطة SCS. بالإضافة إلى ذلك ، سيسمح أيضا باستخدام أدوات التصوير الحي. نحن نتوقع أن SCS يحفز إطلاق الناقلات العصبية مثل GABA والغلوتامات من الخلايا العصبية ذات المستوى العلوي إلى الخلايا العصبية الحركية ، مما يؤدي إلى استجابة EPSC مثيرة بشكل عام7. لذلك ، في بحثنا القادم ، سنقوم بدمج الكشف عن IPSC ، و EPSC المصغر (mEPSC) ، و EPSC المستحضر الناجم عن SCS لتوضيح أنماط إطلاق الناقل العصبي المثبط والمثير من الخلايا العصبية قبل الحركية أو الخلايا العصبية البينية. لقد اعترفنا تماما بأن التحفيز في المختبر له أيضا بعض القيود: (1) تتعطل الدوائر الطولية بعيدة المدى للحبل الشوكي ، مما يؤدي إلى فقدان المعلومات الواردة من القشرة الحركية أو الطرف السفلي. (2) قد يختلف توزيع المجالات الكهربائية أثناء التحفيز في المختبر عن ذلك الموجود في التحفيز في الجسم الحي. في هذه الدراسة ، كانت عتبة التنشيط (تقريبا بالمللي أمبير) ل APs أعلى بكثير من تلك الخاصة بالتجربة في الجسم الحي (تقريبا بالميكروأمبير)15 ؛ كان هذا لأن السعة الحجمية لمحلول ACSF في غرفة التسجيل كانت أعلى بكثير من السائل النخاعي في الحالة الطبيعية ، وتدعم النظرية الرياضية أن المجال الكهربائي يضعف بشكل أسرع في المواد عالية التوصيل22. ومن ثم، يمتص محلول الاستحمام معظم التيار، ونتوقع أن جزءا صغيرا فقط من المجال الكهربي يمكن أن ينتشر إلى جذور الأعصاب.
لذلك ، بالنظر إلى مزايا وعيوب التحفيز في الجسم الحي والتحفيز في المختبر ، يمكن الاستنتاج أن المشبك في المختبر هو طريقة مفيدة لدراسة الطبيعة المشبكية و / أو التأثيرات الخلوية ل SCS في القوارض الوليدية.
في الممارسة السريرية ، لا ينقبض القطب مباشرة على سطح الحبل الشوكي أو جذر العصب23. بدلا من ذلك ، يعتمد على إشعاع المجال الكهربائي الناتج عن القطب للتأثير بشكل غير مباشر على نشاط الأعصاب1. أكدت دراسات متعددة1،23،24 أنه يجب وضع ملامسة الكاثود ل SCS في أقرب مكان ممكن من الجذر الظهري أو منطقة الدخول (DREZ) لتحقيق الانتقائية المثلى لتحفيز عضلة معينة. زيادة المسافة بين القطب وجذر العصب سيضعف خصوصية التحفيز. لذلك ، نضع الكاثود مباشرة بالقرب من DREZ بدلا من الاتصال مباشرة بجذر العصب أو الحبل الشوكي.
تنتقل الألياف الواردة من الجذر الظهري أولا إلى الخلايا العصبية الحسية ، ثم إلى الخلايا العصبية البينية والخلايا العصبية الحركية. إلى جانب دوائر الإسقاط المستعرضة ، هناك أيضا دوائر تبرز نحو النهاية المنضدية والذيلية. على سبيل المثال ، يمكن العثور على الخلايا العصبية الحركية المقابلة لعضلة الظنبوب الأمامية على مستويات متعددة25. لذلك ، على الرغم من أن التحضير المائل قد يقطع دوائر الإسقاط المستعرضة ، إلا أنه سيظل يحافظ على ألياف الإسقاط غير المستعرضة ، مما يسمح بدراسة الدوائر الحسية قبل المحرك. بالإضافة إلى التحضير المائل والعرضي ، يوفر التحضير الطولي مزايا مميزة للحفاظ بشكل أفضل على الدوائر من الجذر الظهري إلى الخلايا العصبية الحركية وتمكين الاحتفاظ الفعال بدوائر الحبل الشوكي عبر أجزاء متعددة26 ، مما يوفر تمثيلا أقرب للظروف الفسيولوجية الحقيقية.
وفقا لبحث المحاكاة6،27،28 ، ينشط SCS بشكل أساسي الألياف الواردة الحسية لاستعادة حركة الطرف السفلي ، بما في ذلك الألياف الواردة Ia و Ib و II. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، لا يمكننا أن نؤكد بثقة أنواع الألياف التي تم تنشيطها على وجه التحديد بواسطة SCS. نتوقع أن نمطا مشابها قد يوجد أيضا في مشبك التصحيح في المختبر. سنعالج هذه المشكلة من خلال إجراء النمذجة الرياضية والمحاكاة ودمجها في عملنا المستمر.
في الختام ، قد يساعد هذا البروتوكول الباحثين على تحسين مهاراتهم التشغيلية وفهم أساسيات الجمع بين تسجيلات المشبك التصحيحي و SCS للتحقيق في الآلية الكهربائية ل SCS على نطاق خلية واحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين للعلماء الشباب (52207254 و 82301657) وصندوق علوم ما بعد الدكتوراه الصيني (2022M711833).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
