Summary
Die intradermale Mikrodialyse ist eine minimalinvasive Technik, die zur Untersuchung der mikrovaskulären Funktion bei Gesundheit und Krankheit eingesetzt wird. Sowohl Dosis-Wirkungs- als auch lokale Erwärmungsprotokolle können für diese Technik verwendet werden, um Mechanismen der Vasodilatation und Vasokonstriktion im Hautkreislauf zu untersuchen.
Abstract
Das Hautgefäßsystem ist ein zugängliches Gewebe, das zur Beurteilung der mikrovaskulären Funktion beim Menschen verwendet werden kann. Die intradermale Mikrodialyse ist eine minimalinvasive Technik, mit der die Mechanismen der glatten Gefäßmuskulatur und der Endothelfunktion im Hautkreislauf untersucht werden. Diese Technik ermöglicht die pharmakologische Analyse der Pathophysiologie der mikrovaskulären endothelialen Dysfunktion, die durch eine verminderte Stickstoffmonoxid-vermittelte Vasodilatation, ein Indikator für das Risiko für die Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, indiziert ist. Bei dieser Technik wird eine Mikrodialysesonde in der Hautschicht platziert und eine lokale Heizeinheit mit einer Laser-Doppler-Durchflusssonde über die Sonde gelegt, um den Fluss der roten Blutkörperchen zu messen. Die lokale Hauttemperatur wird durch direkte Wärmeanwendung geklemmt oder stimuliert, und pharmakologische Wirkstoffe werden durch die Sonde perfundiert, um intrazelluläre Signalwege zu stimulieren oder zu hemmen, um eine Vasodilatation oder Vasokonstriktion zu induzieren oder interessante Mechanismen (Co-Faktoren, Antioxidantien usw.) zu untersuchen. Die kutane vaskuläre Leitfähigkeit wird quantifiziert und die Mechanismen der endothelialen Dysfunktion in Krankheitszuständen können beschrieben werden.
Introduction
Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) sind die häufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten1. Bluthochdruck (HTN) ist ein unabhängiger Risikofaktor für Schlaganfall, koronare Herzkrankheit und Herzinsuffizienz und betrifft schätzungsweise mehr als ~50% der Bevölkerung der Vereinigten Staaten2. HTN kann sich als eigenständige kardiovaskuläre Erkrankung (primäre HTN) oder als Folge einer anderen Erkrankung, wie z. B. polyzystischer Nierenerkrankung und/oder endokriner Störungen (sekundäre HTN), entwickeln. Die Breite der Ätiologien der HTN erschwert die Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen und Endorganschädigungen, die bei HTN beobachtet werden. Vielfältige und neuartige Forschungsansätze zur Pathophysiologie der mit HTN assoziierten Endorganschädigung sind erforderlich.
Eines der frühesten pathologischen Anzeichen einer kardiovaskulären Erkrankung ist eine endotheliale Dysfunktion, die durch eine gestörte Stickstoffmonoxid (NO)-vermittelte Vasodilatation gekennzeichnet ist 3,4,5. Die flussvermittelte Dilatation ist ein gängiger Ansatz zur Quantifizierung der endothelialen Dysfunktion im Zusammenhang mit kardiovaskulärer Erkrankung, aber die endotheliale Dysfunktion in mikrovaskulären Betten kann sowohl unabhängig von der der großen Leitungsarterien als auch eine Vorstufe davon sein 6,7,8. Darüber hinaus werden Resistenzarteriolen direkter vom lokalen Gewebe beeinflusst als Leitungsarterien und haben eine unmittelbarere Kontrolle über die Zufuhr von sauerstoffreichem Blut. Die mikrovaskuläre Funktion ist prädiktiv für ein unerwünschtes kardiovaskuläres ereignisfreies Überleben 9,10,11. Das kutane Mikrogefäßsystem ist ein zugängliches Gefäßbett, mit dem Reaktionen auf physiologische und pharmakologische gefäßverengende oder gefäßerweiternde Reize untersucht werden können. Die intradermale Mikrodialyse ist eine minimalinvasive Technik, deren Ziel es ist, die Mechanismen sowohl der glatten Gefäßmuskulatur als auch der Endothelfunktion im kutanen Mikrogefäßsystem mit gezielter pharmakologischer Dissektion zu untersuchen. Diese Methode steht im Gegensatz zu anderen Techniken, wie z. B. der postokklusiven reaktiven Hyperämie, die keine pharmakologische Dissektion zulässt, und der Iontophorese, die eine pharmakologische Verabreichung ermöglicht, aber in ihrem Wirkmechanismus weniger präzise ist (an anderer Stelle gründlich besprochen12).
Die Gründe für die Entwicklung und den Einsatz dieser Technik werden an anderer Stelle ausführlich behandelt13. Dieser Ansatz wurde ursprünglich für die neurologische Forschung an Nagetieren entwickelt und dann zunächst auf den Menschen angewendet, um die Mechanismen zu untersuchen, die der aktiven Vasodilatation aus thermoregulatorischer Sicht zugrunde liegen. In den späten 1990er Jahren wurden mit dieser Methode sowohl neuronale als auch endotheliale Mechanismen im Hinblick auf die lokale Erwärmung der Haut untersucht. Seitdem wird die Technik eingesetzt, um eine Reihe von neurovaskulären Signalmechanismen in der Haut zu untersuchen.
Mit dieser Technik haben unsere Gruppe und andere die Mechanismen der endothelialen Dysfunktion in den Mikrogefäßen mehrerer klinischer Populationen untersucht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Dyslipidämie, primäres Altern, Diabetes, chronische Nierenerkrankungen, polyzystisches Ovarialsyndrom, Präeklampsie, schwere depressive Störung 14,15,16,17,18,19 und Bluthochdruck 20,21,22,23,24. Eine frühere Studie ergab beispielsweise, dass normotensive Frauen mit Präeklampsie in der Vorgeschichte, die ein erhöhtes Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen haben, im Vergleich zu Frauen mit einer normotensiven Schwangerschaft in der Vorgeschichte eine reduzierte NO-vermittelte Vasodilatation im Hautkreislauf aufwiesen20. In einer anderen Studie zeigten Erwachsene, bei denen primäres HTN diagnostiziert wurde, eine erhöhte Angiotensin-II-Sensitivität im Mikrogefäßsystem im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen21, und es wurde gezeigt, dass eine chronische Sulfhydryl-spendende antihypertensive Pharmakotherapie bei primären HTN-Patienten den Blutdruck senkt und sowohl die Schwefelwasserstoff- als auch die NO-vermittelte Vasodilatation verbessert22. Wong et al.23 fanden eine beeinträchtigte sensorisch vermittelte und NO-vermittelte Vasodilatation bei prähypertensiven Erwachsenen, was mit unserem Befund eines Fortschreitens der endothelialen Dysfunktion mit zunehmenden HTN-Stadien zusammenfällt, wie in den Leitlinien der American Heart Association und des American College of Cardiology24 aus dem Jahr 2017 kategorisiert.
