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Neuroscience

रीढ़ की हड्डी उत्तेजना के दौरान मोटर न्यूरॉन्स में पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए रीढ़ की हड्डी के टुकड़े की पूर्व विवो तैयारी

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65385
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,2
1National Engineering Research Center of Neuromodulation, School of Aerospace Engineering, Tsinghua University, 2IDG/McGovern Institute for Brain Research, Tsinghua University, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

Summary

यह प्रोटोकॉल उच्च स्थानिक संकल्प के साथ रीढ़ की हड्डी की उत्तेजना (एससीएस) के लिए मोटर न्यूरॉन्स की विद्युत प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए पैच-क्लैंप का उपयोग करके एक विधि का वर्णन करता है, जो शोधकर्ताओं को रीढ़ की हड्डी को अलग करने और सेल व्यवहार्यता को एक साथ बनाए रखने में अपने कौशल में सुधार करने में मदद कर सकता है।

Abstract

रीढ़ की हड्डी की उत्तेजना (एससीएस) रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) के बाद लोकोमोटर फ़ंक्शन को प्रभावी ढंग से बहाल कर सकती है। क्योंकि मोटर न्यूरॉन्स सेंसरिमोटर व्यवहार को निष्पादित करने के लिए अंतिम इकाई हैं, एससीएस के साथ मोटर न्यूरॉन्स की विद्युत प्रतिक्रियाओं का सीधे अध्ययन करने से हमें स्पाइनल मोटर मॉड्यूलेशन के अंतर्निहित तर्क को समझने में मदद मिल सकती है। एक साथ विविध उत्तेजना विशेषताओं और सेलुलर प्रतिक्रियाओं रिकॉर्ड करने के लिए, एक पैच-क्लैंप एकल-कोशिका पैमाने पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं का अध्ययन करने का एक अच्छा तरीका है। हालांकि, इस लक्ष्य को प्राप्त करने में अभी भी कुछ जटिल कठिनाइयां हैं, जिसमें सेल व्यवहार्यता बनाए रखना, रीढ़ की हड्डी को हड्डी की संरचना से जल्दी से अलग करना और कार्रवाई क्षमता को सफलतापूर्वक प्रेरित करने के लिए एससीएस का उपयोग करना शामिल है। यहां, हम उच्च स्थानिक संकल्प के साथ एससीएस को मोटर न्यूरॉन्स की विद्युत प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए पैच-क्लैंप का उपयोग करके एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो शोधकर्ता को रीढ़ की हड्डी को अलग करने और एक ही समय में सेल व्यवहार्यता बनाए रखने में अपने कौशल में सुधार करने में मदद कर सकता है ताकि मोटर न्यूरॉन पर एससीएस के विद्युत तंत्र का सुचारू रूप से अध्ययन किया जा सके और अनावश्यक परीक्षण और गलती से बचा जा सके।

Introduction

रीढ़ की हड्डी की उत्तेजना (एससीएस) रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) के बाद लोकोमोटर फ़ंक्शन को प्रभावी ढंग से बहाल कर सकती है। एंड्रियास Rowald एट अल बताया कि SCS एक ही दिन के भीतर निचले अंग लोकोमोटर और ट्रंक समारोह सक्षम बनाताहै 1. लोकोमोटर रिकवरी के लिए SCS के जैविक तंत्र की खोज करना एक अधिक सटीक SCS रणनीति विकसित करने के लिए एक महत्वपूर्ण और ट्रेंडिंग अनुसंधान क्षेत्र है। उदाहरण के लिए, ग्रेगोइरे कोर्टिन की टीम ने प्रदर्शित किया कि रीढ़ की हड्डी में उत्तेजक Vsx2 इंटरन्यूरॉन और Hoxa10 न्यूरॉन्स SCS की प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण न्यूरॉन्स हैं, और एससीआई2 के बाद चूहे के चलने की क्षमता को बहाल करने के लिए सेल-विशिष्ट न्यूरोमॉड्यूलेशन संभव है। हालांकि, कुछ अध्ययन एकल-कोशिका पैमाने पर एससीएस के विद्युत तंत्र पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि सुपरथ्रेशोल्ड प्रत्यक्ष वर्तमान उत्तेजना क्लासिक स्क्वीड प्रयोग 3,4,5 में एक्शन पोटेंशिअल (एपी) को कैसे प्राप्त कर सकती है, एससीएस जैसे स्पंदित वैकल्पिक विद्युत उत्तेजना, मोटर सिग्नल पीढ़ी को कैसे प्रभावित करती है, अभी भी स्पष्ट नहीं है।

इंट्रास्पाइनल तंत्रिका सर्किट की जटिलता को देखते हुए, एससीएस के विद्युत तंत्र की जांच के लिए सेल आबादी के लिए उपयुक्त चयन महत्वपूर्ण है। हालांकि SCS प्रोप्रियोसेप्टिव पाथवे6 को सक्रिय करके मोटर फ़ंक्शन को पुनर्स्थापित करता है, मोटर न्यूरॉन्स मोटर कमांड को निष्पादित करने के लिए अंतिम इकाई है, जो प्रोप्रियोसेप्शन सूचना अभिवाही इनपुट7 को एकीकृत करने से प्राप्त होता है। इसलिए, एससीएस के साथ मोटर न्यूरॉन्स की विद्युत विशेषताओं का सीधे अध्ययन करने से हमें स्पाइनल मोटर मॉड्यूलेशन के अंतर्निहित तर्क को समझने में मदद मिल सकती है।

जैसा कि हम जानते हैं, पैच-क्लैंप अत्यंत उच्च spatiotemporal संकल्प8 के साथ सेलुलर electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए सुनहरा मानक विधि है. इसलिए, यह अध्ययन एससीएस को मोटर न्यूरॉन्स की विद्युत प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए पैच क्लैंप का उपयोग करके एक विधि का वर्णन करता है। मस्तिष्क पैच-क्लैंप9 की तुलना में, रीढ़ की हड्डी पैच-क्लैंप निम्नलिखित कारणों से अधिक कठिन है: (1) रीढ़ की हड्डी को कशेरुक नहर द्वारा छोटी मात्रा के साथ संरक्षित किया जाता है, जिसके लिए बेहतर सेल व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए बहुत ठीक माइक्रोमैनिपुलेशन और कठोर बर्फ-ठंडा रखरखाव की आवश्यकता होती है। (2) क्योंकि रीढ़ की हड्डी काटने की ट्रे पर सुरक्षित होने के लिए बहुत पतली है, इसे कम पिघलने बिंदु अगारोज़ में डुबोया जाना चाहिए और जमने के बाद छंटनी चाहिए।

इसलिए, यह विधि रीढ़ की हड्डी को विदारक करने और एक ही समय में सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने में तकनीकी विवरण प्रदान करती है ताकि मोटर न्यूरॉन्स पर एससीएस के विद्युत तंत्र का सुचारू रूप से अध्ययन किया जा सके और अनावश्यक परीक्षणों और गलतियों से बचा जा सके।

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Protocol

संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति ने सभी पशु प्रयोगों को मंजूरी दे दी और अध्ययन प्रासंगिक पशु कल्याण नियमों के अनुसार आयोजित किए गए।

