Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה המשתמשת במהדק טלאי כדי לחקור את התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים לגירוי חוט השדרה (SCS) ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה, אשר יכולה לסייע לחוקרים לשפר את כישוריהם בהפרדת חוט השדרה ובשמירה על קיום התא בו זמנית.
Abstract
גירוי חוט השדרה (SCS) יכול לשחזר ביעילות את תפקוד המנוע לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI). מאחר שהנוירונים המוטוריים הם היחידה האחרונה לביצוע התנהגויות סנסומוטוריות, לימוד ישיר של התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים באמצעות SCS יכול לעזור לנו להבין את ההיגיון הבסיסי של אפנון מוטורי בעמוד השדרה. כדי לתעד בו זמנית מאפייני גירוי מגוונים ותגובות תאיות, מהדק טלאי הוא שיטה טובה לחקור את המאפיינים האלקטרופיזיולוגיים בקנה מידה של תא יחיד. עם זאת, ישנם עדיין כמה קשיים מורכבים בהשגת מטרה זו, כולל שמירה על כדאיות התא, הפרדה מהירה של חוט השדרה מהמבנה הגרמי, ושימוש ב- SCS כדי לגרום בהצלחה לפוטנציאלי פעולה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט באמצעות מהדק טלאי כדי לחקור את התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים ל- SCS עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה, אשר יכול לעזור לחוקרים לשפר את כישוריהם בהפרדת חוט השדרה ושמירה על כדאיות התא בו זמנית לחקור בצורה חלקה את המנגנון החשמלי של SCS על נוירון מוטורי ולהימנע מניסוי וטעות מיותרים.
Introduction
גירוי חוט השדרה (SCS) יכול לשחזר ביעילות את תפקוד המנוע לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI). אנדריאס רווואלד ועמיתיו דיווחו כי SCS מאפשר תפקוד של מנוע הגפיים התחתונות ותא המטען בתוך יום אחד1. חקר המנגנון הביולוגי של SCS להתאוששות מוטורית הוא תחום מחקר קריטי וטרנדי לפיתוח אסטרטגיית SCS מדויקת יותר. לדוגמה, הצוות של גרגואר קורטין הראה כי נוירונים מעוררים Vsx2 ונוירונים Hoxa10 בחוט השדרה הם תאי העצב העיקריים לתגובה ל-SCS, ונוירומודולציה ספציפית לתא אפשרית כדי לשחזר את יכולת ההליכה של חולדה לאחר SCI2. עם זאת, מחקרים מעטים מתמקדים במנגנון החשמלי של SCS בקנה מידה של תא יחיד. אף על פי שידוע היטב כי גירוי הזרם הישר העל-גבי יכול לעורר את פוטנציאלי הפעולה (APs) בניסוי הדיונון הקלאסי 3,4,5, עדיין לא ברור כיצד הגירוי החשמלי הפועם לסירוגין, כגון SCS, משפיע על יצירת האות המוטורי.
בהתחשב במורכבות של מעגלים עצביים תוך שדרתיים, בחירה מתאימה לאוכלוסיית תאים חשובה לחקר המנגנון החשמלי של SCS. למרות ש-SCS משחזר את התפקוד המוטורי על-ידי הפעלת המסלול הפרופריוספטיבי6, הנוירונים המוטוריים הם היחידה הסופית לביצוע הפקודה המוטורית, הנגזרת משילוב קלט מידע פרופריוספציה7. לכן, לימוד ישיר של המאפיינים החשמליים של נוירונים מוטוריים עם SCS יכול לעזור לנו להבין את ההיגיון הבסיסי של אפנון מוטורי בעמוד השדרה.
כידוע, מהדק טלאי היא השיטה הסטנדרטית להקלטה אלקטרופיזיולוגית תאית ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה במיוחד8. לכן, מחקר זה מתאר שיטה המשתמשת במהדק טלאי כדי לחקור את התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים ל-SCS. בהשוואה למהדק טלאימוח 9, מהדק המדבקה של חוט השדרה קשה יותר מהסיבות הבאות: (1) חוט השדרה מוגן על ידי תעלת החוליות בנפח זעיר, מה שדורש מיקרומניפולציה עדינה מאוד ותחזוקה קפדנית של קור כקרח כדי להשיג יכולת קיום טובה יותר של התא. (2) מכיוון שחוט השדרה דק מכדי להיות מאובטח על מגש החיתוך, יש לטבול אותו באגרוז בנקודת התכה נמוכה ולקצץ אותו לאחר התמצקותו.
לפיכך, שיטה זו מספקת פרטים טכניים בניתוח חוט השדרה ושמירה על כדאיות התא בו זמנית כדי ללמוד בצורה חלקה את המנגנון החשמלי של SCS על נוירונים מוטוריים ולמנוע ניסויים וטעויות מיותרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרה את כל הניסויים בבעלי חיים והמחקרים נערכו בהתאם לתקנות הרלוונטיות לרווחת בעלי חיים.
1. הכנת בעלי חיים
- חיות
- מידע על דיור: חולדות Sprague-Dawley זכרים (10-14 ימים לאחר הלידה, P10-P14) בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים.
הערה: תנאי החדר נשמרו ב 20 ° C ± 2 ° C, לחות: 50%-60%, עם מחזור אור / כהה של 12 שעות. לבעלי החיים הייתה גישה חופשית למזון ולמים. - תייגו את הנוירונים המוטוריים בנסיגה לאחור: הזריקו פלואורו-זהב (FG) לשריר הטיביאליס הקדמי ושריר הגסטרוקנמיוס הדו-צדדי (2% במי מלח סטריליים, 50 מיקרוליטר לשריר) כדי לתייג את הנוירונים המוטוריים יומיים לפני ההקרבה.
- מידע על דיור: חולדות Sprague-Dawley זכרים (10-14 ימים לאחר הלידה, P10-P14) בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים.