Die intradermale Mikrodialysetechnik ermöglicht streng kontrollierte mechanistische Untersuchungen der mikrovaskulären Funktion in Gesundheits- und Krankheitszuständen. Daher zielt diese Arbeit darauf ab, die intradermale Mikrodialysetechnik zu beschreiben, wie sie von unserer Gruppe und anderen angewendet wird. Wir beschreiben die Verfahren sowohl für die pharmakologische Stimulation des Endothels mit Acetylcholin (ACh), um die Dosis-Wirkungs-Beziehung zu untersuchen, als auch für die physiologische Stimulation der endogenen NO-Produktion mit einem lokalen Heizreizprotokoll bei 39 °C oder 42 °C. Wir präsentieren repräsentative Ergebnisse für jeden Ansatz und diskutieren die klinischen Implikationen der Erkenntnisse, die sich aus dieser Technik ergeben haben.
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Protocol
Alle Verfahren werden vor der Rekrutierung der Teilnehmer vom Institutional Review Board der Pennsylvania State University genehmigt.
1. Einrichtung der Ausrüstung
- Schalten Sie die lokale Heizeinheit und den Laser-Doppler-Durchflussmesser ein.
HINWEIS: Beide sollten vor der Datenerfassung gemäß den Anweisungen des Herstellers kalibriert werden. Das Laser-Doppler-Durchflussmessgerät sollte an Datenerfassungshardware mit Abtastung bei 100 Hz (100 Abtastungen/min) und kontinuierlicher Aufzeichnung in einer Datenerfassungssoftware angeschlossen werden. Es kann zwar auch andere Hardware und Software zur Datenerfassung verwendet werden, aber die übrigen Anweisungen spiegeln der Einfachheit halber die PowerLab-Hardware und die Funktionen der LabChart-Software wider. - Öffnen Sie eine LabChart-Softwaredatei.
HINWEIS: Eine Referenzdatei mit den gewünschten Dateneingabe- und kontinuierlichen Datenerfassungsfunktionen sollte im Voraus erstellt werden. Für jeden Laser-Doppler und jeden lokalen Heizer sollte ein Panel vorhanden sein, das jeder Mikrodialysestelle entspricht, und die Panels sollten den entsprechenden Kanaleingängen in der Datenerfassungs-Hardwareeinheit entsprechen.
2. Platzierung von Mikrodialysefasern
- Identifizieren Sie die großen, sichtbaren Blutgefäße der Haut in der ventralen Seite des Unterarms und markieren Sie sie mit einem Permanentmarker (verwenden Sie bei Bedarf ein Tourniquet, um die Gefäße sichtbar zu machen; die Identifizierung von Gefäßen in dunkel pigmentierter Haut kann eine stärkere Abhängigkeit von der Palpation erfordern).
- Tupfen Sie den Bereich, der die Flecken umfasst, und einen großzügigen Teil der Umgebung mit Betadin-Tupfern ab. Wischen Sie das Betadin mit Alkoholtupfern ab. Bedecken Sie den sterilisierten Hautbereich mit einem sterilen Tuch und legen Sie ~5 Minuten lang Eis auf, um den Bereich zu betäuben.
- Entfernen Sie das Eis und führen Sie eine nach oben gerichtete Einführnadel (23 g, 25 mm Länge) in einer Tiefe von 2-3 mm (je nach individueller Hautdicke) in die Hautschicht ein. Schieben Sie die Nadel vor, achten Sie darauf, in der Hautschicht zu bleiben, und verlassen Sie die Haut ~20 mm von der Einstichstelle.
HINWEIS: Um die richtige Tiefe der Platzierung in der Haut zu bestätigen, sollte die Form der Nadel sichtbar und leicht tastbar sein, aber die Farbe der Nadel sollte verdeckt sein. Wenn für das Experiment mehr als eine Mikrodialysesonde erforderlich ist, müssen zwei beliebige Einführnadeln ≥2,5 cm voneinander entfernt platziert und vor dem Einführen der Mikrodialysesonde positioniert werden. Sonden sollten nicht entlang desselben großen Schiffes platziert werden. - Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle und verbinden Sie die Sonde (über den Luer-Lock) mit einer Spritze mit Ringer-Laktatlösung. Führen Sie das gegenüberliegende Ende der Sonde durch die Einführnadel, bis sich die semipermeable Membran der Sonde in der Nähe, aber noch außerhalb der Öffnung der Einführnadel befindet. Perfundiert wird langsam eine kleine Menge Ringer-Lösung durch die Faser, bis die Lösung sichtbar durch die Poren der Membran perfundiert ist, um die Integrität der Membran zu bestätigen.
- Wenn Sie eine Mikrodialysesonde und eine Einführnadel von Harvard Bioscience verwenden, befolgen Sie die Schritte 2.5.1 bis 2.5.2.
- Nach Bestätigung der Sondenfunktion führen Sie die Sonde weiter durch die Einführnadel, bis die Membran vollständig in der Hautschicht der Haut innerhalb der Einführnadel enthalten ist.
- Befestigen Sie die Sonde mit einem Finger in der Nähe der Nadel und ziehen Sie die Nadel in die entgegengesetzte Richtung des Einführens zurück. Klebe den äußeren Teil der Faser auf die Haut, um eine Verschiebung der semipermeablen Membran während des Experiments zu verhindern.
- Wenn Sie eine Mikrodialysesonde und eine Einführnadel von Bioanalytical Systems verwenden, befolgen Sie die Schritte 2.6.1 bis 2.6.2.