1. जानवरों की तैयारी

  1. जीवधारी
    1. आवास की जानकारी: एक विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त वातावरण में हाउस नर स्प्रैग-डॉली चूहे (प्रसवोत्तर 10-14 दिन, P10-P14)।
      नोट: कमरे की स्थिति 20 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता: 50% -60%, 12-एच प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ बनाए रखी गई थी। जानवरों को भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच थी।
    2. मोटर न्यूरॉन्स को प्रतिगामी रूप से लेबल करें: बलिदान से 2 दिन पहले मोटर न्यूरॉन्स को प्रतिगामी रूप से लेबल करने के लिए द्विपक्षीय टिबियलिस पूर्वकाल और गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशी (बाँझ खारा में 2%, 50 माइक्रोन प्रति मांसपेशी) में फ्लोरो-गोल्ड (एफजी) इंजेक्ट करें।
  2. समाधान
    1. काटने समाधान तैयार: मिश्रण 120 मिमी Choline क्लोराइड, 2.6 मिमी KCl, 26 मिमी NaHCO 3, 1.25 मिमी NaH 2 पीओ4, 0.5 मिमी CaCl 2, 7 मिमी MgCl2, 1.3 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड, 15 मिमी ग्लूकोज। विच्छेदन और टुकड़ा करने की क्रिया से पहले 30 मिनट के लिए 95% ओ 2 और 5% सीओ2 (केओएच के साथ पीएच 7.4 को समायोजित करें) के साथ समाधान को पूर्व-बुलबुला। कुचल बर्फ के साथ समाधान को ठंडा करें।
    2. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) तैयार करें: 126 एमएम एनएसीएल, 3 एमएम केसीएल, 1.2 एमएम एनएएच2पीओ4 मिलाएं; 1.3 एमएम एमजीसीएल2, 2.4 एमएम सीएसीएल2, 26 एमएम एनएएचसीओ3, और 10 एमएम ग्लूकोज। इनक्यूबेशन से पहले 30 मिनट के लिए 95% ओ 2 और 5% सीओ2 के साथ समाधान को पूर्व-बुलबुला करें।
    3. इंट्रासेल्युलर समाधान तैयार करें: 126 एमएम के-ग्लूकोनेट, 2 एमएम केसीएल, 2 एमएम एमजीसीएल 2, 0.2 एमएम ईजीटीए, 10 एमएम एचईपीईएस,2 एटीपी, 0.4 एमएम एनए2 जीटीपी, 10 एमएम के-फॉस्फोस्रीटिन, और 0.5% न्यूरोबायोटिन (पीएच 7.25 और 305 एमओएसएम/किलो) मिलाएं। कुचल बर्फ के साथ समाधान को ठंडा करें।
    4. कम पिघलने वाले अगारोज जेल तैयार करें: काटने के समाधान के 100 एमएल में 4 ग्राम एगरोज को भंग करें, और इसे पूरी तरह से भंग करने के लिए एक चुंबकीय सरगर्मी रोटर का उपयोग करें। एम्बेडिंग से पहले 30 मिनट में, 1 मिनट के लिए उच्च शक्ति के साथ माइक्रोवेव ओवन में कम पिघलने बिंदु agarose गर्मी, और फिर तरल राज्य को बनाए रखने के लिए एक 39 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में हस्तांतरण.
  3. साधन तैयार करना
    1. छिड़काव ट्रे (पूरक चित्रा 1 ए) पर छिड़काव से पहले 10 मिनट पर कुचल बर्फ रखें। शारीरिक ट्रे (पूरक चित्रा 1 बी) और काटने ट्रे (पूरक चित्रा 1 सी) को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर पानी के बैंड के साथ रखें।
    2. पहले से रात भर 45 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में नायलॉन जाल के साथ इनक्यूबेशन कक्ष रखें.
    3. एक 35 डिग्री ढलान और एक 2 मिमी मोटी मंच (अनुपूरक चित्रा 1 डी) पूर्वनिर्मित करने के लिए कम पिघलने बिंदु agarose का प्रयोग करें. जेल जमने के बाद, उन्हें अगली आने वाली प्रक्रियाओं में रीढ़ की हड्डी का समर्थन करने के लिए 35 मिमी पेट्री डिश के केंद्र में रखें।
  4. इंट्राकार्डियल परफ्यूजन
    1. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से 2.5% ट्राइब्रोमोइथेनॉल (160 μL/10 g) के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें। सुनिश्चित करें कि चूहों को बाहरी उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करके पूरी तरह से संवेदनाहारी किया जाता है, जैसे कि पैर की अंगुली की एक कोमल चुटकी।
    2. जब उचित संवेदनाहारी की पुष्टि की है, चूहों लापरवाह जगह और सिलिका जेल से भरा पेट्री पकवान में उन्हें स्थिरीकरण.
    3. xiphoid प्रक्रिया के लिए 5 मिमी अनुदैर्ध्य त्वचा चीरा caudally कटौती, तो पूरी तरह से चमड़े के नीचे अंतरिक्ष का विस्तार. बाहरी छाती की दीवार को पूरी तरह से बेनकाब करने के लिए उदर midline के साथ एक 2 सेमी अनुदैर्ध्य त्वचा चीरा कटौती, उपर्युक्त चीरा के साथ शुरू और छाती के शीर्ष के साथ समाप्त.
    4. xiphoid (पूरक चित्रा 2 ए) को उठाने के लिए दांतेदार चिमटी का उपयोग करें, और फिर डायाफ्राम को काटने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें। छाती को खोलने और दिल को बेनकाब करने के लिए xiphoid प्रक्रिया के दोनों किनारों के साथ उरोस्थि को काटें (पूरक चित्रा 2B)।
      नोट: दोनों तरफ आंतरिक वक्ष वाहिकाओं को संरक्षित करने के लिए सावधान रहें; अन्यथा, यह बड़े पैमाने पर रक्तस्राव का कारण बन सकता है।
    5. बाएं वेंट्रिकल को उठाने के लिए टूथलेस चिमटी का प्रयोग करें। बाएं वेंट्रिकल (अनुपूरक चित्रा 2 सी) के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ बाएं वेंट्रिकुलर शीर्ष में एक 22 जी सुई डालें। इस बीच, छिड़काव ट्यूब में लयबद्ध रक्त स्पंदन का निरीक्षण करें, या सुई सही वेंट्रिकल, जो एक गरीब छिड़काव प्रभाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं में पंचर कर सकते हैं.
      नोट: दांतेदार चिमटी का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए; अन्यथा यह चिमटी होल्डिंग साइट से अतिरिक्त रक्त रिसाव का कारण बन सकता है।