- פתרונות
- הכינו תמיסת חיתוך: ערבבו 120 mM כולין כלוריד, 2.6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1.25 mM NaH 2 PO4, 0.5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl 2, 1.3 mM חומצה אסקורבית, 15 mM גלוקוז. ערבבו מראש את התמיסה עם 95% O 2 ו-5% CO2 (התאימו ל-pH 7.4 עם KOH) למשך 30 דקות לפני הנתיחה והפריסה. מצננים את התמיסה עם קרח כתוש.
- הכנת נוזל מוחי מלאכותי (ACSF): לערבב 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4; 1.3 mM MgCl 2, 2.4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ו-10 mM גלוקוז. יש לבעבע מראש את התמיסה עם 95% O 2 ו-5% CO2 למשך 30 דקות לפני הדגירה.
- הכנת תמיסה תוך-תאית: לערבב 126 mM K-Gluconate, 2 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na 2 ATP, 0.4mM Na2 GTP, 10 mM K-Phosphocreatine, ו 0.5% Neurobiotin (pH 7.25 ו 305 mOsm / Kg). מצננים את התמיסה עם קרח כתוש.
- הכינו ג'ל אגרוז בהתכה נמוכה: המסו 4 גרם אגרוז ב-100 מ"ל של תמיסת חיתוך, והשתמשו ברוטור ערבוב מגנטי כדי להמיס אותו במלואו. ב 30 דקות לפני ההטבעה, לחמם את נקודת ההתכה נמוכה agarose בתנור מיקרוגל עם עוצמה גבוהה במשך 1 דקות, ולאחר מכן להעביר אותו לתוך אמבט מים 39 ° C כדי לשמור על המצב הנוזלי.
- הכנת מכשירים
- הניחו קרח כתוש על מגש הזילוח (איור משלים 1A) 10 דקות לפני הזילוח. הניחו את המגש האנטומי (איור משלים 1B) ואת מגש החיתוך (איור משלים 1C) עם רצועת מים בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה מראש.
- מניחים את תא הדגירה עם רשת ניילון בתנור ב 45 מעלות צלזיוס לילה מראש.
- השתמשו באגרוז בנקודת התכה נמוכה כדי ליצור מראש שיפוע של 35° ופלטפורמה בעובי 2 מ"מ (איור משלים 1D). לאחר התמצקות הג'ל, הניחו אותם במרכז צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ כדי לתמוך בחוט השדרה בהליכים הבאים.
- זילוח תוך לבבי
- מרדימים את החולדות עם 2.5% טריברומואתנול (160 μL/10 גרם) באמצעות הזרקה תוך צפקית. ודאו שהחולדות מורדמות לחלוטין על ידי אימות חוסר התגובה לגירויים חיצוניים, כגון צביטה עדינה של הבוהן.
- כאשר ההרדמה המתאימה מאושרת, מניחים את החולדות בשכיבה ומשתקים אותן בצלחת פטרי מלאה בג'ל סיליקה.
- חותכים חתך עור אורכי של 5 מ"מ באופן קאודלי לתהליך הקסיפואיד, ולאחר מכן מרחיבים באופן מלא את החלל התת עורי. חתכו חתך עור אורכי בקוטר 2 ס"מ לאורך קו האמצע הגחוני כדי לחשוף באופן מלא את דופן החזה החיצונית, החל מהחתך הנ"ל וכלה בחלק העליון של החזה.
- השתמשו בפינצטה עם שיניים כדי להרים את הקסיפואיד (איור משלים 2A), ואז השתמשו במספריים עדינים כדי לחתוך את הסרעפת. חתכו את עצם החזה לאורך שני הצדדים של תהליך הקסיפואיד כדי לפתוח את בית החזה ולחשוף את הלב (איור משלים 2B).
הערה: יש להקפיד לשמר את כלי החזה הפנימיים משני הצדדים; אחרת, זה עלול לגרום לדימום מסיבי. - השתמש בפינצטה חסרת שיניים כדי להרים את החדר השמאלי. הכניסו מחט 22G לקודקוד החדר השמאלי לאורך ציר האורך של החדר השמאלי (איור משלים 2C). בינתיים, שימו לב לפעימת הדם הקצבית בצינור הזילוח, או שהמחט עלולה לנקב בחדר הימני, מה שעלול להוביל לאפקט זילוח גרוע.
הערה: אין להשתמש בפינצטה עם שיניים; אחרת זה עלול לגרום לדליפת דם נוספת מאתר החזקת הפינצטה. - השתמשו במספריים עדינים כדי לחתוך את האטריום הימני (איור משלים 2C), ואז הזריקו ידנית 100 מ"ל של נוזל מחורר קר כקרח בקצב של כ-2 מ"ל/שנייה תוך דקה אחת.
הערה: כאשר הכבד והכפות של חולדות מחווירים, ולא זורם דם מהאטריום הימני, ניתן להשיג זילוח טוב.
- דיסקציה של חוט השדרה (איור 1)
- הניחו את החולדה במצב נוטה, וחתכו את עמוד השדרה בעמוד השדרה האיליאק העליון הקדמי (בערך L4 ברמת החוליות) ובנקודת הסטת העקמומיות של עמוד החזה (בערך רמת חוליה T6), בהתאמה (איור 1A). לאחר מכן, הניחו מיד את עמוד השדרה המבודד בתמיסה המחומצנת הקרה כקרח כדי לשטוף את שאריות הדם ורקמת השומן; הליך זה מועיל לשמירה על ניקיון השדה האופרטיבי בהליכים הבאים.
הערה: השרירים הפארא-ספינליים צריכים להיות שמורים, מה שתורם לקיבוע הבא של עמוד השדרה באמצעות סיכת חרקים. - העבירו מיד את עמוד השדרה המבודד למגש האנטומי (איור 1B) כאשר הצד הגבי כלפי מעלה והקצה הרוסטרלי קרוב למפעיל. מלאו את המגש האנטומי ב-50 מ"ל של תמיסת חיתוך קרה כקרח מחומצנת ברציפות (איור 1B).