- Nach Bestätigung der Sondenfunktion wird die Nabe der Einführnadel und der distale Teil der Mikrodialysesonde in einer Hand festgehalten und gleichzeitig die Nadel entgegen der Einführrichtung zurückgezogen, wobei die Mikrodialysesonde an ihren Platz gebracht wird.
- Stellen Sie die Sonde nach Bedarf ein, um sicherzustellen, dass die semipermeable Membran vollständig in der Haut vergraben ist. Klebe die äußere Faser auf die Haut, um eine Verschiebung der semipermeablen Membran während des Experiments zu verhindern.
3. Hyperämie
- Während Sie warten, bis die hyperämische Reaktion auf das Einführen der Nadel abgeklungen ist (~60-90 min), legen Sie die Einmalspritze in das Spritzenhalterfach der Mikroinfusionspumpen. Perfundierte Ringer-Laktatlösung, Kochsalzlösung oder Vehikellösung (die Lösung, in der der experimentelle pharmakologische Wirkstoff aufgelöst ist; 2 μl/min) während der Hyperämiephase.
HINWEIS: Während die Mikrodialysesonden während dieser ~60-90-minütigen Phase nicht entfernt werden können, kann der Teilnehmer seine Körperposition anpassen oder seine Hand bewegen, oder der Luer-Lock der Sonde kann von der Spritze entfernt und mit Klebeband am Arm des Teilnehmers befestigt werden, damit er sich frei bewegen kann, um kurz zu stehen. Sobald die LDF-Sonden mit lokalen Heizgeräten und Laser-Doppler-Flowmetrie-Sonden (LDF) instrumentiert sind und die Datenerfassung begonnen hat, können sie nicht mehr bewegt werden. - Wenn die Hautrötung, die ein Indikator für die hyperämische Reaktion auf ein Nadeltrauma ist, abgeklungen ist, befestigen Sie die lokale Heizeinheit über die Sondenklebescheibe an der Haut, die die semipermeable Membran bedeckt, und stellen Sie sicher, dass die Mitte des Heizgeräts mit dem Weg der Mikrodialysesonde übereinstimmt.
- Platzieren Sie die LDF-Sonde in der Öffnung in der Mitte des lokalen Heizgeräts, so dass der Laser direkt senkrecht zur Hautoberfläche steht. Sobald die LDF-Sonden platziert und gesichert sind, klicken Sie in der Datenerfassungssoftware auf Start , um die Flusswerte der roten Blutkörperchen (Erythrozytenfluss, Perfusionseinheiten, PUs) kontinuierlich aufzuzeichnen und anzuzeigen. Wenn die Hyperämie vollständig abgeklungen ist, ist der Erythrozytenfluss stabil bei ~5-20 PU (die Pulsatilität der Gefäße unter der LDF-Sonde kann sich in leichten Erhöhungen der PU widerspiegeln, die mit den Herzschlägen zusammenfallen).
- Legen Sie eine automatische Blutdruckmanschette auf den Arm einer Person, die nicht instrumentiert wurde.
- Stellen Sie die lokalen Heizgeräte auf 33 °C ein, um die Hauttemperatur in einen thermoneutralen Bereich25 zu bringen und so Schwankungen im Einfluss von thermischen Reizen zu beseitigen. Um einen Kommentar zur kontinuierlichen Aufzeichnung in der Datenerfassungssoftware hinzuzufügen, um Ereignisse im Experiment zu kennzeichnen, klicken Sie auf das Textfeld in der oberen rechten Ecke des Bildschirms, geben Sie einen Kommentar ein, wählen Sie aus, welche Kanäle den Kommentar erhalten sollen, und klicken Sie auf Hinzufügen.
4. Acetylcholin-Dosis-Wirkungs-Protokoll
- Sobald sich der Erythrozytenfluss als Reaktion auf die lokale Hitze von 33 °C stabilisiert hat, beginnen Sie mit der Erfassung der Basisliniendaten, die in der Datenerfassungssoftwaredatei durch einen Kommentar zur Basislinie gekennzeichnet sind. Für die Datenanalyse sind mindestens 5-10 Minuten stabile Baseline erforderlich. Starten Sie die Baseline bei Bedarf jederzeit während dieses Punktes der Datenerfassung neu, und markieren Sie dies in der LabChart-Datei. Erfassen Sie in der letzten Minute des Ausgangswerts eine Blutdruckmessung und geben Sie die Werte in einem Kommentar in die LabChart-Datei ein.
- Am Ende der 5-10 Minuten der Baseline-Datenerfassung messen und zeichnen Sie den Baseline-Blutdruck auf und geben Sie den Kommentar-End-Baseline in die Datenerfassungssoftware ein.
- Schalten Sie die Mikroinfusionspumpen aus und tauschen Sie die Spritzen mit Ringer-Milchlösung gegen die Spritze mit der niedrigsten ACh-Konzentration (10−10 M) aus.
- Befestigen Sie die neuen Spritzen und bestätigen Sie die Perfusion der Flüssigkeit durch das Ende der Sonde, bevor Sie die Mikroinfusionspumpen wieder einschalten. Geben Sie den Kommentar begin −10 in die Aufzeichnung der Datenerfassungssoftware ein.
- Jede ACh-Konzentration wird für 5-10 Minuten bei 2 μl/min perfundiert. In der letzten Minute der Perfusion wird für jede Konzentration der Blutdruck gemessen und aufgezeichnet. Sobald die Perfusionszeit für eine bestimmte Konzentration abgelaufen ist, wird die Spritze durch die nächsthöhere Konzentration ersetzt (z. B. 10-10 M ACh-Lösung wird gegen 10-9 M ACh-Lösung ausgetauscht), wie in den Schritten 4.2-4.4 beschrieben.
- Unmittelbar nach der Perfusion der Endkonzentration von ACh (10−1 M) wird die ACh-Spritze durch eine Spritze mit Ringer-Lösung ersetzt und die Temperatur der lokalen Heizung auf 43 °C erhöht. Sobald sich das Erythrozytenflussmittel stabilisiert hat, ersetzen Sie die Ringer-Lösung durch Natrium-Nitroprussid (28 mM), um sowohl eine hitzeinduzierte als auch eine pharmakologisch induzierte maximale lokale Vasodilatation zu erzielen. Messen und zeichnen Sie den Blutdruck alle ~3 Minuten während dieser maximalen Vasodilatationsphase auf.