    6. सही आलिंद (पूरक चित्रा 2 सी) में कटौती करने के लिए ठीक कैंची का प्रयोग करें, तो मैन्युअल रूप से 1 मिनट के भीतर के बारे में 2 एमएल / एस की दर से बर्फ ठंडा perfusing तरल पदार्थ के 100 एमएल इंजेक्षन.
      नोट: जब चूहों के जिगर और पंजे पीले हो जाते हैं, और सही आलिंद से कोई रक्त नहीं निकलता है, तो अच्छा छिड़काव प्राप्त किया जा सकता है।
  5. रीढ़ की हड्डी विच्छेदन (चित्रा 1)
    1. प्रवण स्थिति में चूहे रखें, और पूर्वकाल बेहतर इलियाक रीढ़ (एल 4 कशेरुक स्तर के बारे में) और वक्ष स्तंभ (टी 6 कशेरुक स्तर के बारे में) की वक्रता स्थानांतरण बिंदु पर रीढ़ में कटौती, क्रमशः (चित्रा 1 ए)। फिर, अवशिष्ट रक्त और वसा ऊतक को धोने के लिए तुरंत ऑक्सीजन युक्त बर्फ-ठंडे छिद्रण समाधान में पृथक रीढ़ रखें; यह प्रक्रिया बाद की प्रक्रियाओं में ऑपरेटिव क्षेत्र को साफ रखने के लिए फायदेमंद है।
      नोट: पैरास्पाइनल मांसपेशियों को आरक्षित किया जाना चाहिए, जो एक कीट पिन का उपयोग करके रीढ़ के बाद के निर्धारण के लिए अनुकूल है।
    2. तुरंत पृष्ठीय पक्ष के साथ शारीरिक ट्रे (चित्रा 1 बी) के लिए पृथक रीढ़ हस्तांतरण और ऑपरेटर के करीब रोस्ट्रल अंत. लगातार ऑक्सीजन युक्त बर्फ-ठंड काटने के समाधान (चित्रा 1 बी) के 50 एमएल के साथ शारीरिक ट्रे भरें।
    3. पैरास्पाइनल मांसपेशियों (चित्रा 1 बी) में प्रवेश करके रीढ़ को ठीक करने के लिए चार कीट पिन का उपयोग करें।
    4. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, माइक्रो-कैंची के साथ रोस्ट्रल अंत से दोनों पक्षों के कशेरुक पेडिकल्स को काट लें, जिसे "लैमिनेक्टॉमी" (चित्रा 1सी) कहा जा सकता है। ध्यान दें कि रीढ़ की हड्डी को नुकसान न पहुंचे। इस बीच, कटे हुए कशेरुक शरीर को उठाने के लिए सूक्ष्म दांतेदार चिमटी का उपयोग करें।
    5. लैमिनेक्टॉमी के बाद, रीढ़ की हड्डी को रीढ़ की हड्डी से तुरंत अलग न करें। इसके बजाय, पृष्ठीय मिडलाइन के साथ ड्यूरा मेटर को काटने के लिए एक माइक्रो-कैंची का उपयोग करें, जो कोशिकाओं और ऑक्सीजन युक्त एसीएसएफ(चित्रा 1डी)के बीच पोषक तत्वों के तेज के लिए अनुकूल है।
      नोट: ड्यूरा मेटर को कभी न फाड़ें। केवल माइक्रो-कैंची द्वारा ड्यूरा मेटर काटने की अनुमति है; अन्यथा, तंत्रिका जड़ और रीढ़ की हड्डी पैरेन्काइमा गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त हो जाएगा!
    6. रीढ़ की हड्डी के रोस्ट्रल भाग को उठाएं, फिर ध्यान से लगभग 1 मिमी आरक्षित(चित्रा 1ई)के साथ तंत्रिका जड़ को काट लें। कशेरुक नहर से रीढ़ की हड्डी को अलग करने के बाद, उदर पक्ष (चित्रा 1 एफ) के साथ रीढ़ की हड्डी को ठीक करने के लिए 2 कीट पिन का उपयोग करें।
    7. उदर midline (चित्रा 1F) के साथ ड्यूरा मेटर में कटौती करने के लिए एक सूक्ष्म कैंची का प्रयोग करें. लगभग 1 मिमी आरक्षित के साथ अनावश्यक तंत्रिका जड़ों को काट लें।
      नोट: तंत्रिका रीढ़ की हड्डी की तुलना में बहुत अधिक दृढ़ है। यदि आरक्षित तंत्रिका जड़ बहुत लंबी (>1 मिमी) है, तो वाइब्रेटोम तंत्रिका जड़ को काट नहीं सकता है, जिससे रीढ़ की हड्डी में गंभीर आंसू हो सकता है।
    8. काठ का इज़ाफ़ा को 6-7 मिमी(चित्रा 1जी)की लंबाई में अलग करने के लिए एक माइक्रो-कैंची का उपयोग करें।
  6. कम पिघलने वाले अगारोज में एम्बेडिंग
    1. पृष्ठीय पक्ष ऊपर और दुम अंत नीचे के साथ 35 ° ढलान (चित्रा 1H) पर काठ का इज़ाफ़ा रखें. ऊतक की सतह पर प्रचुर मात्रा में पानी निकालने के लिए एक शोषक फिल्टर पेपर का उपयोग करें (चित्र 1H)।
    2. धीरे-धीरे पिघला हुआ agarose जेल काठ का इज़ाफ़ा (चित्रा 1I) युक्त पेट्री डिश में डालना.
      नोट: बहुत तेजी से डालना मत करो, या बुलबुले जेल में जमा हो जाएगा.
    3. जितनी जल्दी हो सके जेल को ठंडा करने के लिए बर्फ-पानी के मिश्रण में उपरोक्त पेट्री डिश रखें, जो कोशिकाओं की गतिविधि को बनाए रखने के लिए अनुकूल है।
    4. जेल को 15 मिमी x 10 मिमी x 10 मिमी घन में ट्रिम करें और इसे सुपरग्लू (चित्रा 1J) के साथ नमूना डिस्क पर माउंट करें।
  7. टुकड़ा करने की क्रिया
    1. नमूना डिस्क को पूर्व-जमे हुए काटने की ट्रे में रखें, फिर बर्फ-ठंडा काटने का समाधान (चित्र 1K) डालें। कटिंग ट्रे में 95% CO 2 और 5% O2 के साथ लगातार बुलबुला।
    2. वाइब्रेटोम पैरामीटर सेट करें: मोटाई: 350 माइक्रोन; गति: 0.14-0.16 मिमी/सेकंड, आयाम: 1.0 मिमी, और कंपन आवृत्ति: 85 हर्ट्ज।
    3. प्रति जानवर 2-3 उपयुक्त स्लाइस की कटाई करें। प्रति टुकड़ा 1-2 स्वस्थ एफजी + मोटर न्यूरॉन्स रिकॉर्ड करें, प्रति जानवर 5-6 कोशिकाओं की एक सीमा के साथ।
  8. अंडे सेना
    1. एक टुकड़ा (चित्रा 1L) क्लिप करने के लिए कवर स्लाइड चिमटी का उपयोग करें और इसे लगातार ऑक्सीजन युक्त एसीएसएफ से भरे इनक्यूबेशन कक्ष में रखें। 30 मिनट के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में इनक्यूबेशन कक्ष रखें, और फिर रिकॉर्डिंग से पहले एक और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इसे सेते जारी रखें.
      नोट: उपरोक्त प्रक्रियाओं, संज्ञाहरण से पहले टुकड़ा प्राप्त करने के लिए, जितना संभव हो कोशिकाओं की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए 20-30 मिनट के भीतर पूरा किया जाना चाहिए. प्रत्येक टुकड़ा में मोटर न्यूरॉन्स लगभग 6-7 घंटे के लिए अपनी व्यवहार्यता बनाए रख सकते हैं।