- השתמשו בארבע סיכות חרקים כדי לקבע את עמוד השדרה על-ידי חדירה לשרירים הפארא-ספינליים (איור 1B).
- תחת מיקרוסקופ דיסקציה, חתכו את הפדיקור של החוליות משני הצדדים מהקצה הרוסטרלי בעזרת המיקרו-מספריים, שניתן לכנותו "למינקטומיה" (איור 1C). שימו לב לא לפגוע בחוט השדרה. בינתיים, השתמש בפינצטה בעלת השיניים הזעירות כדי להרים את גוף החוליה החתוך.
- לאחר כריתת הלמינקטומיה, אין להפריד את חוט השדרה מתעלת עמוד השדרה באופן מיידי. במקום זאת, השתמשו במיקרו-מספריים כדי לחתוך את הדורה מאטר לאורך קו האמצע הגבי, אשר תורם לספיגת חומרי מזון בין תאים ו-ACSF מחומצן (איור 1D).
הערה: לעולם אל תקרע את הדורה מאטר. רק חיתוך הדורה מאטר על ידי מיקרו-מספריים מותר; אחרת, שורש העצב והפרנכימה בעמוד השדרה ייפגעו קשות! - הרימו את החלק הרוסטרלי של חוט השדרה, ואז חתכו בזהירות את שורש העצב עם כ-1 מ"מ שמורים (איור 1E). לאחר הפרדת חוט השדרה מתעלת החוליות, השתמשו בשתי סיכות חרקים כדי לקבע את חוט השדרה כשהצד הגחוני כלפי מעלה (איור 1F).
- השתמשו במיקרו-מספריים כדי לחתוך את הדורה מאטר לאורך קו האמצע הגחוני (איור 1F). חותכים את שורשי העצבים המיותרים עם כ 1 מ"מ שמור.
הערה: העצב הרבה יותר עקשן מחוט השדרה. אם שורש העצב השמור ארוך מדי (>1 מ"מ), הוויברטום אינו יכול לחתוך את שורש העצב, מה שעלול להוביל לקרע רציני בפרנכימה בעמוד השדרה. - השתמשו במיקרו-מספריים כדי להפריד את ההגדלה המותנית לאורך של 6-7 מ"מ (איור 1G).
- הניחו את החולדה במצב נוטה, וחתכו את עמוד השדרה בעמוד השדרה האיליאק העליון הקדמי (בערך L4 ברמת החוליות) ובנקודת הסטת העקמומיות של עמוד החזה (בערך רמת חוליה T6), בהתאמה (איור 1A). לאחר מכן, הניחו מיד את עמוד השדרה המבודד בתמיסה המחומצנת הקרה כקרח כדי לשטוף את שאריות הדם ורקמת השומן; הליך זה מועיל לשמירה על ניקיון השדה האופרטיבי בהליכים הבאים.
- הטבעה באגרוז הנמס נמוך
- הניחו את ההגדלה המותנית בשיפוע של 35 מעלות (איור 1H) כאשר הצד הגבי כלפי מעלה והקצה הקאודלי כלפי מטה. השתמשו בנייר סינון סופג כדי להסיר מים בשפע על פני הרקמה (איור 1H).
- מזגו באיטיות את ג'ל האגרוז המותך לתוך צלחת פטרי שמכילה את ההגדלה המותנית (איור 1I).
הערה: אין לשפוך מהר מדי, אחרת יצטברו בועות בג'ל. - מניחים את צלחת הפטרי הנ"ל בתערובת מי קרח כדי לקרר את הג'ל בהקדם האפשרי, מה שתורם לשמירה על פעילות התאים.
- חתכו את הג'ל לקובייה בגודל 15 מ"מ x 10 מ"מ x 10 מ"מ והרכיבו אותו על דיסק הדגימה עם דבק-על (איור 1J).
- חיתוך
- הניחו את דיסק הדגימה במגש החיתוך הקפוא מראש, ולאחר מכן שפכו את תמיסת החיתוך הקרה כקרח (איור 1K). מבעבעים ברציפות עם 95% CO 2 ו-5% O2 לתוך מגש החיתוך.
- הגדר את פרמטרי הוויברטום: עובי: 350 מיקרומטר; מהירות: 0.14-0.16 מ"מ לשנייה, משרעת: 1.0 מ"מ ותדר רטט: 85 הרץ.
- קצרו 2-3 פרוסות מתאימות לכל בעל חיים. רשמו 1-2 תאי עצב מוטוריים בריאים מסוג FG+ בכל פרוסה, עם טווח של 5-6 תאים לכל חיה.
- דגירה
- השתמשו בפינצטה של שקף הכיסוי כדי לחתוך פרוסה (איור 1L) והכניסו אותה לתא הדגירה המלא ב-ACSF מחומצן ברציפות. הניחו את תא הדגירה באמבט מים בטמפרטורה של 32°C למשך 30 דקות, ולאחר מכן המשיכו לדגור עליו בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות נוספות לפני ההקלטה.
הערה: ההליכים לעיל, מהרדמה ועד קבלת הפרוסה הראשונה, צריכים להסתיים תוך 20-30 דקות כדי לשמור על הכדאיות של התאים ככל האפשר. הנוירונים המוטוריים בכל פרוסה יכולים לשמור על יכולת הקיום שלהם במשך כ-6-7 שעות.
- השתמשו בפינצטה של שקף הכיסוי כדי לחתוך פרוסה (איור 1L) והכניסו אותה לתא הדגירה המלא ב-ACSF מחומצן ברציפות. הניחו את תא הדגירה באמבט מים בטמפרטורה של 32°C למשך 30 דקות, ולאחר מכן המשיכו לדגור עליו בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות נוספות לפני ההקלטה.