- Sobald ein maximales Plateau des Erythrozytenflusses erreicht ist (~5 min stabile PU), beenden Sie das Experiment. Wählen Sie Stopp in der unteren rechten Ecke der Datenerfassungssoftware, um die kontinuierliche Datenerfassung zu beenden.
5. Lokales Heizprotokoll
- Sobald sich der Erythrozytenfluss nach einer Hyperämie stabilisiert hat, beginnen Sie mit der Basisdatenerfassung und geben Sie dies in der Datenerfassungssoftwaredatei mit einem Kommentar an. Erfassen Sie in der letzten Minute des Ausgangswerts eine Blutdruckmessung und geben Sie die Werte in einem Kommentar in die Datei der Datenerfassungssoftware ein.
- Erhöhen Sie die lokalen Heizungen entweder auf 39 °C oder 42 °C, je nach den Anforderungen des Protokolls (im Abschnitt "Diskussion" erläutert).
- Sobald der Erythrozytenfluss als Reaktion auf die lokale Wärmeanwendung (~40-60 min Erhitzung) ein Plateau erreicht hat, perfundiert N-G-Nitro-l-Argininmethylester (L-NAME; 15 mM gelöst in Ringer-Lösung; 2 μl/min; ein NO-Synthase-Inhibitor) durch die Mikrodialysesonde(n).
- Sobald der Erythrozytenfluss als Reaktion auf L-NAME ein Plateau erreicht hat (~15-25 min Perfusion), erhöhen Sie die lokalen Heizungen auf 43 °C.
- Sobald der Erythrozytenfluss als Reaktion auf 43 °C ein Plateau erreicht hat (ein ~2-5 minütiges Plateau tritt nach ~20-45 min Erwärmung auf), perfundiert Natrium-Nitroprussid (28 mM gelöst in Ringer-Lösung) durch die Mikrodialysesonde(n).
- Sobald ein maximales Plateau des Erythrozytenflusses erreicht ist (~5 min stabile PU), beenden Sie das Experiment. Wählen Sie Stopp in der unteren rechten Ecke der Datenerfassungssoftware, um die Datenerfassung zu beenden.
6. Entfernen der Mikrodialysesonden
- Nach Beendigung des Experiments werden die Mikrodialysesonden mit einer chirurgischen Schere durchtrennt. Entfernen Sie vorsichtig die LDF-Sonden von den Heizungen und entfernen Sie die Heizungen von der Haut. Entferne vorsichtig das Klebeband, mit dem die Sonden auf der Haut befestigt sind.
- Identifizieren Sie visuell, welche Einstichstelle auf beiden Seiten der Sonde das kleinste Blutgerinnsel gebildet hat. Schneiden Sie den Teil der Sonde in der Nähe der Stelle mit dem kleineren Gerinnsel ab und lassen Sie ~1 Zoll der Sonde außerhalb der Haut ungeschnitten.
- Reinigen Sie den Teil der Haut, der die Ein- und Austrittsstellen der Sonde umgibt, mit einem Alkoholtupfer sowie die ~1 Länge der Sonde, die an der weniger geronnenen Stelle verbleibt.
- Lassen Sie den Alkohol auf der Haut trocknen. Fassen Sie dann den Teil der Sonde an, der sich von der Einstichstelle mit dem größeren Gerinnsel erstreckt, gegenüber dem ~1-Zoll-Teil am weniger geronnenen Ende. Ziehen Sie die Sonde langsam in Richtung des größeren Blutgerinnsels.
- Legen Sie sterile Gaze auf alle Blutungen, die durch das Entfernen der Sonde entstehen, und üben Sie Druck aus.
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Representative Results
Acetylcholin-Dosis-Wirkungs-Protokoll
Abbildung 1A zeigt ein Schema mit dem ACh-Dosis-Wirkungs-Protokoll. Abbildung 1B zeigt repräsentative Rückverfolgungen der Erythrozytenflusswerte (Perfusionseinheiten, PU; 30-s-Mittelwerte) aus dem standardisierten ACh-Dosis-Wirkungs-Protokoll für einen Probanden im Zeitverlauf. Abbildung 1C zeigt eine Rohdatendatei eines ACh-Dosis-Wirkungs-Protokolls. Zusätzliche Baseline-Messungen wurden in der Rohdatendatei beibehalten, aber nur ~10 Minuten Baseline wurden für die Datenanalyse verwendet.
Nach Abklingen der Hyperämie und einem stabilen Erythrozytenfluss für 5 Minuten kann mit der 10-minütigen Baseline-Datenerfassung begonnen werden. Die Basislinie wird als relativ stabile horizontale Erythrozytenflusslinie dargestellt, bei der jede Ursache für Abweichungen (z. B. Bewegungsartefakte, Sondenanpassungen) zu Analysezwecken als Kommentar der Datenerfassungssoftware protokolliert werden sollte. Das Dosis-Wirkungs-Protokoll folgt der Ausgangsperiode, und die Spritzen müssen mit jeder Dosis von 10−10 M auf 10−1 M ACh gewechselt werden. Bevor mit der 5-10-minütigen Perfusion jeder Dosis begonnen wird, muss sichergestellt werden, dass der pharmakologische Wirkstoff vollständig durch die Länge der Faser durchblutet ist. In der Datenerfassungssoftware kommt es aufgrund der Perfusion zu einem anfänglichen Anstieg des Erythrozytenflusses, der jedoch nicht in die Analysen einbezogen wird, da die 5-minütige Datenerfassung für diese Konzentration noch nicht begonnen hat. Sobald die Perfusion für jede Dosis begonnen hat, kommt es zu einem kontinuierlichen Anstieg des Erythrozytenflusses bis zu einem Höchststand, gefolgt von einem stetigen Rückgang. Diese krummlinige Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe wird während des gesamten Protokolls repliziert, aber der Erythrozytenfluss wird mit zunehmender Konzentration von ACh relativ größer sein. Bei niedrigeren ACh-Konzentrationen ist die krummlinige Reaktion möglicherweise nicht so ausgeprägt. Beispiele für einen nicht optimalen Erythrozytenfluss sind die folgenden: 1) eine nicht-krummlinige Reaktion, bei der der Erythrozytenfluss nicht ansteigt und auf einem Plateau bleibt, oder 2) steigende ACh-Konzentrationen, die einen minimalen Einfluss auf den Erythrozytenfluss haben, wobei der Erythrozytenfluss nicht relativ mit jeder Konzentration von ACh zunimmt. Dies ist abhängig von der Fragestellung und der zu testenden klinischen Kohorte.
