Summary
이 프로토콜은 패치 클램프를 사용하여 높은 시공간 분해능으로 척수 자극(SCS)에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하는 방법을 설명하며, 이를 통해 연구자들은 척수를 분리하고 세포 생존력을 동시에 유지하는 기술을 향상시킬 수 있습니다.
Abstract
척수 자극술(SCS)은 척수 손상(SCI) 후 운동 기능을 효과적으로 회복할 수 있습니다. 운동 뉴런은 감각 운동 행동을 실행하는 최종 단위이기 때문에 SCS로 운동 뉴런의 전기 반응을 직접 연구하면 척추 운동 조절의 기본 논리를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다양한 자극 특성과 세포 반응을 동시에 기록하기 위해 패치 클램프는 단일 세포 규모에서 전기생리학적 특성을 연구하는 좋은 방법입니다. 그러나 이 목표를 달성하는 데에는 세포 생존력 유지, 뼈 구조에서 척수를 빠르게 분리, SCS를 사용하여 활동 전위를 성공적으로 유도하는 등 몇 가지 복잡한 어려움이 여전히 있습니다. 여기에서는 패치 클램프를 사용하여 높은 시공간 해상도로 SCS에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하는 상세한 프로토콜을 제시하며, 이를 통해 연구자가 척수 분리 및 세포 생존력 유지 기술을 향상시켜 운동 뉴런에 대한 SCS의 전기적 메커니즘을 원활하게 연구하고 불필요한 시행착오를 피할 수 있습니다.
Introduction
척수 자극술(SCS)은 척수 손상(SCI) 후 운동 기능을 효과적으로 회복할 수 있습니다. 안드레아스 로왈드(Andreas Rowald) 등은 SCS가 단 하루 만에 하지 운동과 몸통 기능을 가능하게 한다고 보고했다1. 운동 회복을 위한 SCS의 생물학적 메커니즘을 탐구하는 것은 보다 정확한 SCS 전략을 개발하기 위한 중요하고 추세적인 연구 분야입니다. 예를 들어, 그레구아르 쿠르틴(Grégoire Courtine)의 연구팀은 척수의 흥분성 Vsx2 인터뉴런과 Hoxa10 뉴런이 SCS에 반응하는 핵심 뉴런이며, SCI2 이후 쥐의 보행 능력을 회복하기 위해 세포 특이적 신경조절이 가능하다는 것을 입증했습니다. 그러나 단일 셀 규모에서 SCS의 전기적 메커니즘에 초점을 맞춘 연구는 거의 없습니다. 고전적인 오징어 실험 3,4,5에서 초임계 직류 자극이 활동 전위(AP)를 유도할 수 있다는 것은 잘 알려져 있지만, SCS와 같은 펄스 교류 전기 자극이 모터 신호 생성에 어떤 영향을 미치는지는 여전히 불분명합니다.
척추 내 신경 회로의 복잡성을 감안할 때, 세포 집단에 대한 적절한 선택은 SCS의 전기적 메커니즘을 조사하는 데 중요합니다. SCS는 고유수용성 경로(proprioceptive pathway)6를 활성화시킴으로써 운동기능을 회복시키지만, 운동뉴런(motor neuron)은 고유수용감각 정보 구심성 입력(affrioception information afferent input)7의 통합으로부터 유도된 운동 명령을 실행하는 최종 단위이다. 따라서 SCS를 사용하여 운동 뉴런의 전기적 특성을 직접 연구하면 척추 운동 조절의 기본 논리를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
아시다시피, 패치 클램프는 매우 높은 시공간 분해능(spatiotemporal resolution)8을 가진 세포 전기생리학적 기록을 위한 황금 표준 방법입니다. 따라서 본 연구에서는 SCS에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하기 위해 패치 클램프를 사용하는 방법을 설명합니다. 뇌 패치-클램프(9)와 비교했을 때, 척수 패치-클램프는 다음과 같은 이유로 더 어렵다: (1) 척수는 아주 작은 부피의 척추관에 의해 보호되며, 이는 더 나은 세포 생존력을 얻기 위해 매우 미세한 미세 조작과 엄격한 얼음처럼 차가운 유지가 필요하다. (2) 척수가 너무 가늘어서 절단 트레이에 고정할 수 없기 때문에 저융점 아가로스에 담그고 응고 후 다듬어야 합니다.
따라서 이 방법은 척수를 해부하고 동시에 세포 생존력을 유지하는 데 있어 운동 뉴런에 대한 SCS의 전기적 메커니즘을 원활하게 연구하고 불필요한 시행착오를 피할 수 있는 기술적 세부 사항을 제공합니다.
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Protocol
기관 동물 관리 및 사용 위원회는 모든 동물 실험을 승인했으며 연구는 관련 동물 복지 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 동물 준비
- 마리
- 주거 정보: 수컷 Sprague-Dawley 쥐(출생 후 10-14일, P10-P14)를 특정 병원체가 없는 환경에서 사육합니다.
알림: 실내 조건은 20°C ± 2°C, 습도: 50%-60%, 12시간 밝음/어두움 주기로 유지되었습니다. 동물들은 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있었다. - 운동 뉴런을 역행적으로 라벨링: Fluoro-Gold(FG)를 양측 경골 전방 및 비복근(멸균 식염수 2%, 근육당 50μL)에 주입하여 희생 2일 전에 운동 뉴런을 역행적으로 라벨링합니다.