2. SCS के साथ पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग (चित्र 2)

  1. तैयारी
    1. के बारे में 1-2 एमएल / मिनट की दर से लगातार बुलबुले एसीएसएफ के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष छिड़कना. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप पर नियंत्रण कक्ष के माध्यम से व्यक्तिगत रूप से प्रवाह दर समायोजित करें.
    2. रिकॉर्डिंग कक्ष में एक टुकड़ा रखें. जगह में स्लाइस को मजबूती से स्थिर करने के लिए नायलॉन धागे के साथ यू-आकार के प्लैटिनम तार का उपयोग करें।
    3. टुकड़ा का निरीक्षण करने के लिए एक अवरक्त अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोप (आईआर-डीआईसी) का प्रयोग करें. 4x उद्देश्य लेंस के तहत, पुष्टि करें कि पृष्ठीय जड़ की लंबाई लगभग 1 मिमी है। उस क्षेत्र का पता लगाएं जहां पृष्ठीय जड़ पैरेन्काइमा में प्रवेश करती है, फिर दृष्टि के केंद्रीय क्षेत्र को इस क्षेत्र में ले जाएं।
    4. कस्टम बनाया इलेक्ट्रोड(चित्रा 2A)के साथ पल्स जनरेटर कनेक्ट करें.
  2. SCS कॉन्फ़िगरेशन
    1. माइक्रोमैनिपुलेशन सिस्टम(चित्रा 2बी)के माध्यम से पृष्ठीय मिडलाइन के पास एससीएस के एनोड रखें।
    2. माइक्रोमैनिपुलेशन सिस्टम(चित्रा 2बी)के माध्यम से पृष्ठीय रूट एंट्री जोन (डीआरईजेड) के पास एससीएस के कैथोड रखें।
  3. सेल लक्ष्यीकरण और इमेजिंग
    1. 10x उद्देश्य लेंस के साथ आईआर-डीआईसी का उपयोग मोटे तौर पर मोटर कॉलम के पृष्ठीय क्षेत्र को ढूंढें, जहां अधिकांश मोटर न्यूरॉन्स स्थित हैं। फिर, दृष्टि के केंद्रीय क्षेत्र को इस क्षेत्र में ले जाएं।
    2. एक चिकनी और उज्ज्वल सतह और अदृश्य नाभिक(चित्रा 2सी,एफ)के साथ एक स्वस्थ न्यूरॉन खोजने के लिए एक 60x उद्देश्य लेंस पर स्विच करें।
    3. थोड़ा आईआर तीव्रता नीचे बारी और प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत पर बारी. एक उपयुक्त एफजी पॉजिटिव (एफजी +) मोटर न्यूरॉन(चित्रा 2ई,एच)का चयन करने के लिए विस्तृत बैंड पराबैंगनी उत्तेजना फिल्टर(चित्रा 2डी,जी)के लिए प्रकाश फिल्टर स्विच करें।
    4. पृष्ठीय जड़ के लिए 1x मोटर दहलीज उत्तेजना लागू करने के लिए चूषण इलेक्ट्रोड का प्रयोग करें. यदि मोटर न्यूरॉन्स (पूरक चित्रा 3) में एक विकसित कार्रवाई क्षमता का पता चला है, तो यह पुष्टि करता है कि पृष्ठीय जड़ की गतिविधि बरकरार है। यदि नहीं, तो इस स्लाइस को त्याग दिया जाना चाहिए।
  4. पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग
    1. इंट्रासेल्युलर समाधान के साथ माइक्रोपिपेट भरें और इसे इलेक्ट्रोड धारक में डालें। एसीएसएफ स्नान में विंदुक को कम करने के लिए माइक्रोमैनिपुलेशन सिस्टम का उपयोग करें। पिपेट प्रतिरोध 5-8 MΩ से होता है।
    2. धूल और सेल मलबे को उड़ाने के लिए विंदुक पर सकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि लागू करें।
      1. सेल दृष्टिकोण करने के लिए इलेक्ट्रोड कम करें। जब विंदुक एफजी + न्यूरॉन की सतह को छूता है, झिल्ली का एक छोटा सा इंडेंटेशन टिप के स्तर पर दिखाई देता है। सकारात्मक दबाव छोड़ें।
      2. फिर, एक सिरिंज का उपयोग विंदुक के लिए नकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि लागू होते हैं. यह चूषण की एक छोटी मात्रा बनाता है जो कोशिका झिल्ली को कांच के विंदुक के संपर्क में खींचता है। सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस पर कुल प्रतिरोध पर हमेशा ध्यान दें जब तक कि प्रतिरोध मान गीगाओम (>1 GΩ) तक न बढ़ जाए। फिर, गीगासील बनता है।
    3. झिल्ली क्षमता को -70 एमवी पर क्लैंप करें, फिर एम्पलीफायर के सॉफ्टवेयर इंटरफेस पर फास्ट कैपेसिटेंस कंपंसेशन बटन दबाएं। धीरे कोशिका झिल्ली को तोड़ने के लिए क्षणिक नकारात्मक दबाव लागू करें, फिर एम्पलीफायर के सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस पर धीमी गति से समाई मुआवजा बटन दबाएं। इस बिंदु पर, एक अच्छा पूरे सेल विन्यास प्राप्त किया है.
    4. सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस पर IC बटन पर क्लिक करके वर्तमान-क्लैंप मोड पर स्विच करें, और आराम करने वाली झिल्ली क्षमता (RMP) रिकॉर्ड करें।
    5. 1-2 mA के आयाम के साथ 1-10 s के लिए SCS लागू करें, जबकि पल्स चौड़ाई और आवृत्ति क्रमशः 210 μs और 40 Hz पर तय की जाती है। पहले एपी मनाया जाता है जब तक धीरे-धीरे उत्तेजना आयाम में वृद्धि से मोटर दहलीज का निर्धारण.
    6. वर्तमान-क्लैंप मोड10,11,12 में रियोबेस के आसपास 5 एस विध्रुवण वर्तमान इंजेक्शन का उपयोग करके विलंबित और तत्काल फायरिंग मोटर न्यूरॉन्स को अलग करें। तत्काल फायरिंग मोटर न्यूरॉन्स: कम रिओबेस स्थिर फायरिंग आवृत्ति के साथ तत्काल और दोहराव वाली फायरिंग को प्रेरित कर सकता है; विलंबित फायरिंग मोटर न्यूरॉन्स: उच्च रिओबेस एक त्वरित फायरिंग दर(चित्रा 3)के साथ दोहराव वाली फायरिंग के लिए विलंबित शुरुआत को प्रेरित कर सकता है।
    7. जब SCS बंद कर दिया है, सहज APs फायरिंग पर कब्जा करने के लिए झिल्ली क्षमता रिकॉर्ड करने के लिए जारी है.
    8. भोल्युमtage-clamp रिकॉर्डिंग प्रदर्शन भोल्युमtage-clamp उत्तेजक postsynaptic वर्तमान (EPSC) के लिए रिकॉर्डिंग जब SCS पर और बंद है. उत्तेजना पैरामीटर 1x मोटर थ्रेसहोल्ड, 210 μs, 2 हर्ट्ज है।

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Representative Results

ठीक ऑपरेशन (पूरक चित्रा 1, पूरक चित्रा 2, और चित्रा 1) के दौरान कठोर कम तापमान रखरखाव के लिए धन्यवाद, सेल व्यवहार्यता बाद में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग करने के लिए पर्याप्त थी। जितना संभव हो नैदानिक परिदृश्य अनुकरण करने के लिए, हमने क्रमशः पृष्ठीय मिडलाइन और डीआरईजेड के पास एससीएस कैथोड और एनोड रखने के लिए माइक्रोमैनिपुलेशन का उपयोग किया(चित्रा 2), जो मोटर कॉलम के पृष्ठीय क्षेत्र में मोटर न्यूरॉन्स को फैलाने के लिए पृष्ठीय सींग में तंत्रिका संकेत शुरू कर सकता है। इस अध्ययन में, हमने 20-50 माइक्रोन के व्यास के साथ मोटर न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए एफजी का उपयोग किया। जैसा कि चित्र 2 डी, जी में दिखाया गया है, हमने आत्मविश्वास से एक मोटर न्यूरॉन-स्पाइनल सर्किट के टर्मिनल के रूप में एक स्वस्थ एफजी + न्यूरॉन की पुष्टि की। इस लेबलिंग विधि ने अध्ययन करने का मार्ग प्रशस्त किया कि एससीएस फायरिंग पैटर्न को कैसे प्रभावित करता है। विलंबित और तत्काल फायरिंग मोटर न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुण पूरक तालिका 1 और पूरक तालिका 2में सूचीबद्ध हैं। सक्रिय और निष्क्रिय गुणों की गणना के लिए विधियाँ पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान की गई हैं।