Nach der Endkonzentration von ACh wird das laktierte Ringer-Syndrom perfundiert und die lokalen Erhitzer auf 43 °C erhöht. Während dieser Phase muss ein Plateau erreicht werden, bevor Natrium-Nitroprussid perfundiert wird. Dies kann bis zu ~45 Minuten dauern, abhängig von den zuvor verwendeten Wirkstoffen. Diese Phase ist in den Analysen nicht enthalten. Sobald das Plateau 5 Minuten lang erhalten wurde, wird Natrium-Nitroprussid perfundiert, um eine maximale lokale Vasodilatation zu erreichen. Diese maximale lokale Vasodilatation wird als Anstieg des Erythrozytenflusses dargestellt, bei dem nach ~20 Minuten Perfusion ein Plateau erreicht wird, oder dadurch, dass der Erythrozytenfluss einen Höhepunkt erreicht und unmittelbar danach abnimmt. Sobald ein Plateau oder ein Rückgang des Erythrozytenflusses für Natrium-Nitroprussid erreicht wurde, ist das Protokoll abgeschlossen. Ein häufiges Beispiel für einen nicht optimalen Erythrozytenfluss ist der höchste Wert des Erythrozytenflusses, der in einer anderen Phase des Protokolls (z. B. während des Dosis-Wirkungs-Protokolls) und nicht während der maximalen lokalen Vasodilatation erzielt wird.
Acetylcholin-Dosis-Wirkungs-Protokoll: Hemmung der Stickstoffmonoxid-Synthase
Um den Beitrag von NO zum kutanen Blutfluss als Reaktion auf ACh zu quantifizieren, wird N G-Nitro-L-Argininmethylester (L-NAME), ein NO-Synthase-Inhibitor, in Kombination mit ACh durch einen zusätzlichen Ballaststoff perfundiert. Abbildung 2A zeigt ein Schema, das das ACh-Dosis-Wirkungs-Protokoll mit L-NAME detailliert beschreibt. Abbildung 2B zeigt repräsentative Verfolgungen des Erythrozytenflusses (30-s-Mittelwerte) aus dem standardisierten ACh-Dosis-Wirkungs-Protokoll für einen Probanden über die Zeit mit L-NAME. Abbildung 2C zeigt eine Rohdatendatei eines ACh-Dosis-Wirkungs-Protokolls mit L-NAME. Zusätzliche Baseline-Messungen wurden in der Rohdatendatei beibehalten, aber nur ~10 Minuten Baseline wurden für die Datenanalyse verwendet.
Nach dem Abklingen der Hyperämie, einem stabilen Erythrozytenfluss für 5 Minuten und ausreichender Zeit, um den interessierenden enzymatischen Signalweg (z. B. NO-Synthase) vollständig zu blockieren und/oder ausreichende Konzentrationen von Co-Faktoren zu liefern, kann die 10-minütige Baseline-Datenerfassung beginnen (dargestellt als relativ stabile horizontale Linie). Das Dosis-Wirkungs-Protokoll folgt dem Ausgangswert, und die Spritzen müssen bei jeder Dosis von 1010 M bis 101 M ACh mit dem NO-Synthase-Inhibitor (z. B. 15 mM L-NAME) gewechselt werden. In Gegenwart eines NO-Synthase-Inhibitors wird die krummlinige Antwort erst bei höheren Konzentrationen von ACh gut repliziert. Es wird ein relativ niedrigerer Erythrozytenfluss im Vergleich zu einer Stelle ohne NO-Synthase-Hemmung beobachtet. Ein häufiges Beispiel für einen nicht optimalen Erythrozytenfluss ist die NO-Synthase-Hemmung im Vergleich zu den Bedingungen ohne NO-Synthase-Hemmung, was zu einem höheren Erythrozytenfluss führt. Dies weist darauf hin, dass das Protokoll fehlgeschlagen ist.
Nach Perfusion der Endkonzentration von ACh wird das laktierte Ringer-Syndrom perfundiert und die lokalen Erhitzer auf 43 °C erhöht. Während dieser Phase sollte ein Plateau erreicht werden, bevor Natrium-Nitroprussid perfundiert wird. Diese Phase ist in den Analysen nicht enthalten. Sobald das Plateau 5 Minuten lang erhalten wurde, wird Natrium-Nitroprussid perfundiert, was zu einer maximalen lokalen Vasodilatation führt. Während der maximalen lokalen Vasodilatation kommt es aufgrund der vorherigen NO-Synthase-Hemmung zu einem exponentiellen Anstieg des Erythrozytenflusses. Nach ~20 Minuten Perfusion wird ein Plateau erreicht, oder der Erythrozytenfluss erreicht seinen absoluten Höhepunkt und fällt unmittelbar danach ab. Sobald ein Plateau oder ein Rückgang des Erythrozytenflusses für Natrium-Nitroprussid erreicht wurde, ist das Protokoll abgeschlossen. Ein häufiges Beispiel für einen nicht optimalen Erythrozytenfluss ist die Erzielung des höchsten Erythrozytenflusses in einer anderen Phase des Protokolls (z. B. während des Dosis-Wirkungs-Protokolls) und nicht während der maximalen lokalen Vasodilatation.