- 주거 정보: 수컷 Sprague-Dawley 쥐(출생 후 10-14일, P10-P14)를 특정 병원체가 없는 환경에서 사육합니다.
- 솔루션
- 절단 용액 준비: 혼합 120 mM 염화 콜린, 2.6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3 , 1.25 mM NaH 2 PO4 , 0.5 mM CaCl 2 , 7 mM MgCl2 , 1.3 mM 아스코르브 산, 15 mM 포도당. 해부 및 슬라이싱 전에 95 % O 2 및 5 % CO2 (KOH로 pH 7.4로 조정)로 용액을 30 분 동안 사전 거품으로 만듭니다. 으깬 얼음으로 용액을 식히십시오.
- 인공 뇌척수액(ACSF) 제조: 126mM NaCl, 3mM KCl, 1.2mM NaH2PO4를 혼합합니다. 1.3 mM MgCl 2, 2.4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 및 10 mM 글루코스. 배양 전에 30분 동안 95% O2 및 5%CO2로 용액을 사전 거품화합니다.
- 세포 내 용액 준비: 126mM K-글루코네이트, 2mM KCl, 2mM MgCl 2, 0.2mM EGTA, 10mM HEPES, 4mM Na 2 ATP, 0.4mM Na2GTP, 10mM K-포스포크레아틴 및 0.5% 뉴로비오틴(pH 7.25 및 305mOsm/Kg)을 혼합합니다. 으깬 얼음으로 용액을 식히십시오.
- 저융점 아가로스 겔 준비: 절단액 100mL에 아가로스 4g을 녹이고 자기 교반 로터를 사용하여 완전히 녹입니다. 매립 전 30분에 저융점 아가로스를 전자레인지에서 고출력으로 1분 동안 가열한 후 39°C 수조에 옮겨 액체 상태를 유지합니다.
- 기기 준비
- 관류 전 1분에 으깬 얼음을 관류 트레이(보충 그림 10A)에 놓습니다. 해부학적 트레이(보충 그림 1B)와 절단 트레이(보충 그림 1C)를 물 밴드가 있는 -80°C의 밤새 미리 놓습니다.
- 나일론 메쉬가 있는 배양 챔버를 45°C의 오븐에 미리 밤새 넣습니다.
- 저융점 아가로스를 사용하여 35° 경사면과 2mm 두께의 플랫폼을 사전 제작합니다(보충 그림 1D). 겔 응고 후 35mm 페트리 접시 중앙에 놓아 다음 절차에서 척수를 지지합니다.
- 심내 관류
- 복강 내 주사를 통해 2.5% 트리브로모에탄올(160μL/10g)로 쥐를 마취합니다. 발가락을 부드럽게 꼬집는 것과 같은 외부 자극에 대한 반응 부족을 확인하여 쥐가 완전히 마취되었는지 확인합니다.
- 적절한 마취가 확인되면 쥐를 누운 상태로 놓고 실리카겔로 채워진 페트리 접시에 고정시킵니다.
- 5mm 세로 피부 절개를 시푸이드 돌기까지 꼬리로 자른 다음 피하 공간을 완전히 확장합니다. 복부 정중선을 따라 2cm의 세로 피부 절개를 잘라 위에서 언급한 절개부부터 가슴 상단까지 외흉벽을 완전히 노출시킵니다.
- 톱니가 있는 핀셋을 사용하여 시포이드를 들어 올린 다음 (보충 그림 2A) 가는 가위를 사용하여 횡격막을 자릅니다. 흉부를 열고 심장을 노출시키기 위해 xiphoid 돌기의 양쪽을 따라 흉골을 절단합니다(보충 그림 2B).
알림: 양쪽의 내부 흉부를 보존하도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 대량 출혈을 유발할 수 있습니다. - 이빨이 없는 핀셋을 사용하여 좌심실을 들어 올립니다. 좌심실의 세로축을 따라 좌심실 정점에 22G 바늘을 삽입합니다(보충 그림 2C). 한편, 관류관에서 리드미컬한 혈액 맥동을 관찰하거나 바늘이 우심실에 구멍을 뚫어 관류 효과가 좋지 않을 수 있습니다.
알림: 톱니가 있는 핀셋을 사용해서는 안 됩니다. 그렇지 않으면 핀셋 고정 부위에서 여분의 혈액이 누출될 수 있습니다. - 가는 가위를 사용하여 오른쪽 아트리움을 자른 다음(보충 그림 2C) 1분 이내에 약 2mL/s의 속도로 100mL의 얼음처럼 차가운 관류액을 수동으로 주입합니다.
알림: 쥐의 간과 발이 창백해지고 우심방에서 혈액이 흐르지 않으면 좋은 관류를 얻을 수 있습니다.
- 척수 박리(그림 1)
- 쥐를 엎드린 자세로 놓고 앞쪽 상장골 척추(약 L4 척추 수준)와 흉두의 만곡 이동점(약 T6 척추 수준)에서 각각 척추를 자릅니다(그림 1A). 그런 다음 즉시 분리된 척추를 산소가 공급된 얼음처럼 차가운 관류 용액에 넣어 잔류 혈액과 지방 조직을 씻어냅니다. 이 절차는 후속 절차에서 수술 필드를 깨끗하게 유지하는 데 유용합니다.