जब SCS रीढ़ की हड्डी के टुकड़ा करने के लिए एक स्पंदित वैकल्पिक विद्युत क्षेत्र दिया, हम पहली बार झिल्ली क्षमता (चित्रा 4) की प्रतिक्रिया रिकॉर्ड करने के लिए वर्तमान-दबाना मोड का इस्तेमाल किया. जैसा कि हमने धीरे-धीरे 1/3 मोटर थ्रेसहोल्ड(चित्रा 4बी,सी)के एक चरण के साथ उत्तेजना आयाम बढ़ाया, झिल्ली क्षमता भी इसके साथ बढ़ी, लेकिन केवल 1x मोटर थ्रेशोल्ड एपीएस(चित्रा 4डी)को प्राप्त कर सकता है। चित्रा 4 डी से पता चलता है कि लगभग हर 10-20 दालों एक एपी को प्राप्त कर सकते हैं, जो इंगित करता है कि एससीएस आयाम के लिए एक निश्चित एपी प्रतिक्रिया नियमितता मौजूद हो सकती है।

एससीएस बंद होने के बाद, हमने झिल्ली क्षमता रिकॉर्ड करना जारी रखा। चित्रा 5 से पता चला है कि झिल्ली क्षमता थोड़ा -60 एमवी तक बढ़ गई, और न्यूरॉन ने सहज एपी की एक श्रृंखला निकाल दी। ये सहज एपी थोड़े समय (30-40 एस) के लिए रहते हैं, फिर झिल्ली क्षमता -65 एमवी पर लौट आती है, यह दर्शाता है कि एससीएस अस्थायी रूप से सेल उत्तेजना को बढ़ा सकता है।

फिर, हमने ईपीएससी के लिए वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग का इस्तेमाल किया जब एससीएस चालू और बंद था (चित्रा 6)। प्रत्येक एससीएस पल्स के बाद, एक विकसित ईपीएससी का पता लगाया जा सकता है। उत्तेजना विरूपण साक्ष्य और ईपीएससी के बीच विलंबता 2.64 ± 0.38 एमएस (अनुपूरक चित्रा 4) थी। विकसित ईपीएससी का आयाम 35.14 ± 12.73 पीए (अनुपूरक चित्र 4) था। विकसित EPSCs की आवृत्ति SCS आवृत्ति के अनुरूप है। निष्क्रिय चार्ज संतुलन घटाने के बाद, विकसित ईपीएससी को 1x मोटर थ्रेशोल्ड उत्तेजना (पूरक चित्रा 5 ए) के बाद एक व्यवहार्य मोटर न्यूरॉन में देखा जा सकता है। उत्तेजना ध्रुवीयता एक ही सेल में 2 घंटे के लिए छिड़काव को रोकने के बाद उलट गया था. उत्तेजना ने किसी भी ईपीएससी को प्रेरित नहीं किया, यह पुष्टि करते हुए कि विकसित ईपीएससी एक विरूपण साक्ष्य (अनुपूरक चित्रा 5 बी) नहीं था।

Figure 1
चित्रा 1: रीढ़ की हड्डी विच्छेदन और टुकड़ा करने की क्रिया। (ए) पूर्वकाल बेहतर इलियाक रीढ़ (एल 4 कशेरुक स्तर के बारे में) और वक्ष स्तंभ (टी 6 कशेरुक स्तर के बारे में) के वक्रता स्थानांतरण बिंदु पर रीढ़ को काटें, क्रमशः। (बी) तुरंत पृष्ठीय पक्ष के साथ शारीरिक ट्रे के लिए पृथक रीढ़ हस्तांतरण और ऑपरेटर के करीब रोस्ट्रल अंत. लगातार ऑक्सीजन युक्त बर्फ-ठंड काटने के समाधान के साथ शारीरिक ट्रे भरें। (सी) रोस्ट्रल अंत से दोनों तरफ लैमिनेक्टॉमी करें। (डी) पृष्ठीय ड्यूरा मेटर को काटें, जो कोशिकाओं और ऑक्सीजन युक्त कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) के बीच पोषक तत्वों के तेज के लिए अनुकूल है। (ई) तंत्रिका जड़ को सावधानी से काटें। (एफ) उदर ड्यूरा मेटर को काटें। (जी) काठ का इज़ाफ़ा 6-7 मिमी की लंबाई के लिए अलग (एच) पृष्ठीय पक्ष ऊपर और दुम अंत नीचे के साथ 35 ° ढलान पर काठ का इज़ाफ़ा रखें. ऊतक की सतह पर प्रचुर मात्रा में पानी निकालने के लिए एक शोषक फिल्टर पेपर का उपयोग करें। (I) धीरे-धीरे पिघला हुआ agarose जेल पेट्री डिश में डालना. (जे) जेल को एक घन में ट्रिम करें और इसे सुपर गोंद के साथ नमूना डिस्क पर माउंट करें। (के) नमूना डिस्क को कटिंग ट्रे में रखें, फिर बर्फ-ठंडा काटने का घोल डालें। (एल) काठ का इज़ाफ़ा पर रीढ़ की हड्डी के टुकड़े का एक उदाहरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: रीढ़ की हड्डी उत्तेजना (एससीएस) विन्यास और मोटर न्यूरॉन इमेजिंग। (ए) कस्टम-निर्मित इलेक्ट्रोड के साथ पल्स जनरेटर अलग से आयाम, पल्स चौड़ाई और आवृत्ति को समायोजित कर सकता है। इनलेट ने दिखाया कि इलेक्ट्रोड संपर्क का आयामी विनिर्देश 800 माइक्रोन x 500 माइक्रोन x 300 माइक्रोन है। (बी) क्रमशः माइक्रोमैनिपुलेशन सिस्टम के माध्यम से पृष्ठीय मिडलाइन और पृष्ठीय रूट एंट्री जोन (डीआरईजेड) के पास एनोड और कैथोड रखें। फ्लोरो-गोल्ड पॉजिटिव (एफजी +) मोटर न्यूरॉन्स को दबाना करने के लिए मोटर कॉलम के पृष्ठीय क्षेत्र में रिकॉर्डिंग विंदुक रखें। (सी)अवरक्त अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोप (आईआर-डीआईसी) इमेजिंग (60x) के साथ एक स्वस्थ तत्काल फायरिंग मोटर न्यूरॉन। (डी) केवल प्रतिदीप्ति इमेजिंग (60x) के साथ एक ही न्यूरॉन, चमकते फ्लोरो-गोल्ड (एफजी) कणों का प्रतिनिधित्व करते हैं कि यह न्यूरॉन एक मोटर न्यूरॉन है। (ङ) एफजी + मोटर न्यूरॉन में आईआर-डीआईसी और प्रतिदीप्ति की मर्ज की गई छवि। (एफ-एच) आईआर-डीआईसी इमेजिंग (60x) के साथ एक स्वस्थ विलंबित फायरिंग मोटर न्यूरॉन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक 5 एस depolarizing वर्तमान इंजेक्शन का उपयोग कर देरी और तत्काल फायरिंग मोटर न्यूरॉन्स भेद. (ए) तत्काल फायरिंग मोटर न्यूरॉन्स: कम रिओबेस स्थिर फायरिंग आवृत्ति के साथ तत्काल और दोहराव वाली फायरिंग को प्रेरित कर सकता है; (बी) विलंबित फायरिंग मोटर न्यूरॉन्स: उच्च रिओबेस एक त्वरित फायरिंग दर के साथ दोहराए जाने वाले फायरिंग के लिए देरी से शुरुआत को प्रेरित कर सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: रीढ़ की हड्डी उत्तेजना (एससीएस) ने मोटर न्यूरॉन्स में कार्रवाई क्षमता (एपी) फायरिंग प्राप्त की। (ए) जब कोई उत्तेजना लागू नहीं की गई थी, तो आराम झिल्ली क्षमता (आरएमपी) -65 एमवी थी। (बी) 1/3x मोटर थ्रेशोल्ड उत्तेजना एपी को प्राप्त नहीं कर सकती है। (सी) 2/3x मोटर थ्रेशोल्ड उत्तेजना एपी को प्राप्त नहीं कर सकती है। (डी) 1x मोटर थ्रेशोल्ड उत्तेजना एपी को प्राप्त कर सकती है, और प्रत्येक 10-20 दालों एक एपी को प्राप्त कर सकती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: रीढ़ की हड्डी उत्तेजना (एससीएस) के बाद सहज कार्रवाई क्षमता (एपी) फायरिंग। एससीएस बंद होने के बाद, न्यूरॉन ने थोड़े समय (30-40 एस) के लिए सहज एपी की एक श्रृंखला को निकाल दिया, फिर आराम झिल्ली क्षमता (आरएमपी) -65 एमवी पर लौट आई। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: रीढ़ की हड्डी उत्तेजना (एससीएस) पैरामीटर का चित्रण और उत्तेजक पोस्टसिनेप्टिक वर्तमान (ईपीएससी) पैदा किया। (ए) एससीएस पैरामीटर का चित्रण; (बी, सी) एक एकल उत्तेजना नाड़ी (1x मोटर थ्रेशोल्ड उत्तेजना) के बाद, विकसित ईपीएससी को देखा जा सकता है; (डी) निष्क्रिय चार्ज संतुलन घटाने के बाद, ईपीएससी की विलंबता और आयाम की गणना की जा सकती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: साधन तैयारी. (ए) छिड़काव ट्रे: छिड़काव से पहले 10 मिनट पर, सिलिका जेल से भरा 10 सेमी पेट्री डिश पर कुचल बर्फ रखें। (बी) शारीरिक ट्रे: बलिदान से पहले रात में, -80 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में सिलिका जेल से भरा स्व-निर्मित शारीरिक ट्रे रखें। (सी) काटने की ट्रे: बलिदान से पहले रात में, -80 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में पानी के बैंड के साथ काटने की ट्रे रखें। (डी)Agarose कास्टिंग ढलान: छिड़काव से पहले 30 मिनट पर, एक 35 मिमी पेट्री डिश के केंद्र में आधार प्लेटों के साथ एक 35 डिग्री agarose ढलान जगह. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: इंट्राकार्डियल छिड़काव। (ए) xiphoid प्रक्रिया लिफ्ट. (बी) छाती को खोलने और दिल को बेनकाब करने के लिए xiphoid प्रक्रिया के दोनों किनारों के साथ उरोस्थि को काटें। आंतरिक वक्ष वाहिकाओं को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें, या बड़े पैमाने पर रक्तस्राव पूरे ऑपरेटिंग क्षेत्र को भर देगा और ऑपरेटर को वेंट्रिकल एपेक्स या दाएं आलिंद की पहचान करने में बाधा उत्पन्न करेगा। (सी) छिड़काव के लिए बाएं वेंट्रिकल शीर्ष पर एक 22 जी सुई डालें और द्रव से बाहर निकलने के लिए दाएं आलिंद में कटौती. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 3: पृष्ठीय जड़ गतिविधि की पुष्टि. पृष्ठीय जड़ के लिए 1x मोटर दहलीज उत्तेजना लागू करने के लिए चूषण इलेक्ट्रोड का प्रयोग करें. यदि मोटर न्यूरॉन्स में एक विकसित क्रिया क्षमता का पता चला है, तो हम पुष्टि कर सकते हैं कि पृष्ठीय जड़ की गतिविधि बरकरार है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 4: एससीएस चालू होने पर विकसित ईपीएससी की विलंबता और आयाम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 5: विकसित ईपीएससी की वैधता का प्रदर्शन। (ए) निष्क्रिय चार्ज संतुलन घटाने के बाद 1x मोटर थ्रेशोल्ड उत्तेजना के बाद, विकसित ईपीएससी को एक व्यवहार्य मोटर न्यूरॉन में देखा जा सकता है; (बी) एक ही सेल में 2 घंटे के लिए छिड़काव को रोकने के बाद, उत्तेजना ध्रुवीयता उलट गई थी, 1x मोटर थ्रेशोल्ड उत्तेजना ने किसी भी ईपीएससी को प्रेरित नहीं किया, जिसने पुष्टि की कि विकसित ईपीएससी एक आर्टिफैक्ट नहीं था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: सक्रिय और निष्क्रिय गुणों की गणना के तरीके। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 1: मोटर न्यूरॉन्स के निष्क्रिय गुण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 2: मोटर न्यूरॉन्स के सक्रिय गुण कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