Lokales Heizprotokoll
Abbildung 3A zeigt ein Schema mit dem lokalen Heizprotokoll. Abbildung 3B zeigt repräsentative Verfolgungen des Erythrozytenflusses (30-s-Mittelwerte) für das standardisierte lokale Erwärmungsprotokoll für einen Probanden über die Zeit. Abbildung 3C zeigt eine Rohdatendatei eines lokalen Heizprotokolls. Nach dem Abklingen der Hyperämie und einem stabilen Erythrozytenfluss für 5 Minuten kann die 10-minütige Baseline-Datenerfassung beginnen (dargestellt als relativ stabile horizontale Linie). Die lokalen Heizungen sind entweder auf 39 °C oder 42 °C eingestellt, und es kommt zu einer anfänglichen Spitzen- und Nadirreaktion im Erythrozytenfluss. Um den Beitrag von NO zum kutanen Blutfluss als Reaktion auf einen lokalen Wärmereiz zu quantifizieren, wird L-NAME perfundiert, nachdem ein stabiles Plateau im Erythrozytenfluss erreicht wurde. Es wird zu einem raschen Rückgang des Erythrozytenflusses kommen, bis er als Reaktion auf L-NAME ein neues Plateau erreicht. Nach 5 Minuten stabiler Erythrozytenflusswerte wird das laktierte Ringer-Syndrom durchblutet und die lokalen Erhitzer werden auf 43 °C erhöht. Die Erwärmung erzeugt eine zusätzliche Spitzen- und Nadirantwort im Erythrozytenfluss. Während dieser Phase muss sichergestellt werden, dass ein Plateau erreicht wurde, bevor Natrium-Nitroprussid perfundiert wird. Diese Phase ist in den Analysen nicht enthalten. Um eine lokale maximale Vasodilatation zu induzieren, wird Natrium-Nitroprussid perfundiert, und es kommt zu einem schnellen Anstieg des Erythrozytenflusses. Sobald ein Plateau oder eine Abnahme des Erythrozytenflusses als Reaktion auf Natrium-Nitroprussid beobachtet wurde, ist das Protokoll abgeschlossen.
Abbildung 1: Acetylcholin (ACh) Dosis-Wirkungs-Protokoll. (A) Schematische Darstellung eines ACh-Dosis-Wirkungs-Protokolls. (B) Repräsentative Rückverfolgung (30-s-Mittelwerte) eines ACh-Dosis-Wirkungs-Protokolls. (C) Rohdaten eines ACh-Dosis-Wirkungs-Protokolls. Zusätzliche Basismessungen werden in der Rohdatendatei gespeichert, um die Fluktuationen vor der Stabilisierung zu demonstrieren, aber nur ~10 Minuten stabile Ruhedaten wurden für die Datenanalyse verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: ACh-Dosis-Wirkungs-Protokoll mit Stickstoffmonoxid (NO)-Synthase-Hemmung. (A) Schematische Darstellung eines ACh-Dosis-Wirkungs-Protokolls mit NO-Synthase-Hemmung. (B) Repräsentative Rückverfolgung eines ACh-Dosis-Wirkungs-Protokolls mit NO-Synthase-Hemmung. (C) Rohdaten eines ACh-Dosis-Wirkungs-Protokolls ohne Synthase-Hemmung. Zusätzliche Basismessungen werden in der Rohdatendatei gespeichert, um die Fluktuationen vor der Stabilisierung zu demonstrieren, aber nur ~10 Minuten stabile Ruhedaten wurden für die Datenanalyse verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Lokales Heizprotokoll. (A) Schematische Darstellung eines lokalen Heizprotokolls. (B) Repräsentative Rückverfolgung eines lokalen Wärmeprotokolls. (C) Rohdaten eines lokalen Heizprotokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Technik der intradermalen Mikrodialyse ist ein vielseitiges Werkzeug in der menschlichen Gefäßforschung. Die Forscher können das Protokoll ändern, um seine Anwendungen weiter zu diversifizieren. Zum Beispiel beschreiben wir ein ACh-Dosis-Wirkungs-Protokoll, aber andere Untersuchungen zu den Mechanismen der Vasokonstriktion oder des vasomotorischen Tonus haben anstelle der Vasodilatation allein Noradrenalin- oder Natrium-Nitroprussid-Dosis-Wirkungs-Ansätze verwendet 26,27,28,29,30,31. Andere Mediatoren der Vasodilatation, wie Menthol oder Metachlorchlorid, wurden ebenfalls im Dosis-Wirkungs-Protokoll31,32 eingesetzt. Das Dosis-Wirkungs-Protokoll als pharmakologische Beurteilung der Gefäßfunktion ist im Vergleich zum lokalen Heizprotokoll eine gezieltere, mechanistische Technik zur Isolierung spezifischer Signalmechanismen, da es Variationen in der sympathischen Reaktion auf thermische Reize entfernt. Die lokale Erwärmung ist jedoch ein kostengünstiger Ansatz, der einen physiologischen Stimulus nutzt, um die Vasodilatation sowohl über neurogene als auch über endothelabhängige Mechanismen zu induzieren. Es ist auch wichtig, den interessierenden Mechanismus zu berücksichtigen, wenn Sie zwischen einem 39 °C oder 42 °C lokalen Heizprotokoll wählen. Das 39-°C-Protokoll wurde vorgeschlagen, um die NO-vermittelte Vasodilatation besser zu isolieren, während das 42 °C-Protokoll die Untersuchung sowohl der NO-vermittelten Vasodilatation als auch der endothelialen hyperpolarisierenden Faktor-vermittelten Vasodilatation ermöglicht33,34. Darüber hinaus ist der CVC-Anstieg als Reaktion auf eine lokale Erwärmung von 42 °C tendenziell robuster (d. h. er erreicht einen höheren %CVCmax34). Bei der Verwendung eines neuen Wirkstoffs zur Untersuchung eines bestimmten Signalwegs müssen jedoch strenge Methoden angewendet werden, um die Wirksamkeit (d. h. vollständige Blockierung) und/oder die Sättigungskonzentrationen der Co-Faktoren zu bewerten.
Die Endothelfunktion wird häufig mit der flussvermittelten Dilatationstechnik gemessen, aber eine endotheliale Dysfunktion in mikrovaskulären Betten kann vor oder unabhängig von einer endothelialen Dysfunktion in großen Leitungsarterien auftreten, insbesondere bei Pathologien wie HTN 6,7,8. Darüber hinaus erlaubt die flussvermittelte Dilatationstechnik keine pharmakologische Dissektion der Pathophysiologie der endothelialen Dysfunktion isoliert von systemischen Effekten. Andere Methoden zur Untersuchung der mikrovaskulären Endothelfunktion, wie z. B. die Iontophorese oder die postokklusive reaktive Hyperämie, sind nicht in der Lage, die Mechanismen der Endothelfunktion mit pharmakologischer Intervention genau zu beeinflussen12. Daher ermöglicht die intradermale Mikrodialyse auf einzigartige Weise gezielte Untersuchungen der Mechanismen der Gefäßfunktion, und ihr Einsatz kann zusammen mit flussvermittelten Dilatationsergebnissen ein ganzheitlicheres Bild der systemischen Gefäßfunktion liefern.