참고: 척추 주위 근육은 예약되어야 하며, 이는 곤충 핀을 사용하여 척추를 고정하는 데 도움이 됩니다. - 즉시 분리된 척추를 등쪽이 위로 향하게 하고 끝이 작업자에 가깝게 하여 해부학적 트레이(그림 1B)로 옮깁니다. 해부학적 트레이를 50mL의 연속 산소가 공급되는 얼음 저온 절단 용액으로 채웁니다(그림 1B).
- 4개의 곤충 핀을 사용하여 척추 주위 근육을 관통하여 척추를 고정합니다(그림 1B).
- 해부 현미경으로 "후궁 절제술"이라고 할 수 있는 마이크로 가위로 양쪽 척추경을 연단 끝에서 자릅니다(그림 1C). 척수가 손상되지 않도록 주의하십시오. 한편, 마이크로 톱니 핀셋을 사용하여 절단된 척추체를 들어 올립니다.
- 후궁 절제술 후에는 척수를 척수에서 즉시 분리하지 마십시오. 대신 마이크로 가위를 사용하여 등쪽 정중선을 따라 경막을 자르면 세포와 산소가 공급된 ACSF 사이의 영양분 흡수에 도움이 됩니다(그림 1D).
알림: 경막을 절대 찢지 마십시오. 마이크로 가위로 경막을 자르는 것만 허용됩니다. 그렇지 않으면 신경근과 척추 실질이 심각하게 손상됩니다! - 척수의 부분을 들어 올린 다음 약 1mm를 남겨두고 신경근을 조심스럽게 자릅니다(그림 1E). 척추관에서 척수를 분리한 후 2개의 곤충 핀을 사용하여 복부 쪽이 위로 향하도록 척수를 고정합니다(그림 1F).
- 마이크로 가위를 사용하여 복부 정중선을 따라 경막을 자릅니다(그림 1F). 여분의 신경근을 약 1mm 남겨두고 잘라냅니다.
참고: 신경은 척수보다 훨씬 더 끈질깁니다. 예약된 신경근이 너무 길면(>1mm) 진동체가 신경근을 절단할 수 없어 척추 실질이 심각하게 찢어질 수 있습니다. - 마이크로 가위를 사용하여 요추 확대를 6-7mm 길이로 분리합니다(그림 1G).
- 쥐를 엎드린 자세로 놓고 앞쪽 상장골 척추(약 L4 척추 수준)와 흉두의 만곡 이동점(약 T6 척추 수준)에서 각각 척추를 자릅니다(그림 1A). 그런 다음 즉시 분리된 척추를 산소가 공급된 얼음처럼 차가운 관류 용액에 넣어 잔류 혈액과 지방 조직을 씻어냅니다. 이 절차는 후속 절차에서 수술 필드를 깨끗하게 유지하는 데 유용합니다.
- 저융점 아가로스에 끼워넣기
- 등쪽이 위로 향하고 꼬리 끝이 아래로 향하도록 요추 확대를 35° 경사면(그림 1H)에 놓습니다. 흡수성 여과지를 사용하여 조직 표면의 풍부한 수분을 제거합니다(그림 1H).
- 녹은 아가로스 겔을 요추 확장이 포함된 페트리 접시에 천천히 붓습니다(그림 1I).
알림: 너무 빨리 붓지 않으면 젤에 거품이 쌓일 수 있습니다. - 위의 페트리 접시를 얼음물 혼합물에 넣어 가능한 한 빨리 젤을 식히면 세포 활동을 유지하는 데 도움이 됩니다.
- 겔을 15mm x 10mm x 10mm 정육면체로 자르고 초강력 접착제를 사용하여 표본 디스크에 장착합니다(그림 1J).
- 깔 끔 히
- 시편 디스크를 미리 얼린 절단 트레이에 넣은 다음 얼음처럼 차가운 절단 용액을 붓습니다(그림 1K). 절단 트레이에 95 % CO 2 및 5 % O2 로 지속적으로 기포를 발생시킵니다.
- 진동 매개변수 설정: 두께: 350μm; 속도: 0.14-0.16mm/s, 진폭: 1.0mm, 진동 주파수: 85Hz.
- 한 마리당 2-3개의 적당한 조각을 수확하십시오. 동물당 5-6개의 세포 범위로 조각당 1-2개의 건강한 FG+ 운동 뉴런을 기록합니다.
- 잠복
- 덮개 슬라이드 핀셋을 사용하여 슬라이스를 자르고(그림 1L) 지속적으로 산소가 공급되는 ACSF로 채워진 배양 챔버에 넣습니다. 배양 챔버를 32°C의 수조에 30분 동안 넣은 다음 기록하기 전에 실온(RT)에서 30분 더 배양합니다.
참고: 마취에서 첫 번째 절편을 얻는 것까지 위의 절차는 세포의 생존력을 최대한 유지하기 위해 20-30분 이내에 완료되어야 합니다. 각 슬라이스의 운동 뉴런은 약 6-7시간 동안 생존력을 유지할 수 있습니다.
- 덮개 슬라이드 핀셋을 사용하여 슬라이스를 자르고(그림 1L) 지속적으로 산소가 공급되는 ACSF로 채워진 배양 챔버에 넣습니다. 배양 챔버를 32°C의 수조에 30분 동안 넣은 다음 기록하기 전에 실온(RT)에서 30분 더 배양합니다.