2. הקלטת מהדק טלאי עם SCS (איור 2)
- ההכנות
- יש לנקב את תא ההקלטה עם ACSF מבעבע ברציפות בקצב של כ-1-2 מ"ל/דקה. כוונן את קצב הזרימה בנפרד באמצעות לוח הבקרה במשאבה הפריסטלטית.
- הכניסו פרוסה לתא ההקלטה. השתמש בחוט פלטינה בצורת U עם חוטי ניילון כדי לייצב היטב את הפרוסה במקומה.
- השתמש במיקרוסקופ ניגודיות הפרדה אדום (IR-DIC) כדי לצפות בפרוסה. תחת עדשת 4x אובייקטיבית, לאשר כי אורך השורש הגבי הוא כ 1 מ"מ. מצא את האזור שבו השורש הגבי נכנס לפרנכימה, ולאחר מכן העבר את שדה הראייה המרכזי לאזור זה.
- חברו את מחולל הדופק באמצעות אלקטרודות מותאמות אישית (איור 2A).
- תצורת SCS
- מקמו את האנודה של SCS ליד קו האמצע הגבי דרך מערכת המיקרומניפולציה (איור 2B).
- מקמו את הקתודה של SCS ליד אזור הכניסה של השורש הגבי (DREZ) דרך מערכת המיקרומניפולציה (איור 2B).
- מיקוד והדמיה של תאים
- השתמש IR-DIC עם עדשה אובייקטיבית 10x למצוא בערך את האזור הדורסולטרלי של העמודה המוטורית, שבו רוב הנוירונים המוטוריים ממוקמים. לאחר מכן, העבר את שדה הראייה המרכזי לאזור זה.
- עברו לעדשה אובייקטיבית פי 60 כדי למצוא תא עצב בריא עם משטח חלק ובהיר וגרעינים בלתי נראים (איור 2C,F).
- הנמיכו מעט את עוצמת האינפרא-אדום והפעילו את מקור האור הפלואורסצנטי. העבירו את מסנן האור למסנן העירור האולטרה-סגול בפס רחב (איור 2D,G), כדי לבחור נוירון מוטורי חיובי ל-FG (FG+) מתאים (איור 2E,H).
- השתמש באלקטרודות יניקה כדי להחיל גירוי סף מנוע 1x על השורש הגבי. אם פוטנציאל פעולה מעורר מזוהה בתאי העצב המוטוריים (איור משלים 3), הוא מאשר שהפעילות של השורש הגבי תקינה. אם לא, יש לזרוק פרוסה זו.
- הקלטת מהדק טלאי
- ממלאים את המיקרופיפטה בתמיסה התוך תאית ומכניסים אותה למחזיק האלקטרודות. השתמש במערכת micromanipulation כדי להוריד את פיפטה לתוך האמבטיה ACSF. התנגדות פיפטה נע בין 5-8 MΩ.
- החל כמות קטנה של לחץ חיובי על פיפטה כדי לפוצץ את האבק ואת פסולת התא.
- הנמיכו את האלקטרודה כדי להתקרב לתא. כאשר פיפטה נוגעת בפני השטח של נוירון FG+, כניסה קטנה של הממברנה הופכת גלויה ברמת הקצה. שחררו את הלחץ החיובי.
- לאחר מכן, להחיל כמות קטנה של לחץ שלילי על פיפטה באמצעות מזרק. זה יוצר כמות קטנה של יניקה שמושכת את קרום התא למגע עם פיפטת הזכוכית. שים לב תמיד להתנגדות הכוללת בממשק התוכנה עד שערך ההתנגדות עולה לג'יגה (>1 GΩ). לאחר מכן, gigaseal נוצר.
- הדקו את פוטנציאל הממברנה ב- -70 mV, ולאחר מכן לחצו על כפתור פיצוי הקיבול המהיר בממשק התוכנה של המגבר. הפעילו בעדינות לחץ שלילי חולף כדי לקרוע את קרום התא, ולאחר מכן לחצו על כפתור פיצוי הקיבול האיטי בממשק התוכנה של המגבר. בשלב זה, מתקבלת תצורה טובה של תא שלם.
- עבור למצב מהדק זרם על ידי לחיצה על לחצן IC בממשק התוכנה ורשום את פוטנציאל קרום המנוחה (RMP).
- החל את SCS עבור 1-2 s עם משרעת של 1-10 mA, בעוד רוחב הדופק ואת התדר קבועים ב 210 μs ו 40 הרץ, בהתאמה. קבע את סף המנוע על ידי הגדלה איטית של משרעת הגירוי עד לנקודת הגישה הראשונה.
- הבחינו בין נוירונים מוטוריים בירי מושהה ומיידי באמצעות הזרקת זרם דה-פולריזציה של 5 שניות סביב בסיס הריאו במצב מהדק זרם10,11,12. נוירונים מוטוריים יורים מיידית: בסיס נמוך יכול לגרום לירי מיידי וחוזר ונשנה עם תדירות ירי יציבה; נוירונים מוטוריים של ירי מושהה: בסיס גבוה יכול לגרום להתחלה מאוחרת של ירי חוזר עם קצב ירי מואץ (איור 3).
- כאשר SCS כבוי, המשך לתעד את פוטנציאל הממברנה ללכידת הירי הספונטני של נקודות גישה.