Unabhängig davon, welcher Ansatz der intradermalen Mikrodialyse verwendet wird, müssen bestimmte Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um die Validität und Reproduzierbarkeit des Ansprechens zu gewährleisten. Während die Besonderheiten des Versuchsprotokolls angepasst werden können, um spezifische Forschungsfragen zu beantworten, ist die präzise Platzierung der Mikrodialysesonde absolut entscheidend. Es muss darauf geachtet werden, die Sonde in die Dermis einzuführen und die größeren sichtbaren oder tastbaren Blutgefäße der Haut zu vermeiden. Die Punktion dieser Gefäße führt zu ungewöhnlich niedrigen Perfusionseinheitswerten; In diesem Fall misst die Laser-Doppler-Flowmetrie die Bildung eines Hämatoms und nicht den Fluss roter Blutkörperchen durch ein intaktes Gefäß. Danach ist der nächste kritischste Schritt dieses Protokolls die Auflösung der hyperämischen Reaktion auf die Nadelpunktion. Wenn die hyperämische Reaktion nicht vollständig abklingen kann, sind die aufgezeichneten Perfusionseinheiten während der Baseline und in den frühen Abschnitten des Protokolls größer als die tatsächlichen Ruhewerte. Wenn eine ausreichende Erholungszeit eingeräumt wurde, die Perfusionseinheiten jedoch ungewöhnlich hoch bleiben, kann eine Neukalibrierung der Sonden erforderlich sein, bevor mit der Phase der Basisdatenerfassung begonnen wird.
Eine Einschränkung der intradermalen Mikrodialysetechnik besteht darin, dass sie einen Gewebetyp nicht spezifisch isolieren kann, um vaskuläre Signalwege zu bewerten. Da die Gefäße der Haut nicht in vivo präpariert und visualisiert werden können, gibt es keine Möglichkeit, sicherzustellen, dass der semipermeable Teil einer Mikrodialysesonde unmittelbar an das interessierende Gewebe (z. B. das vaskuläre Endothel) angrenzt. Daher sind die mit dieser Technik erzielten Ergebnisse repräsentativ für den integrativen Charakter der menschlichen Physiologie und geben Einblicke in die kollektive Funktion der endothelialen und vaskulären glatten Muskulatur und neuronale Einflüsse auf den lokalen Blutfluss. Wenn jedoch ein lokales Heizprotokoll verwendet wird, ermöglicht das Erreichen eines Plateaus des Erythrozytenflusses bei der anfänglichen Erhöhung der Wärme auf 39 °C oder 42 °C die Auflösung des axonalen Reflexes auf die Wärme, was dann eine primär endothelvermittelte Reaktion ermöglicht, wie an anderer Stelle35 diskutiert wird. Eine weitere Einschränkung dieser Technik ist die Verwendung der Laser-Doppler-Flowmetrie als Index des Hautblutflusses. Die Laser-Doppler-Flussmessung quantifiziert den Fluss der roten Blutkörperchen, wobei die Änderungen des Gefäßdurchmessers (d. h. die Erweiterung des Mikrogefäßsystems) nicht berücksichtigt werden, wie es zur Quantifizierung des absoluten Flusses erforderlich wäre. Er kann empfindlich auf Unterschiede zwischen Teilnehmern oder zwischen Bedingungenreagieren 36. Zukünftige Anwendungen der intradermalen Mikrodialyse könnten Techniken zur Quantifizierung des absoluten mikrovaskulären Blutflusses beinhalten. Die jüngste Entwicklung der optischen Kohärenztomographie ermöglicht beispielsweise die Quantifizierung des Gefäßdurchmessers mittels dreidimensionaler Bildgebung des Hautmikrogefäßsystems13. Die Technik der intradermalen Mikrodialyse ist in sehr wenigen, aber wichtigen Fällen kontraindiziert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Teilnehmer mit Hauterkrankungen, Teilnehmer mit Allergien im Zusammenhang mit den hier beschriebenen Substanzen, Teilnehmer mit schwerer Trypanophobie und Teilnehmer mit Tätowierungen, die den gesamten ventralen Aspekt des Unterarms bedecken (aber kleine Tätowierungen in diesem Bereich sind nicht ausgeschlossen).
Die einzigartige Fähigkeit des Mikrodialyseansatzes, bei der Isolierung und Abgrenzung der zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen zu helfen, macht ihn vorteilhaft für die Untersuchung der variablen Ätiologie von HTN und anderen kardiovaskulären Erkrankungen. Nach der Optimierung des Protokolls ermöglicht diese Technik die Bewertung der Wirksamkeit neuartiger kardiovaskulärer Behandlungen. Darüber hinaus bietet die intradermale Mikrodialyse eine Methode zur Bewertung der Off-Target-Effekte hypothetischer, nicht verwandter Pharmakotherapien, was sie zu einem sehr wertvollen Instrument für die Information größerer klinischer Studien macht. Zusammengenommen ist diese Technik ein unschätzbarer Vorteil in der mikrovaskulären Forschung.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte und nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Nichts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
References
- Xu, J. Q., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Arias, E.
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93 (2023).
- Cohuet, G., Struijker-Boudier, H. Mechanisms of target organ damage caused by hypertension: Therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 111 (1), 81-98 (2006).
- Park, K. H., Park, W. J. Endothelial dysfunction: Clinical implications in cardiovascular disease and therapeutic approaches. Journal of Korean Medical Science. 30 (9), 1213-1225 (2015).
- Levy, B. I., Ambrosio, G., Pries, A. R., Struijker-Boudier, H. A. Microcirculation in hypertension: a new target for treatment. Circulation. 104 (6), 735-740 (2001).
- Sara, J. D., et al. Prevalence of coronary microvascular dysfunction among patients with chest pain and nonobstructive coronary artery disease. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Interventions. 8 (11), 1445-1453 (2015).
- Weis, M., Hartmann, A., Olbrich, H. G., Hör, G., Zeiher, A. M. Prognostic significance of coronary flow reserve on left ventricular ejection fraction in cardiac transplant recipients. Transplantation. 65 (1), 103-108 (1998).