2. SCS를 사용한 패치 클램프 기록(그림 2)
- 준비
- 약 1-2mL/분의 속도로 연속적으로 기포된 ACSF로 기록 챔버를 관류합니다. 연동 펌프의 제어판을 통해 유량을 개별적으로 조정합니다.
- 녹음실에 슬라이스를 놓습니다. 나일론 나사산이 있는 U자형 백금 와이어를 사용하여 슬라이스를 제자리에 단단히 고정합니다.
- 적외선 미분 간섭 대비 현미경(IR-DIC)을 사용하여 슬라이스를 관찰합니다. 4x 대물 렌즈 아래에서 등근의 길이가 약 1mm인지 확인합니다. 등쪽 뿌리가 실질로 들어가는 영역을 찾은 다음 중앙 시야를 이 영역으로 이동합니다.
- 펄스 발생기를 맞춤형 전극과 연결합니다(그림 2A).
- SCS 구성
- micromanipulation 시스템을 통해 등쪽 정중선 근처에 SCS의 양극을 배치합니다(그림 2B).
- micromanipulation 시스템을 통해 SCS의 음극을 등근 진입 영역(DREZ) 근처에 배치합니다(그림 2B).
- 세포 표적화 및 이미징
- IR-DIC를 10x 대물렌즈와 함께 사용하여 대부분의 운동 뉴런이 위치한 운동란의 배외측 영역을 대략적으로 찾습니다. 그런 다음 중앙 시야를 이 영역으로 이동합니다.
- 60x 대물렌즈로 전환하여 매끄럽고 밝은 표면과 보이지 않는 핵을 가진 건강한 뉴런을 찾습니다(그림 2C,F).
- IR 강도를 약간 낮추고 형광 광원을 켭니다. 광 필터를 광대역 자외선 여기 필터(그림 2D,G)로 전환하여 적절한 FG 양성(FG+) 운동 뉴런을 선택합니다(그림 2E,H).
- 흡입 전극을 사용하여 등근에 1x 모터 역치 자극을 가합니다. 운동 뉴런에서 유발된 활동 전위가 감지되면(보충 그림 3), 등쪽 뿌리의 활동이 온전하다는 것을 확인합니다. 그렇지 않은 경우 이 조각을 삭제해야 합니다.
- 패치 클램프 기록
- 마이크로피펫에 세포 내 용액을 채우고 전극 홀더에 삽입합니다. micromanipulation 시스템을 사용하여 피펫을 ACSF 항온조로 내립니다. 피펫 저항 범위는 5-8MΩ입니다.
- 피펫에 소량의 양압을 가하여 먼지와 세포 파편을 날려 버립니다.
- 전극을 내려 셀에 접근합니다. 피펫이 FG+ 뉴런의 표면에 닿으면 팁 수준에서 멤브레인의 작은 움푹 들어간 곳이 보입니다. 양압을 해제하십시오.
- 그런 다음 주사기를 사용하여 피펫에 소량의 음압을 가합니다. 이것은 세포막을 유리 피펫과 접촉하도록 당기는 소량의 흡입을 생성합니다. 저항 값이 기가옴(>1GΩ)으로 증가할 때까지 소프트웨어 인터페이스의 총 저항에 항상 주의하십시오. 그런 다음 gigaseal이 형성됩니다.
- 멤브레인 전위를 -70mV로 고정한 다음 증폭기의 소프트웨어 인터페이스에서 빠른 커패시턴스 보상 버튼을 누릅니다. 일시적으로 음압을 가하여 세포막을 파열시킨 다음 증폭기의 소프트웨어 인터페이스에서 느린 커패시턴스 보상 버튼을 누릅니다. 이 시점에서, 양호한 전체 세포 구성이 얻어진다.
- 소프트웨어 인터페이스에서 IC 버튼을 클릭하여 전류 클램프 모드로 전환하고 휴지막 전위(RMP)를 기록합니다.
- 진폭이 1-10mA인 상태에서 1-2초 동안 SCS를 적용하고 펄스 폭과 주파수는 각각 210μs 및 40Hz로 고정합니다. 첫 번째 AP가 관찰될 때까지 자극 진폭을 천천히 증가시켜 모터 임계값을 결정합니다.
- 전류 클램프 모드10,11,12에서 레오베이스 주위에 5s 탈분극 전류 주입을 사용하여 지연 및 즉시 발화 모터 뉴런을 구별합니다. 즉시 발화 운동 뉴런: 낮은 rheobase는 안정적인 발화 빈도로 즉각적이고 반복적인 발화를 유도할 수 있습니다. 지연된 발화 운동 뉴런: 높은 유변염기는 가속 발화 속도로 반복적인 발화를 위해 지연된 개시를 유도할 수 있습니다(그림 3).
- SCS가 꺼지면 자발적인 AP 발사를 캡처하기 위한 멤브레인 전위를 계속 기록합니다.
- SCS가 켜지고 꺼질 때 여기성 시냅스후 전류(EPSC)에 대한 전압 클램프 기록, 전압 클램프 기록을 수행합니다. 자극 파라미터는 1x 모터 임계값, 210μs, 2Hz입니다.