SCS द्वारा संग्राहक आंदोलन की जानकारी अंत में मोटर न्यूरॉन्स के लिए परिवर्तित है. इसलिए, अनुसंधान लक्ष्य के रूप में मोटर न्यूरॉन्स लेने से अध्ययन डिजाइन सरल हो सकता है और एससीएस के न्यूरोमॉड्यूलेशन तंत्र को अधिक सीधे प्रकट किया जा सकता है। एक साथ विविध उत्तेजना विशेषताओं और सेलुलर प्रतिक्रियाओं रिकॉर्ड करने के लिए, एक पैच-क्लैंप एकल-कोशिका पैमाने पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं का अध्ययन करने का एक अच्छा तरीका है। हालांकि, अभी भी कुछ कठिनाइयां हैं, जिनमें सेल व्यवहार्यता को कैसे बनाए रखा जाए, रीढ़ की हड्डी को बोनी संरचना से जल्दी से कैसे अलग किया जाए, और एपी को सफलतापूर्वक प्रेरित करने के लिए एससीएस का उपयोग कैसे किया जाए। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य शोधकर्ताओं को आवश्यक ऑपरेटिव कौशल को जल्दी से समझने में मदद करना है, कुछ संभावित नुकसान से बचना है, और जितनी जल्दी हो सके कार्यप्रणाली के बजाय अध्ययन डिजाइन पर ध्यान केंद्रित करना है।

अच्छा सेल व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए, किसी को हमेशा निम्नलिखित विवरणों पर ध्यान देना चाहिए: (1) रीढ़ की हड्डी को बर्फ-ठंडे तापमान पर रखना बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि कम तापमान कोशिका मृत्यु को रोक सकता है और चयापचय दर को धीमा कर सकता है, जो छिड़काव के दौरान यांत्रिक क्षति से न्यूरॉन की रक्षा कर सकता है, विच्छेदन, और टुकड़ा करने की क्रिया13; (2) माइक्रो-कैंची द्वारा ड्यूरा मेटर को नाजुक रूप से हटाने से आसपास के समाधानों से न्यूरोनल पोषक तत्व तेज हो सकते हैं। ड्यूरा मेटर को कभी भी सीधे न छीलें; अन्यथा, रीढ़ की हड्डी गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त हो जाएगी। इसके अलावा, यदि आप ड्यूरा मेटर को साफ़ करना भूल जाते हैं, तो बाद की टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया मुश्किल हो सकती है क्योंकि ब्लेड ड्यूरा मेटर को पूरी तरह से काट नहीं सकता है और फिर शेष रीढ़ की हड्डी को अगारोज से चीर सकता है, जिससे टुकड़ा करने की क्रिया की विफलता हो सकती है। (3) पारंपरिक अनुप्रस्थ टुकड़ा के साथ तुलना में, तिरछा स्लाइस ग्रे पदार्थ के क्षेत्र में वृद्धि, और आप एक टुकड़ा9 में अधिक FG + मोटर न्यूरॉन्स पा सकते हैं. (4) क्योंकि अकेले रीढ़ की हड्डी को मस्तिष्क की तरह नमूना डिस्क पर मजबूती से तय नहीं किया जा सकता है, इसे अगारोज जेल में एम्बेड करना सेल व्यवहार्यता को कम किए बिना इस समस्या को हल करने में प्रभावी है। हम पारंपरिक agarose (जेल बिंदु 38-43 डिग्री सेल्सियस) के बजाय कम पिघलने agarose (जेल बिंदु 26-30 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करने की सिफारिश, क्योंकि उच्च तापमान सेल व्यवहार्यता को नुकसान पहुंचा सकता है. (5) हम अनुशंसा करते हैं कि यू-आकार के प्लैटिनम तार के दो नायलॉन धागे के बीच की दूरी 1 से 1.5 मिमी होनी चाहिए क्योंकि ढीले धागे रीढ़ की हड्डी को मजबूती से स्थिर नहीं कर सकते हैं, और घने धागे सेल को स्क्वैश कर सकते हैं।