- בצע הקלטות מהדק מתח הקלטות מהדק מתח עבור זרם פוסט-סינפטי מעורר (EPSC) כאשר SCS מופעל וכבוי. פרמטר הגירוי הוא סף מנוע 1x, 210 μs, 2 הרץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הודות לתחזוקה הקפדנית בטמפרטורה נמוכה במהלך הפעולה העדינה (איור משלים 1, איור משלים 2 ואיור 1), יכולת הקיום של התא הייתה טובה מספיק כדי לבצע רישומים אלקטרופיזיולוגיים עוקבים. כדי לדמות את התרחיש הקליני ככל האפשר, השתמשנו במיקרומניפולציה כדי למקם את הקתודה והאנודה של SCS ליד קו האמצע הגבי ו-DREZ, בהתאמה (איור 2), אשר יכולים ליזום אות עצבי בקרן הגבית כדי להתפשט לתאי העצב המוטוריים באזור הדורסולטרלי של העמודה המוטורית. במחקר הזה השתמשנו ב-FG כדי לאתר תאי עצב מוטוריים בקוטר של 20-50 מיקרומטר. כפי שניתן לראות באיור 2D,G, אישרנו בביטחון נוירון FG+ בריא כתא עצב מוטורי – הטרמינל של מעגל עמוד השדרה. שיטת תיוג זו סללה את הדרך לחקר האופן שבו SCS משפיע על דפוס הירי. התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירונים מוטוריים בירי מושהה ומיידי מפורטות בטבלה משלימה 1 ובטבלה משלימה 2. השיטות לחישוב המאפיינים האקטיביים והפסיביים מובאות בקובץ משלים 1.
כאשר SCS העביר שדה חשמלי פועם לסירוגין לפרוסת עמוד השדרה, השתמשנו תחילה במצב מהדק זרם כדי לתעד את התגובה של פוטנציאל הממברנה (איור 4). ככל שהגדלנו בהדרגה את משרעת הגירוי עם צעד של 1/3 סף מנוע (איור 4B,C), גם פוטנציאל הממברנה עלה יחד איתו, אולם רק סף מנוע 1x יכול היה לעורר APS (איור 4D). איור 4D מראה שבערך כל 10-20 פעימות יכולות לעורר AP, מה שמצביע על כך שעשויה להתקיים סדירות מוגדרת של תגובת AP למשרעת SCS.
לאחר כיבוי ה-SCS, המשכנו לתעד את פוטנציאל הממברנה. איור 5 הראה שפוטנציאל הממברנה גדל מעט ל-60- mV, ותא העצב ירה סדרה של נקודות גישה ספונטניות. נקודות גישה ספונטניות אלה נמשכות פרק זמן קצר (30-40 שניות), ואז פוטנציאל הממברנה חזר ל -65 mV, מה שמצביע על כך שה- SCS יכול להגביר באופן זמני את ההתרגשות של התא.
לאחר מכן, השתמשנו ברישומי מהדק מתח עבור EPSC כאשר SCS היה מופעל וכבוי (איור 6). לאחר כל פעימת SCS, ניתן היה לזהות EPSC מעורר. ההשהיה בין חפץ הגירוי לבין EPSC הייתה 2.64 ±-0.38 אלפיות השנייה (תרשים משלים 4). המשרעת של EPSCs מעוררים הייתה 35.14 ± 12.73 pA (איור משלים 4). התדירות של EPSCs מעוררים עקבית עם תדר SCS. לאחר הפחתת איזון המטען הפסיבי, ניתן לראות את ה-EPSC המעורר בנוירון מוטורי בר-קיימא בעקבות גירוי סף מוטורי 1x (איור משלים 5A). קוטביות הגירוי התהפכה לאחר עצירת הזילוח למשך שעתיים באותו תא. הגירוי לא גרם ל-EPSC כלשהו, מה שאישר שה-EPSC המעורר לא היה חפץ (איור משלים 5B).
איור 1: דיסקציה וחיתוך של חוט השדרה . (A) חתכו את עמוד השדרה בעמוד השדרה האיליאק העליון הקדמי (בערך L4 ברמת החוליות) ואת נקודת הסטת העקמומיות של עמוד החזה (בערך ברמת חוליות T6), בהתאמה. (B) העבירו מיד את עמוד השדרה המבודד למגש האנטומי כאשר הצד הגבי כלפי מעלה והקצה הרוסטרלי קרוב למפעיל. מלאו את המגש האנטומי בתמיסת חיתוך קרה כקרח מחומצנת ברציפות. (C) לבצע למינקטומיה משני הצדדים מהקצה הרוסטרלי. (D) חתכו את הדורה מאטר הגבית, אשר תורמת לספיגת חומרי מזון בין תאים ונוזל מוחי מלאכותי מחומצן (ACSF). (E) חתכו בזהירות את שורש העצב. (F) חותכים את הדורה מאטר הגחוני. (ז) הפרידו את ההגדלה המותנית לאורך של 6-7 מ"מ. (H) הניחו את ההגדלה המותנית בשיפוע של 35°, כאשר הצד הגבי למעלה והקצה הקאודלי כלפי מטה. השתמש בנייר סינון סופג כדי להסיר מים בשפע על פני הרקמה. (I) מוזגים באיטיות את ג'ל האגרוז המותך לתוך צלחת הפטרי. (J) חותכים את הג'ל לקובייה ומרכיבים אותו על דיסק הדגימה עם דבק על. (יא) הניחו את דיסק הדגימה במגש החיתוך, ולאחר מכן שפכו את תמיסת החיתוך הקרה כקרח. (יב) דוגמה לפרוסת עמוד שדרה בהגדלה מותנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תצורת גירוי חוט השדרה (SCS) והדמיית נוירונים מוטוריים. (A) מחולל הדופק עם אלקטרודות מותאמות אישית יכול להתאים בנפרד את המשרעת, רוחב הדופק והתדירות. הכניסה הראתה כי המפרט הממדי של מגע אלקטרודה הוא 800 מיקרומטר x 500 מיקרומטר x 300 מיקרומטר. (B) מקם את האנודה והקתודה ליד קו האמצע הגבי ואזור הכניסה של השורש הגבי (DREZ) באמצעות מערכת המיקרומניפולציה, בהתאמה. הניחו את פיפטת ההקלטה באזור הדורסולטרלי של העמוד המוטורי כדי להדק את הנוירונים המוטוריים המוטוריים החיוביים לפלואורו-זהב (FG+). (C) נוירון מנוע בריא שיורה מיידית עם מיקרוסקופ ניגודיות דיפרנציאלי אינפרא אדום (IR-DIC) הדמיה (60x). (D) אותו תא עצב עם דימות פלואורסצנטי בלבד (60x), חלקיקים פלואורו-זהובים זוהרים (FG) מייצגים שתא העצב הזה הוא נוירון מוטורי. (ה) תמונה ממוזגת של IR-DIC ופלואורסנציה בנוירון מוטורי FG+. (פ-ח) נוירון מנוע ירי מושהה בריא עם הדמיית IR-DIC (פי 60). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הבחינו בין תאי עצב מוטוריים בירי מושהה ומיידי באמצעות הזרקת זרם דה-פולריזציה של 5 שניות. (A) נוירונים מוטוריים של ירי מיידי: בסיס נמוך יכול לגרום לירי מיידי וחוזר ונשנה עם תדירות ירי יציבה; (B) נוירונים מוטוריים של ירי מושהה: בסיס גבוה יכול לגרום להתחלה מאוחרת של ירי חוזר עם קצב ירי מואץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: גירוי חוט השדרה (SCS) עורר פוטנציאלי פעולה (APs) שיורים בתאי עצב מוטוריים . (A) כאשר לא הופעל גירוי, פוטנציאל קרום המנוחה (RMP) היה -65 mV. (B) גירוי סף מנוע של 1/3x אינו יכול לעורר נקודות גישה. (C) גירוי סף מנוע של 2/3x אינו יכול לעורר APs. (D) גירוי סף מנוע אחד יכול לעורר נקודות גישה, וכל 10-20 פעימות יכולות לעורר נקודת גישה. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: פוטנציאלי פעולה ספונטניים (APs) שנורו לאחר גירוי חוט השדרה (SCS). לאחר כיבוי ה-SCS, תא העצב ירה סדרה של APs ספונטניים למשך פרק זמן קצר (30-40 שניות), ואז פוטנציאל קרום המנוחה (RMP) חזר ל-65- mV. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: איור של פרמטר גירוי חוט השדרה (SCS) וזרם פוסט-סינפטי מעורר (EPSC). (A) איור של פרמטר SCS; (ב,ג) בעקבות פעימת גירוי יחידה (גירוי סף מנוע 1x), ניתן לצפות ב- EPSC המעורר; (D) לאחר הפחתת איזון המטען הפסיבי, ניתן לחשב את ההשהיה והמשרעת של EPSC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים משלים 1: הכנת מכשירים. (A) מגש זילוח: 10 דקות לפני הזילוח, הניחו קרח כתוש על צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ ממולאת בג'ל סיליקה. (B) מגש אנטומי: בלילה שלפני ההקרבה, הניחו את המגש האנטומי מתוצרת עצמית מלא בג'ל סיליקה במקרר בטמפרטורה של -80°C. (C) מגש חיתוך: בלילה שלפני ההקרבה, הניחו את מגש החיתוך עם רצועת המים במקרר בטמפרטורה של -80°C. (D) שיפוע יציקת אגרוז: 30 דקות לפני הזלוף, מניחים מדרון אגרוז 35° עם לוחות בסיס במרכז צלחת פטרי 35 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: זילוח תוך לבבי. (A) להרים את תהליך הקסיפואיד. (B) חתכו את עצם החזה לאורך שני הצדדים של תהליך הקסיפואיד כדי לפתוח את החזה ולחשוף את הלב. היזהרו שלא לפגוע בכלי החזה הפנימיים, אחרת דימום מסיבי ימלא את כל שדה הניתוח ויקשה על המפעיל לזהות את קודקוד החדר או אטריום ימין. (C) יש להחדיר מחט 22 גרם בקודקוד החדר השמאלי לצורך זילוח ולחתוך את האטריום הימני ליציאת נוזלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 3: אישור פעילות השורש הגבי. השתמש באלקטרודות יניקה כדי להחיל גירוי סף מנוע 1x על השורש הגבי. אם פוטנציאל פעולה מעורר מזוהה בנוירונים המוטוריים, אנו יכולים לאשר כי הפעילות של השורש הגבי היא שלמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 4: השהיה ומשרעת של EPSCs מעוררים כאשר SCS היה מופעל. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 5: הדגמת תוקפו של ה-EPSC המעורר. (A) בעקבות גירוי סף מוטורי 1x לאחר הפחתת איזון המטען הפסיבי, ניתן לראות את ה-EPSC המעורר בנוירון מוטורי בר קיימא; (B) לאחר עצירת הזילוח למשך שעתיים באותו תא, קוטביות הגירוי התהפכה, גירוי סף מנוע 1x לא גרם ל- EPSC כלשהו, מה שאישר כי EPSC המעורר אינו חפץ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 1: שיטות חישוב המאפיינים האקטיביים והפסיביים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: תכונות פסיביות של נוירונים מוטוריים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 2: תכונות פעילות של נוירונים מוטוריים אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מידע התנועה המווסת על ידי SCS מתכנס לבסוף לנוירונים המוטוריים. לכן, לקיחת הנוירונים המוטוריים כיעד המחקר עשויה לפשט את תכנון המחקר ולחשוף את מנגנון הנוירומודולציה של SCS באופן ישיר יותר. כדי לתעד בו זמנית מאפייני גירוי מגוונים ותגובות תאיות, מהדק טלאי הוא שיטה טובה לחקור את המאפיינים האלקטרופיזיולוגיים בקנה מידה של תא יחיד. עם זאת, ישנם עדיין כמה קשיים, כולל כיצד לשמור על כדאיות התא, כיצד להפריד במהירות את חוט השדרה מהמבנה הגרמי, וכיצד להשתמש ב- SCS כדי לגרום ל- APs בהצלחה. לכן, מחקר זה נועד לסייע לחוקרים לתפוס במהירות מיומנויות אופרטיביות חיוניות, להימנע מכמה מלכודות אפשריות, ולהתמקד בעיצוב המחקר ולא במתודולוגיה מוקדם ככל האפשר.