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Representative Results
미세 작동 중 엄격한 저온 유지 덕분에(보충 그림 1, 보충 그림 2 및 그림 1) 세포 생존율은 후속 전기생리학적 기록을 수행하기에 충분했습니다. 임상 시나리오를 최대한 시뮬레이션하기 위해 미세 조작을 사용하여 SCS 음극과 양극을 각각 등쪽 정중선과 DREZ 근처에 배치했으며(그림 2), 등쪽 뿔에서 신경 신호를 시작하여 운동 기둥의 배외측 영역에 있는 운동 뉴런으로 전파할 수 있었습니다. 이 연구에서 우리는 FG를 사용하여 직경이 20-50μm인 운동 뉴런을 찾았습니다. 그림 2D,G에서 볼 수 있듯이 건강한 FG+ 뉴런을 척추 회로의 말단인 운동 뉴런으로 자신 있게 확인했습니다. 이 라벨링 방법은 SCS가 발사 패턴에 미치는 영향을 연구하는 길을 열었습니다. 지연 및 즉시 발화 운동 뉴런의 전기생리학적 특성은 보충 표 1 및 보충 표 2에 나열되어 있습니다. 능동 및 수동 속성을 계산하는 방법은 보충 파일 1에 나와 있습니다.
SCS가 펄스 교류 전기장을 척추 절편에 전달할 때 먼저 전류 클램프 모드를 사용하여 막 전위의 응답을 기록했습니다(그림 4). 1/3 모터 임계값(그림 4B,C) 단계로 자극 진폭을 점진적으로 증가시키면 막 전위도 함께 증가했지만 1x 모터 임계값만 Aps를 유도할 수 있었습니다(그림 4D). 그림 4D는 약 10-20개의 펄스가 AP를 유도할 수 있음을 보여주며, 이는 SCS 진폭에 대한 명확한 AP 응답 규칙성이 존재할 수 있음을 나타냅니다.
SCS가 꺼진 후에도 멤브레인 전위를 계속 기록했습니다. 그림 5 는 막 전위가 -60mV로 약간 증가하고 뉴런이 일련의 자발적인 AP를 발사한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 자발적인 AP는 짧은 시간(30-40초) 동안 지속된 다음 막 전위가 -65mV로 돌아와 SCS가 일시적으로 세포 여기성을 증가시킬 수 있음을 나타냅니다.
그런 다음 SCS가 켜졌다 꺼졌을 때 EPSC에 전압 클램프 기록을 사용했습니다(그림 6). 각 SCS 펄스 후에 유발된 EPSC가 감지될 수 있습니다. 자극 아티팩트와 EPSC 사이의 지연 시간은 2.64 ± 0.38ms였습니다(보충 그림 4). 유발된 EPSC의 진폭은 35.14 ± 12.73pA였습니다(보충 그림 4). 유발된 EPSC의 주파수는 SCS 주파수와 일치합니다. 수동 전하 밸런싱을 뺀 후, 유발된 EPSC는 1x 모터 임계값 자극 후 생존 가능한 운동 뉴런에서 관찰할 수 있습니다(보충 그림 5A). 자극 극성은 동일한 세포에서 2시간 동안 관류를 중지한 후 반전되었습니다. 자극은 어떠한 EPSC도 유도하지 않았으며, 유발된 EPSC가 인공물이 아님을 확인하였다(보충 그림 5B).
그림 1: 척수 박리와 슬라이스 . (A) 전방 상장골 척추(약 L4 척추 수준)와 흉두의 만곡 이동점(약 T6 척추 수준)에서 각각 척추를 절단합니다. (B) 등쪽이 위로 향하고 끝이 작업자에 가까운 상태에서 격리된 척추를 해부학적 트레이로 즉시 옮깁니다. 해부학 트레이를 지속적으로 산소가 공급되는 얼음 냉간 절단 용액으로 채웁니다. (C) 후궁 절제술을 주연 끝에서 양쪽으로 수행합니다. (D) 세포와 산소가 공급된 인공 뇌척수액(ACSF) 사이의 영양 흡수에 도움이 되는 등쪽 경막을 절단합니다. (E) 신경근을 조심스럽게 자릅니다. (F) 복부 경막을 자릅니다. (사) 요추 확대를 6-7mm 길이로 분리합니다. (H) 등쪽이 위로 향하고 꼬리 끝이 아래로 향하도록 요추 확장대를 35° 경사면에 놓습니다. 흡수성 여과지를 사용하여 조직 표면의 풍부한 수분을 제거합니다. (I) 녹은 아가로스 겔을 페트리 접시에 천천히 붓습니다. (J) 겔을 입방체로 자르고 초강력 접착제로 표본 디스크에 장착합니다. (케이) 시편 디스크를 절단 트레이에 넣은 다음 얼음처럼 차가운 절단 용액을 붓습니다. (텃) 요추 비대증 시 척추 절편의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 척수 자극(SCS) 구성 및 운동 뉴런 영상. (A) 맞춤형 전극이 있는 펄스 발생기는 진폭, 펄스 폭 및 주파수를 개별적으로 조정할 수 있습니다. Inlet은 전극 접촉의 치수 사양이 800 μm x 500 μm x 300 μm임을 보여주었습니다. (B) 마이크로 조작 시스템을 통해 각각 등쪽 정중선과 등쪽 뿌리 진입 영역(DREZ) 근처에 양극과 음극을 배치합니다. 기록 피펫을 모터 컬럼의 배외측 영역에 배치하여 Fluoro-Gold 양성(FG+) 운동 뉴런을 고정합니다. (C) 적외선 미분 간섭 대비 현미경(IR-DIC) 이미징(60x)이 있는 건강한 즉시 발사 운동 뉴런. (D) 형광 이미징(60x), 빛나는 Fluoro-Gold(FG) 입자만 있는 동일한 뉴런은 이 뉴런이 운동 뉴런임을 나타냅니다. (이자) FG+ 운동 뉴런의 IR-DIC 및 형광 병합 이미지. (FH) IR-DIC 이미징을 사용한 건강한 지연 발화 운동 뉴런(60x). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 5초의 탈분극 전류 주입을 사용하여 지연된 발화 모터 뉴런과 즉시 발화하는 모터 뉴런을 구별합니다. (A) 즉각적 발화 운동 뉴런: 낮은 유변염기는 안정적인 발화 빈도로 즉각적이고 반복적인 발화를 유도할 수 있습니다. (B) 지연된 발화 운동 뉴런: 높은 유변염기는 가속된 발화 속도로 반복적인 발화를 위해 지연된 시작을 유도할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 척수 자극(SCS)은 운동 뉴런에서 발화하는 활동 전위(AP)를 유도했습니다. (A) 자극을 가하지 않았을 때, 휴지막 전위(RMP)는 -65mV였다. (B) 1/3x 모터 임계값 자극은 AP를 유도할 수 없습니다. (C) 2/3x 모터 임계값 자극은 AP를 유도할 수 없습니다. (D) 1x 모터 임계값 자극은 AP를 유도할 수 있으며 10-20개의 펄스마다 AP를 유도할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 척수 자극(SCS) 후 발화하는 자발적 활동 전위(AP). SCS가 꺼진 후 뉴런은 짧은 시간(30-40초) 동안 일련의 자발적인 AP를 발사한 다음 휴지막 전위(RMP)가 -65mV로 돌아왔습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 척수 자극(SCS) 매개변수와 유발된 흥분성 시냅스후 전류(EPSC)의 그림. (A) SCS 매개변수의 그림; (나,씨) 단일 자극 펄스(1x 모터 임계값 자극) 후 유발된 EPSC를 관찰할 수 있습니다. (D) 패시브 전하 밸런싱을 뺀 후, EPSC의 레이턴시와 진폭을 계산할 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 기기 준비. (A) 관류 트레이: 관류 10분 전에 실리카겔로 채워진 10cm 페트리 접시에 으깬 얼음을 놓습니다. (B) 해부학 트레이 : 희생 전날 밤에 실리카겔로 채워진 자체 제작 해부학 트레이를 -80 °C 냉장고에 넣으십시오. (C) 커팅 트레이: 희생 전날 밤에 워터 밴드가 있는 커팅 트레이를 -80°C 냉장고에 넣으십시오. (D) 아가로스 주조 기울기: 관류 30분 전에 35mm 페트리 접시 중앙에 베이스 플레이트가 있는 35° 아가로스 기울기를 놓습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 심내 관류. (A) xiphoid process를 들어 올립니다. (B) 흉골을 양쪽으로 절개하여 흉부를 열고 심장을 노출시킵니다. 흉부 내부 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오, 그렇지 않으면 대량 출혈이 전체 수술 필드를 채우고 작업자가 심실 정점 또는 우심방을 식별하는 데 방해가 됩니다. (C) 관류를 위해 좌심실 정점에 22G 바늘을 삽입하고 체액 배출을 위해 우심방을 절단합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 등뿌리 활동 확인. 흡입 전극을 사용하여 등근에 1x 모터 역치 자극을 가합니다. 운동 뉴런에서 유발된 활동 전위가 감지되면 등근의 활동이 온전한 것을 확인할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: SCS가 켜져 있을 때 호출된 EPSC의 대기 시간 및 진폭. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 5: 환기된 EPSC의 유효성 입증. (A) 수동 전하 밸런싱을 뺀 후 1x 모터 임계값 자극 후 유발된 EPSC는 생존 가능한 운동 뉴런에서 관찰될 수 있습니다. (B) 동일한 세포에서 2시간 동안 관류를 중지한 후 자극 극성이 반전되어 1x 모터 역치 자극이 EPSC를 유도하지 않아 유발된 EPSC가 인공물이 아님을 확인했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 능동 및 수동 특성의 계산 방법. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 운동 뉴런의 수동적 특성. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 운동 뉴런의 활성 특성 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
SCS에 의해 조절된 운동 정보는 최종적으로 운동 뉴런으로 수렴됩니다. 따라서 운동 뉴런을 연구 목표로 삼으면 연구 설계를 단순화하고 SCS의 신경 조절 메커니즘을 보다 직접적으로 밝힐 수 있습니다. 다양한 자극 특성과 세포 반응을 동시에 기록하기 위해 패치 클램프는 단일 세포 규모에서 전기생리학적 특성을 연구하는 좋은 방법입니다. 그러나 세포 생존력을 유지하는 방법, 뼈 구조에서 척수를 빠르게 분리하는 방법, SCS를 사용하여 AP를 성공적으로 유도하는 방법 등 여전히 몇 가지 어려움이 있습니다. 따라서 본 연구는 연구자가 필수 수술 기술을 빠르게 파악하고, 몇 가지 가능한 함정을 피하고, 가능한 한 빨리 방법론이 아닌 연구 설계에 집중할 수 있도록 돕는 것을 목표로 합니다.