पारंपरिक उत्तेजना उपकरणों के साथ तुलना में, इस तरह के द्विध्रुवी हुक इलेक्ट्रोड व्यापक रूप से बुनियादी अनुसंधान में इस्तेमाल किया, इस अध्ययन में एससीएस इलेक्ट्रोड हमारे पिछले नैदानिक काम14 और बुनियादी अनुसंधान15 से ली गई है. SCS डिलीवरी ने वैकल्पिक विद्युत उत्तेजना को स्पंदित किया, जो विविध पैरामीटर समायोजन आयाम प्रदान करता है। इस एससीएस डिवाइस में ऊतक इलेक्ट्रोलिसिस से बचने के लिए एक चार्ज बैलेंस फ़ंक्शन भी है और यह सीधे तंत्रिका ऊतक से संपर्क नहीं करता है; इसलिए, इस एससीएस में विवो अनुप्रयोगों के लिए अच्छी सुरक्षा है।

एससीएस उपचार के बाद, मोटर न्यूरॉन्स के सहज एपी को निम्नलिखित कारणों से जिम्मेदार ठहराया जा सकता है: (1) एससीएस सेल बॉडी और न्यूरॉन्स के एक्सोनल कोलिकुलस में जमा होने के लिए चार्ज को प्रेरित करता है, जिससे आरएमपी16 की वृद्धि होती है। यह घटना इंगित करती है कि एससीएस न्यूरॉन की उत्तेजना में सुधार कर सकता है, जो एससीएस के बाद आयन चैनलों की चालकता के परिवर्तन से संबंधित हो सकता है, जैसे कि एनए वी 1.1 17, केवी 2.118, या सीएवी 2.3 19। (2) SCS मोटर न्यूरॉन्स के लिए proprioceptive प्रतिक्रिया की सुविधा के लिए पृष्ठीय GABAergic न्यूरॉन्स सक्रिय कर सकते हैं. हम सुझाव देते हैं कि संवेदी न्यूरॉन्स और मोटर न्यूरॉन्स के बीच तंत्रिका संचरण लगातार मौजूद हो सकता है, जिससे एससीएस के बाद मोटर न्यूरॉन्स में सहज एपी हो सकते हैं। सहज एपी सेंसरिमोटर व्यवहार20 को निष्पादित करने के लिए तत्परता की आंतरिक स्थिति बनाए रख सकते हैं। इसलिए, स्पाइनल न्यूरोलॉजिकल रोगों के उपचार के लिए सहज एपी को सक्रिय या बाधित करना फायदेमंद हो सकता है।

जैसा कि हम जानते हैं, विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग में विद्युत क्षेत्र के प्राकृतिक वितरण और इलेक्ट्रोड की नियुक्ति के तहत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रिया का पता लगाने के लिए बेहतर है। इसके अलावा, विवो मोटोन्यूरॉन रिकॉर्डिंग में मोटोन्यूरॉन पहचान की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। यह मांसपेशी फाइबर बल माप21 के साथ युग्मित मोटर अक्षतंतु की एंटीड्रोमिक पहचान के माध्यम से किया जा सकता है। लेकिन विवो रीढ़ की हड्डी रिकॉर्डिंग में निम्नलिखित कमियां भी हैं: (1) मोटर न्यूरॉन रीढ़ की हड्डी की पृष्ठीय सतह से 2-3 मिमी दूर है, यहां तक कि सबसे उन्नत दो-फोटॉन कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके, अवलोकन गहराई केवल 500-800 माइक्रोन है, इसलिए मौजूदा तरीकों का उपयोग करके विवो में उन्हें वैकल्पिक रूप से निरीक्षण करना मुश्किल है। इसलिए, अगर हम विवो में एक मोटर न्यूरॉन को बिल्कुल जकड़ना चाहते हैं, तो ग्लास पिपेट को अदृश्य मोटर न्यूरॉन तक पहुंचने के लिए पृष्ठीय स्तंभ से गुजरना होगा; इन विवो पैच-क्लैंप केवल "ब्लाइंड" फैशन में किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण अनिश्चितता और विफलता दर होती है। (2) इन विवो पैच-क्लैंप को छोड़कर, सिलिकॉन इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग वैकल्पिक विधि हो सकती है, जैसे यूटा सरणी या न्यूरोपिक्सल इलेक्ट्रोड। हालांकि, सिलिकॉन इलेक्ट्रोड द्वारा दर्ज किए गए सिग्नल एकल एक्शन पोटेंशिअल के बजाय ज्यादातर यौगिक एक्शन पोटेंशिअल होते हैं। यद्यपि एकल न्यूरॉन्स की गतिविधि को स्पाइक-सॉर्टिंग एल्गोरिदम का उपयोग करके हल किया गया है, फिर भी सॉर्टिंग एल्गोरिदम की सटीकता और विश्वसनीयता में सुधार की आवश्यकता है।

इन विवो रिकॉर्डिंग की तुलना में, इन विट्रो के खिलाफ इन विवो का सबसे बड़ा लाभ वोल्टेज क्लैंप का उपयोग है, जो SCS द्वारा सक्रिय synaptic रास्ते की एक अनूठी समझ की अनुमति देता है. इसके अलावा, यह लाइव इमेजिंग टूल के उपयोग की भी अनुमति देगा। हम अनुमान लगाते हैं कि SCS मोटर न्यूरॉन्स पर ऊपरी स्तर के न्यूरॉन्स से गाबा और ग्लूटामेट जैसे न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई को प्रेरित करता है, जिसके परिणामस्वरूप समग्र उत्तेजक ईपीएससी प्रतिक्रिया7. इसलिए, हमारे आगामी शोध में, हम आईपीएससी, मिनी ईपीएससी (एमईपीएससी) का पता लगाने और पूर्व-मोटर न्यूरॉन्स या इंटरन्यूरॉन्स से निरोधात्मक और उत्तेजक न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के पैटर्न को स्पष्ट करने के लिए एससीएस द्वारा प्रेरित ईपीएससी को शामिल करेंगे। हमने पूरी तरह से स्वीकार किया कि इन विट्रो उत्तेजना में भी कुछ सीमाएं हैं: (1) रीढ़ की हड्डी की लंबी दूरी की अनुदैर्ध्य सर्किटरी बाधित होती है, जिसके परिणामस्वरूप मोटर प्रांतस्था या निचले छोर से आने वाली जानकारी का नुकसान होता है; (2) इन विट्रो उत्तेजना के दौरान विद्युत क्षेत्रों का वितरण इन विवो उत्तेजना में उससे भिन्न हो सकता है। इस अध्ययन में, एपी के लिए सक्रियण सीमा (लगभग मिलीएम्पीयर में) विवो प्रयोग (लगभग माइक्रोएम्पीयर में)15की तुलना में बहुत अधिक थी; ऐसा इसलिए था क्योंकि रिकॉर्डिंग कक्ष में एसीएसएफ समाधान की मात्रा क्षमता प्राकृतिक अवस्था में मस्तिष्कमेरु द्रव की तुलना में बहुत अधिक थी, और गणितीय सिद्धांत का समर्थन करता है कि विद्युत क्षेत्र उच्च चालकता सामग्री22में तेजी से क्षीण होता है। इसलिए, अधिकांश वर्तमान स्नान समाधान द्वारा अवशोषित किया गया था, और हम अनुमान लगाते हैं कि विद्युत क्षेत्र का केवल एक छोटा सा हिस्सा तंत्रिका जड़ों तक फैल सकता है।

इसलिए, फायदे और विवो उत्तेजना में और इन विट्रो उत्तेजना के नुकसान पर विचार करते हुए, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि इन विट्रो पैच-क्लैंप नवजात कृन्तकों में SCS के synaptic प्रकृति और / या सेलुलर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक लाभप्रद तरीका है.