כדי להשיג יכולת קיום טובה של התא, יש לשים לב תמיד לפרטים הבאים: (1) שמירה על חוט השדרה בטמפרטורה קרה כקרח חשובה מאוד מכיוון שטמפרטורה נמוכה יכולה לעכב מוות תאי ולהאט את קצב חילוף החומרים, מה שיכול להגן על תא העצב מפני נזק מכני במהלך זילוח, דיסקציה וחיתוך13; (2) הסרה עדינה של הדורה מאטר על ידי מיקרו-מספריים יכולה לשפר את ספיגת החומרים המזינים העצביים מתמיסות הסביבה. לעולם אל תקלף ישירות את הדורה מאטר; אחרת, חוט השדרה ייפגע קשות. בנוסף, אם אתה שוכח לנקות את הדורה מאטר, תהליך החיתוך הבא עשוי להיות קשה מכיוון שהלהב לא יכול לחתוך לחלוטין את הדורה מאטר ואז לתלוש את חוט השדרה הנותר מאגרוז, מה שעלול להוביל לכישלון החיתוך. (3) בהשוואה לפרוסה רוחבית קונבנציונלית, פרוסות אלכסוניות מגדילות את שטח החומר האפור, וניתן למצוא יותר נוירונים מוטוריים FG+ בפרוסה אחת9. (4) מכיוון שחוט השדרה לבדו אינו יכול להיות מקובע היטב על דיסק הדגימה כמו המוח, הטבעתו בג'ל אגרוז יעילה בפתרון בעיה זו מבלי להפחית את יכולת הקיום של התא. אנו ממליצים להשתמש באגרוז בהתכה נמוכה (נקודת ג'ל 26-30 מעלות צלזיוס) ולא באגרוז רגיל (נקודת ג'ל 38-43 מעלות צלזיוס), מכיוון שטמפרטורה גבוהה עלולה לפגוע בכדאיות התא. (5) אנו ממליצים שהמרחק בין שני חוטי ניילון של חוט פלטינה בצורת U יהיה 1 עד 1.5 מ"מ מכיוון שחוטים רופפים אינם יכולים לשתק היטב את חוט השדרה, וחוטים צפופים עלולים למעוך את התא.
בהשוואה להתקני גירוי קונבנציונליים, כגון אלקטרודות וו דו קוטביות בשימוש נרחב במחקר בסיסי, אלקטרודת SCS במחקר זה נגזרת מהעבודה הקלינית הקודמת שלנו14 וממחקר בסיסי15. משלוחי SCS פולסים לסירוגין גירוי חשמלי, המספק מידות התאמת פרמטרים מגוונות. מכשיר SCS זה יש גם פונקציה איזון מטען כדי למנוע אלקטרוליזה רקמות ואינו מגע ישיר עם הרקמה העצבית; לכן, SCS זה יש בטיחות טובה עבור יישומי in vivo .
לאחר טיפול ב-SCS, ניתן לייחס את ה-APs הספונטניים של נוירונים מוטוריים לסיבות הבאות: (1) SCS גורם למטען להצטבר בגוף התא ובקוליקולוס האקסונלי של נוירונים, מה שמוביל לעלייה של RMP16. תופעה זו מצביעה על כך ש-SCS עשוי לשפר את ההתרגשות של תאי עצב, אשר עשויים להיות קשורים לשינוי המוליכות של תעלות יונים לאחר SCS, כגון Na v 1.117, K v 2.1 18, או Ca v 2.3 19. (2) SCS עשוי להפעיל נוירונים GABAergic גביים כדי להקל על משוב פרופריוצפטיבי לנוירונים מוטוריים. אנו מציעים כי העברה עצבית עשויה להתקיים ברציפות בין נוירוני החישה לנוירונים המוטוריים, מה שמוביל לנקודות גישה ספונטניות בנוירונים מוטוריים לאחר SCS. נקודות גישה ספונטניות יכולות לשמור על מצב פנימי של מוכנות לביצוע התנהגויות סנסומוטוריות20. לכן, הפעלה או עיכוב של APs ספונטניים עשויים להועיל לטיפול במחלות נוירולוגיות בעמוד השדרה.
כידוע, הקלטה אלקטרופיזיולוגית in vivo טובה יותר לגילוי תגובה אלקטרופיזיולוגית תחת הפיזור הטבעי של השדה החשמלי ומיקום האלקטרודות. יתר על כן, הקלטות מוטונורון in vivo מאפשרות זיהוי של זהות מוטונורון. ניתן לעשות זאת באמצעות זיהוי אנטי-דרומי של אקסונים מוטוריים בשילוב עם מדידת כוח סיבי שריר21. אבל לרישומי חוט השדרה in vivo יש גם את החסרונות הבאים: (1) נוירון מוטורי נמצא במרחק של 2-3 מ"מ מפני השטח הגביים של חוט השדרה, אפילו באמצעות הדמיה קונפוקלית דו-פוטונית המתקדמת ביותר, עומק התצפית הוא רק 500-800 מיקרומטר, ולכן קשה לצפות בהם אופטית in vivo בשיטות הקיימות. לכן, אם אנו רוצים להדק בדיוק נוירון מוטורי יחיד in vivo, פיפטת הזכוכית חייבת לעבור דרך עמוד הגב כדי להגיע לנוירון המוטורי הבלתי נראה; מהדק המדבקה in vivo יכול להתבצע רק בצורה "עיוורת", וכתוצאה מכך חוסר ודאות משמעותי ושיעור כישלון. (2) למעט מהדק טלאי in vivo , הקלטות אלקטרודות סיליקון יכולות להיות השיטה החלופית, כגון מערך יוטה או אלקטרודת נוירופיקסלים. עם זאת, האותות הנקלטים על ידי אלקטרודות סיליקון הם בעיקר פוטנציאל פעולה מורכב ולא פוטנציאל פעולה יחיד. למרות שהפעילות של נוירונים בודדים נפתרה באמצעות אלגוריתמים למיון ספייקים, עדיין יש לשפר את הדיוק והאמינות של אלגוריתמי המיון.