좋은 세포 생존력을 얻기 위해서는 항상 다음과 같은 세부 사항에 주의를 기울여야 합니다: (1) 척수를 얼음처럼 차가운 온도로 유지하는 것은 매우 중요한데, 그 이유는 저온이 세포 사멸을 억제하고 신진대사 속도를 늦출 수 있기 때문이며, 이는 관류, 해부 및 절단 중 기계적 손상으로부터 뉴런을 보호할 수 있기 때문입니다13; (2) 마이크로 가위로 경막을 섬세하게 제거하면 주변 용액에서 신경 영양소 흡수를 향상시킬 수 있습니다. 경막을 직접 떼어내지 마십시오. 그렇지 않으면 척수가 심각하게 손상됩니다. 또한 경막을 제거하는 것을 잊은 경우 칼날이 경막을 완전히 절단하지 않고 아가로스에서 남은 척수를 뜯어낼 수 있기 때문에 후속 슬라이싱 과정이 어려울 수 있으며, 이는 슬라이싱의 실패로 이어질 수 있습니다. (3) 기존의 횡방향 슬라이스와 비교하여 비스듬한 슬라이스는 회백질의 면적을 증가시키며 단일 슬라이스에서 더 많은 FG+ 운동 뉴런을 찾을 수 있습니다9. (4) 척수만으로는 뇌와 같이 검체 디스크에 단단히 고정할 수 없기 때문에 아가로스 겔에 삽입하면 세포 생존력을 저하시키지 않고 이 문제를 해결하는 데 효과적입니다. 고온은 세포 생존력을 손상시킬 수 있으므로 기존의 아가로스(겔 포인트 38-43 °C)보다는 저융점 아가로스(겔 포인트 26-30 °C)를 사용하는 것이 좋습니다. (5) 느슨한 실은 척수를 단단히 고정할 수 없고 촘촘한 실은 세포를 짓눌 수 있으므로 U자형 백금 와이어의 두 나일론 실 사이의 거리는 1-1.5mm로 하는 것이 좋습니다.
기초 연구에서 널리 사용되는 바이폴라 후크 전극과 같은 기존 자극 장치와 비교하여 본 연구의 SCS 전극은 이전 임상 연구14 및 기초 연구15에서 파생되었습니다. SCS는 다양한 매개변수 조정 치수를 제공하는 펄스 교대 전기 자극을 제공합니다. 이 SCS 장치는 또한 조직 전기 분해를 피하기 위한 전하 균형 기능이 있으며 신경 조직에 직접 접촉하지 않습니다. 따라서 이 SCS는 생체 내 응용 분야에 대한 안전성이 우수합니다.
SCS 치료 후, 운동 뉴런의 자발적인 AP는 다음과 같은 이유에 기인할 수 있습니다: (1) SCS는 전하가 세포체와 뉴런의 축삭 구에 축적되도록 유도하여 RMP16의 증가를 유도합니다. 이러한 현상은 SCS가 뉴런의 흥분성을 향상시킬 수 있음을 나타내며, 이는 SCS 후 이온 채널의 전도도 변화와 관련될 수 있으며, 예컨대 Na v 1.117, K v 2.1 18 또는 Ca v 2.3 19 이다. (2) SCS는 운동 뉴런에 대한 고유수용성 피드백을 촉진하기 위해 등쪽 GABAergic 뉴런을 활성화할 수 있습니다. 감각 뉴런과 운동 뉴런 사이에 신경 전달이 지속적으로 존재하여 SCS 후 운동 뉴런에서 자발적인 AP가 발생할 수 있음을 시사합니다. 자발적 AP는 감각운동 행동을 실행할 수 있는 내재적 준비 상태를 유지할 수 있다20. 따라서 자발적 AP를 활성화하거나 억제하는 것이 척추 신경 질환의 치료에 도움이 될 수 있습니다.
아시다시피, 생체 내 전기 생리학 기록은 전기장의 자연 분포와 전극의 배치에서 전기 생리학 적 반응을 감지하는 데 더 좋습니다. 더욱이, 생체 내 motoneuron 기록은 motoneuron identity의 식별을 가능하게 한다. 이는 근섬유력 측정(21)과 결합된 운동 축삭돌기의 항혈구 식별을 통해 수행될 수 있다. 그러나 생체 내 척수 기록은 다음과 같은 단점도 있습니다 : (1) 운동 뉴런은 척수의 등쪽 표면에서 2-3mm 떨어져 있으며, 가장 진보 된 2 광자 컨포칼 이미징을 사용하더라도 관찰 깊이는 500-800 μm에 불과하므로 기존 방법을 사용하여 생체 내에서 광학적으로 관찰하기가 어렵습니다. 따라서 생체 내에서 단일 운동 뉴런을 정확하게 고정하려면 유리 피펫이 보이지 않는 운동 뉴런에 도달하기 위해 등쪽 기둥을 통과해야 합니다. In vivo Patch-Clamp는 "블라인드" 방식으로만 수행할 수 있으므로 상당한 불확실성과 실패율이 발생합니다. (2) 생체 내 패치 클램프를 제외하고, 실리콘 전극 기록은 Utah 어레이 또는 Neuropixels 전극과 같은 대체 방법이 될 수 있습니다. 그러나 실리콘 전극에 의해 기록되는 신호는 대부분 단일 활동 전위가 아닌 복합 활동 전위입니다. 단일 뉴런의 활성은 스파이크 정렬 알고리즘을 사용하여 해결되었지만, 정렬 알고리즘의 정확도와 신뢰성은 여전히 개선되어야 합니다.