नैदानिक अभ्यास में, इलेक्ट्रोड सीधे रीढ़ की हड्डी या तंत्रिका जड़23 की सतह अनुबंध नहीं करता है. इसके बजाय, यह अप्रत्यक्ष रूप से नसों की गतिविधि को प्रभावित करने के लिए इलेक्ट्रोड द्वारा उत्पन्न विद्युत क्षेत्र विकिरण पर निर्भर करता है1. कई अध्ययनों 1,23,24 ने पुष्टि की है कि एससीएस के कैथोड संपर्क को एक विशिष्ट मांसपेशी को उत्तेजित करने के लिए इष्टतम चयनात्मकता प्राप्त करने के लिए पृष्ठीय जड़ या प्रवेश क्षेत्र (डीआरईजेड) के जितना संभव हो उतना करीब रखा जाना चाहिए। इलेक्ट्रोड और तंत्रिका जड़ के बीच की दूरी बढ़ाने से उत्तेजना की विशिष्टता कमजोर हो जाएगी। इसलिए, हम सीधे तंत्रिका जड़ या रीढ़ की हड्डी से संपर्क करने के बजाय ड्रेज़ के पास कैथोड रखते हैं।

पृष्ठीय जड़ के अभिवाही फाइबर पहले संवेदी न्यूरॉन्स के लिए परियोजना, फिर interneurons और मोटर न्यूरॉन्स के लिए. अनुप्रस्थ प्रोजेक्टिंग सर्किट के अलावा, ऐसे सर्किट भी हैं जो रोस्ट्रल और पुच्छल अंत की ओर प्रोजेक्ट करते हैं। उदाहरण के लिए, टिबिअलिस पूर्वकाल मांसपेशी के अनुरूप मोटर न्यूरॉन्स कई स्तरों25 पर पाया जा सकता है. इसलिए, हालांकि तिरछी तैयारी अनुप्रस्थ प्रोजेक्टिंग सर्किट को अलग कर सकती है, फिर भी यह गैर-अनुप्रस्थ प्रोजेक्टिंग फाइबर को संरक्षित करेगी, जिससे प्री-मोटर संवेदी सर्किटरी का अध्ययन हो सकेगा। तिरछी और अनुप्रस्थ तैयारी के अलावा, अनुदैर्ध्य तैयारी बेहतर मोटर न्यूरॉन्स के लिए पृष्ठीय जड़ से सर्किट को संरक्षित करने और वास्तविक शारीरिक स्थितियों का एक करीबी प्रतिनिधित्व प्रदान करता है, जो कई खंडों26 में रीढ़ की हड्डी सर्किट के प्रभावी प्रतिधारण को सक्षम करने के लिए अलग लाभ प्रदान करता है.

सिमुलेशन अनुसंधान 6,27,28 के अनुसार, SCS मुख्य रूप से Ia, Ib, और II अभिवाही फाइबर सहित निचले अंग आंदोलन को बहाल करने के लिए प्रोप्रियोसेप्टिव अभिवाही फाइबर को सक्रिय करता है। हालांकि, इस अध्ययन में, हम आत्मविश्वास से पुष्टि नहीं कर सकते हैं कि किस प्रकार के फाइबर विशेष रूप से एससीएस द्वारा सक्रिय किए गए थे। हम अनुमान लगाते हैं कि इन विट्रो पैच क्लैंप में एक समान पैटर्न भी मौजूद हो सकता है। हम गणितीय मॉडलिंग और सिमुलेशन आयोजित करके और इसे अपने चल रहे काम में शामिल करके इस मुद्दे को संबोधित करेंगे।

अंत में, इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को उनके ऑपरेटिव कौशल में सुधार और पैच दबाना रिकॉर्डिंग और SCS के संयोजन की अनिवार्यता समझ एक एकल सेल पैमाने पर SCS के विद्युत तंत्र की जांच करने में मदद कर सकते हैं.

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Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

इस अध्ययन को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना फॉर यंग स्कॉलर्स (52207254 और 82301657) और चाइना पोस्टडॉक्टोरल साइंस फंड (2022M711833) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Ascorbic Acid Sigma A4034
CaCl2·2H2O Sigma C5080
Choline Chloride Sigma C7527
Cover slide tweezers VETUS 36A-SA Clip a slice
D-Glucose Sigma G8270
EGTA Sigma E4378
Fine scissors RWD Life Science S12006-10 Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source Olympus  U-HGLGPS
Fluoro-Gold Fluorochrome Fluorochrome Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877
HEPES Sigma H3375
infrared CCD camera Dage-MTI IR-1000E
KCl Sigma P5405
K-gluconate Sigma P1847
Low melting point agarose Sigma A9414
MgSO4·7H2O Sigma M2773
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-200
Micropipette puller Sutter instrument P1000
Micro-scissors  Jinzhong wa1020 Laminectomy
Microscope for anatomy Olympus  SZX10
Microscope for ecletrophysiology Olympus  BX51WI
Micro-toothed tweezers RWD Life Science F11008-09 Lift the cut vertebral body
NaCl Sigma S5886
NaH2PO4 Sigma S8282
NaHCO3 Sigma V900182
Na-Phosphocreatine Sigma P7936
Objective lens for ecletrophysiology Olympus  LUMPLFLN60XW working distance 2 mm 
Osmometer  Advanced  FISKE 210
Patch-clamp amplifier  Axon  Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer Axon  Digidata 1550B
pH meter  Mettler Toledo  FE28
Slice Anchor Multichannel system SHD-27H
Spinal cord stimulatior PINS T901
Toothed tweezer RWD Life Science F13030-10 Lift the xiphoid
Vibratome Leica VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter Olympus  U-MF2

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References

  1. Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
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पूर्व विवो तैयारी रीढ़ की हड्डी का टुकड़ा पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग मोटर न्यूरॉन्स रीढ़ की हड्डी उत्तेजना लोकोमोटर फ़ंक्शन रीढ़ की हड्डी की चोट विद्युत प्रतिक्रियाएं सेंसरिमोटर व्यवहार उत्तेजना विशेषताएँ सेलुलर प्रतिक्रियाएं पैच-क्लैंप विधि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताएं सेल व्यवहार्यता रीढ़ की हड्डी पृथक्करण बोनी संरचना एक्शन पोटेंशियल प्रोटोकॉल स्पैटिओटेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन इलेक्ट्रिकल मैकेनिज्म
रीढ़ की हड्डी उत्तेजना के दौरान मोटर न्यूरॉन्स में पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए रीढ़ की हड्डी के टुकड़े की <em>पूर्व विवो</em> तैयारी
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Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L.… More

Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L. The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation. J. Vis. Exp. (199), e65385, doi:10.3791/65385 (2023).

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