- Rossi, M., et al. Investigation of skin vasoreactivity and blood flow oscillations in hypertensive patients: Effect of short-term antihypertensive treatment. Journal of Hypertension. 29 (8), 1569-1576 (2011).
- Pepine, C. J., et al. Coronary microvascular reactivity to adenosine predicts adverse outcome in women evaluated for suspected ischemia results from the National Heart, Lung and Blood Institute WISE (Women's Ischemia Syndrome Evaluation) study. Journal of the American College of Cardiology. 55 (25), 2825-2832 (2010).
- Matsuda, J., et al. Prevalence and clinical significance of discordant changes in fractional and coronary flow reserve after elective percutaneous coronary intervention. Journal of the American Heart Association. 5 (12), e004400 (2016).
- Gupta, A., et al. Integrated noninvasive physiological assessment of coronary circulatory function and impact on cardiovascular mortality in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 136 (24), 2325-2336 (2017).
- Roustit, M., Cracowski, J. L. Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 373-384 (2013).
- Low, D. A., Jones, H., Cable, N. T., Alexander, L. M., Kenney, W. L. Historical reviews of the assessment of human cardiovascular function: interrogation and understanding of the control of skin blood flow. European Journal of Applied Physiology. 120 (1), 1-16 (2020).
- Kenney, W. L., Cannon, J. G., Alexander, L. M. Cutaneous microvascular dysfunction correlates with serum LDL and sLOX-1 receptor concentrations. Microvascular Research. 85, 112-117 (2013).
- Holowatz, L. A., Thompson, C. S., Minson, C. T., Kenney, W. L. Mechanisms of acetylcholine-mediated vasodilatation in young and aged human skin. Journal of Physiology. 563, 965-973 (2005).
- Sokolnicki, L. A., Roberts, S. K., Wilkins, B. W., Basu, A., Charkoudian, N. Contribution of nitric oxide to cutaneous microvascular dilation in individuals with type 2 diabetes mellitus. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 292 (1), E314-E318 (2007).
- DuPont, J. J., Ramick, M. G., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species contribute to impaired cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 306 (12), F1499-F1506 (2014).
- Sprung, V. S., et al. Nitric oxide-mediated cutaneous microvascular function is impaired in polycystic ovary syndrome but can be improved by exercise training. Journal of Physiology. 591 (6), 1475-1487 (2013).
- Greaney, J. L., Saunders, E. F. H., Santhanam, L., Alexander, L. M. Oxidative stress contributes to microvascular endothelial dysfunction in men and women with major depressive disorder. Circulatory Research. 124 (4), 564-574 (2019).
- Stanhewicz, A. E., Jandu, S., Santhanam, L., Alexander, L. M. Increased angiotensin II sensitivity contributes to microvascular dysfunction in women who have had preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 382-389 (2017).
- Greaney, J. L., et al. Impaired hydrogen sulfide-mediated vasodilation contributes to microvascular endothelial dysfunction in hypertensive adults. Hypertension. 69 (5), 902-909 (2017).
- Dillon, G. A., Stanhewicz, A. E., Serviente, C., Greaney, J. L., Alexander, L. M. Hydrogen sulfide-dependent microvascular vasodilation is improved following chronic sulfhydryl-donating antihypertensive pharmacotherapy in adults with hypertension. Journal of Physiology. 321 (4), H728-H734 (2021).
- Wong, B. J., et al. Sensory nerve-mediated and nitric oxide-dependent cutaneous vasodilation in normotensive and prehypertensive non-Hispanic blacks and whites. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (2), H271-H281 (2020).
- Dillon, G. A., Greaney, J. L., Shank, S., Leuenberger, U. A., Alexander, L. M. AHA/ACC-defined stage 1 hypertensive adults do not display cutaneous microvascular endothelial dysfunction. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (3), H539-H546 (2020).
- Gagge, A. P., Stolwijk, J. A., Hardy, J. D. Comfort and thermal sensations and associated physiological responses at various ambient temperatures. Environmental Research. 1 (1), 1-20 (1967).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Lack of limb or sex differences in the cutaneous vascular responses to exogenous norepinephrine. Journal of Applied Physiology. 117 (12), 1417-1423 (2014).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Impaired increases in skin sympathetic nerve activity contribute to age-related decrements in reflex cutaneous vasoconstriction. Journal of Physiology. 593 (9), 2199-2211 (2015).
- Alba, B. K., Greaney, J. L., Ferguson, S. B., Alexander, L. M. Endothelial function is impaired in the cutaneous microcirculation of adults with psoriasis through reductions in nitric oxide-dependent vasodilation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (2), H343-H349 (2018).
- Greaney, J. L., Surachman, A., Saunders, E. F. H., Alexander, L. M., Almeida, D. M. Greater daily psychosocial stress exposure is associated with increased norepinephrine-induced vasoconstriction in young adults. Journal of the American Heart Association. 9 (9), e015697 (2020).
- Nakata, T., et al. Quantification of catecholamine neurotransmitters released from cutaneous vasoconstrictor nerve endings in men with cervical spinal cord injury. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (3), R345-R352 (2023).
- Tucker, M. A., et al. Postsynaptic cutaneous vasodilation and sweating: Influence of adiposity and hydration status. European Journal of Applied Physiology. 118 (8), 1703-1713 (2018).
- Craighead, D. H., Alexander, L. M. Menthol-induced cutaneous vasodilation is preserved in essential hypertensive men and women. American Journal of Hypertension. 30 (12), 1156-1162 (2017).
- Brunt, V. E., Minson, C. T. KCa channels and epoxyeicosatrienoic acids: Major contributors to thermal hyperaemia in human skin. Journal of Physiology. 590 (15), 3523-3534 (2012).
- Choi, P. J., Brunt, V. E., Fujii, N., Minson, C. T. New approach to measure cutaneous microvascular function: An improved test of NO-mediated vasodilation by thermal hyperemia. Journal of Applied Physiology. 117 (3), 277-283 (2014).
- Johnson, J. M., Kellogg, D. L. Jr Local thermal control of the human cutaneous circulation. Journal of Applied Physiology. 109 (4), 1229-1238 (2010).
- Jung, F., et al. Laser Doppler flux measurement for the assessment of cutaneous microcirculation-Critical remarks. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 55 (4), 411-416 (2013).