in vivo 기록과 비교할 때, in vivo에 대한 in vitro의 가장 큰 이점은 SCS에 의해 활성화되는 시냅스 경로를 고유하게 이해할 수 있는 전압 클램프를 사용한다는 것입니다. 또한 라이브 이미징 도구의 사용도 허용합니다. SCS는 GABA와 글루타메이트와 같은 신경전달물질이 상부 뉴런에서 운동 뉴런으로 방출되도록 유도하여 전반적인 흥분성 EPSC 반응을 유발하는 것으로 추측한다7. 따라서 향후 연구에서는 SCS에 의해 유도된 IPSC, 미니 EPSC(mEPSC) 및 유발 EPSC의 검출을 통합하여 전운동 뉴런 또는 인터뉴런에서 억제성 및 흥분성 신경전달물질 방출 패턴을 명확히 할 것입니다. 우리는 체외 자극에도 몇 가지 한계가 있다는 것을 충분히 인정했다: (1) 척수의 장거리 종방향 회로가 파괴되어 운동 피질이나 하지에서 들어오는 정보가 손실된다. (2) in vitro 자극 중 전기장의 분포는 in vivo 자극에서의 분포와 다를 수 있습니다. 이 연구에서 AP에 대한 활성화 임계값(약 밀리암페어)은 생체 내 실험(약 마이크로암페어)보다 훨씬 높았습니다15. 이는 기록 챔버에서 ACSF 용액의 부피 용량이 자연 상태의 뇌척수액보다 훨씬 높았기 때문이며, 수학적 이론은 전기장이 고전도성 물질에서 더 빨리 감쇠된다는 것을 뒷받침합니다22. 따라서 대부분의 전류는 목욕 용액에 흡수되었으며 전기장의 작은 부분만 신경근으로 확산될 수 있다고 추측합니다.
따라서, in vivo 자극 및 in vitro 자극의 장단점을 고려할 때, in vitro patch-clamp는 신생아 설치류에서 SCS의 시냅스 특성 및/또는 세포 효과를 연구하는 데 유리한 방법이라는 결론을 내릴 수 있다.
임상적으로, 전극은 척수 또는 신경근(23)의 표면을 직접 수축시키지 않는다. 대신, 전극에서 발생하는 전기장 방사선에 의존하여 신경의 활동에 간접적으로 영향을 미친다1. 여러 연구 1,23,24에서 SCS의 음극 접촉은 특정 근육을 자극하기 위한 최적의 선택성을 달성하기 위해 등근 또는 진입 영역(DREZ)에 가능한 한 가깝게 배치되어야 함을 확인했습니다. 전극과 신경근 사이의 거리를 늘리면 자극의 특이성이 약해집니다. 따라서 음극을 신경근이나 척수에 직접 접촉하지 않고 DREZ 근처에 직접 배치합니다.
등쪽 뿌리의 구심성 섬유는 먼저 감각 뉴런에 돌출된 다음 중간 뉴런과 운동 뉴런으로 돌출됩니다. 횡방향 돌출 회로 외에도 로스트랄 및 꼬리 끝을 향해 돌출하는 회로도 있습니다. 예를 들어, 경골 전방근에 대응하는 운동 뉴런은 여러 수준(25)에서 발견될 수 있다. 따라서 비스듬한 준비는 횡방향 돌출 회로를 절단할 수 있지만 여전히 비횡방향 돌출 섬유를 보존하여 전운동 감각 회로를 연구할 수 있습니다. 비스듬한 준비 및 횡방향 준비에 더하여, 종방향 준비는 등쪽 뿌리로부터 운동 뉴런에 이르는 회로를 더 잘 보존하고, 여러 분절(26)에 걸쳐 척수 회로를 효과적으로 유지할 수 있게 하는 뚜렷한 이점을 제공하며, 이는 실제 생리학적 조건의 보다 근접한 표현을 제공한다.
시뮬레이션 연구 6,27,28에 따르면 SCS는 주로 Ia, Ib 및 II 구심성 섬유를 포함하여 하지 운동을 복원하기 위해 고유 수용성 구심성 섬유를 활성화합니다. 그러나 이 연구에서는 어떤 종류의 섬유가 SCS에 의해 특이적으로 활성화되었는지 자신 있게 확인할 수 없습니다. 우리는 유사한 패턴이 in vitro 패치 클램프에도 존재할 수 있다고 추측합니다. 우리는 수학적 모델링과 시뮬레이션을 수행하고 이를 진행 중인 작업에 통합함으로써 이 문제를 해결할 것입니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 연구원들이 작동 기술을 향상시키고 패치 클램프 기록과 SCS를 결합하여 단일 셀 규모에서 SCS의 전기적 메커니즘을 조사하는 데 필수적인 사항을 파악하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
없음
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 젊은 학자(52207254 및 82301657)와 중국 박사후 과학 기금(2022M711833)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
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