בהשוואה להקלטות in vivo, היתרון הגדול ביותר של in vitro against in vivo הוא השימוש במהדק מתח, המאפשר הבנה ייחודית של המסלולים הסינפטיים המופעלים על ידי SCS. בנוסף, היא תאפשר גם שימוש בכלי הדמיה חיים. אנו משערים כי SCS גורם לשחרור של מוליכים עצביים כגון GABA וגלוטמט מתאי עצב ברמה העליונה אל תאי העצב המוטוריים, וכתוצאה מכך תגובת EPSC מעוררת כללית7. לכן, במחקר הקרוב שלנו, נשלב את הזיהוי של IPSC, מיני EPSC (mEPSC), ו- EPSC מעורר המושרה על ידי SCS כדי להבהיר את הדפוסים של שחרור נוירוטרנסמיטרים מעכבים ומעוררים מנוירונים קדם-מוטוריים או בין-נוירונים. הכרנו באופן מלא בכך שלגירוי חוץ גופי יש גם כמה מגבלות: (1) מעגלים אורכיים ארוכי טווח של חוט השדרה משתבשים, וכתוצאה מכך אובדן מידע נכנס מקליפת המוח המוטורית או מהגפיים התחתונות; (2) התפלגות השדות החשמליים במהלך גירוי חוץ גופי עשויה להיות שונה מזו של גירוי in vivo. במחקר זה, סף ההפעלה (בקירוב במיליאמפר) עבור APs היה גבוה בהרבה מזה של ניסוי in vivo (בערך במיקרואמפר)15; הסיבה לכך הייתה שקיבולת הנפח של תמיסת ACSF בתא ההקלטה הייתה גבוהה בהרבה מהנוזל השדרתי במצב הטבעי, והתיאוריה המתמטית תומכת בכך שהשדה החשמלי נחלש מהר יותר בחומרים בעלי מוליכות גבוהה22. לכן, רוב הזרם נספג בתמיסת האמבטיה, ואנו משערים שרק חלק קטן מהשדה החשמלי יכול להתפזר לשורשי העצבים.
לכן, בהתחשב ביתרונות ובחסרונות של גירוי in vivo וגירוי חוץ גופי , ניתן להסיק כי מהדק טלאי במבחנה היא שיטה מועילה לחקר האופי הסינפטי ו / או ההשפעות הסלולריות של SCS במכרסמים בילודים.
בפרקטיקה הקלינית, האלקטרודה אינה מכווצת ישירות את פני השטח של חוט השדרה או את שורש העצב23. במקום זאת, הוא מסתמך על קרינת השדה החשמלי הנוצרת על ידי האלקטרודה כדי להשפיע בעקיפין על פעילות העצבים1. מחקרים מרובים 1,23,24 אישרו כי המגע הקתודה של SCS צריך להיות ממוקם קרוב ככל האפשר לשורש הגבי או לאזור הכניסה (DREZ) כדי להשיג סלקטיביות אופטימלית לגירוי שריר מסוים. הגדלת המרחק בין האלקטרודה לשורש העצב תחליש את הספציפיות של הגירוי. לכן, אנו מניחים את הקתודה ישירות ליד DREZ במקום מגע ישיר עם שורש העצב או חוט השדרה.
הסיבים האפרנטיים של השורש הגבי מקרינים תחילה לנוירונים התחושתיים, ולאחר מכן לנוירונים הבין-עצביים ולנוירונים המוטוריים. מלבד מעגלי ההקרנה הרוחביים, ישנם גם מעגלים המקרינים לכיוון הקצה הרוסטרלי והקאודלי. לדוגמה, נוירונים מוטוריים המתאימים לשריר הקדמי טיביאליס ניתן למצוא במספר רמות25. לכן, למרות שהכנה אלכסונית עשויה לקטוע את מעגלי ההקרנה הרוחביים, היא עדיין תשמור על סיבים מקרינים שאינם רוחביים, ותאפשר לחקור את מעגלי החישה הקדם-מוטוריים. בנוסף להכנה אלכסונית ורוחבית, הכנה אורכית מציעה יתרונות ברורים לשימור טוב יותר של המעגלים מהשורש הגבי ועד לנוירונים המוטוריים ומאפשרת שימור יעיל של מעגלי חוט השדרה על פני מקטעים מרובים26, מה שמספק ייצוג קרוב יותר של התנאים הפיזיולוגיים האמיתיים.
על פי מחקר הסימולציה 6,27,28, SCS מפעיל בעיקר סיבי afferent פרופריוצפטיביים כדי לשחזר את תנועת הגפיים התחתונות, כולל סיבי afferent Ia, Ib ו- II. עם זאת, במחקר זה, איננו יכולים לאשר בביטחון אילו סוגים של סיבים הופעלו באופן ספציפי על ידי SCS. אנו משערים כי דפוס דומה עשוי להתקיים גם במהדק טלאי במבחנה. אנו נטפל בנושא זה על ידי ביצוע מודלים מתמטיים וסימולציה ושילובם בעבודתנו השוטפת.
לסיכום, פרוטוקול זה עשוי לסייע לחוקרים לשפר את כישוריהם האופרטיביים ולהבין את היסודות של שילוב הקלטות מהדק טלאי ו-SCS כדי לחקור את המנגנון החשמלי של SCS בקנה מידה של תא יחיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין לחוקרים צעירים (52207254 ו-82301657) והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2022M711833).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
