Summary
Intradermal mikrodialyse er en minimalt invasiv teknik, der anvendes til at undersøge mikrovaskulær funktion i sundhed og sygdom. Både dosisrespons og lokale opvarmningsprotokoller kan anvendes til denne teknik til at udforske mekanismer for vasodilatation og vasokonstriktion i den kutane cirkulation.
Abstract
Den kutane vaskulatur er et tilgængeligt væv, der kan bruges til at vurdere mikrovaskulær funktion hos mennesker. Intradermal mikrodialyse er en minimalt invasiv teknik, der anvendes til at undersøge mekanismer for vaskulær glat muskulatur og endotelfunktion i den kutane cirkulation. Denne teknik muliggør farmakologisk dissektion af patofysiologien af mikrovaskulær endoteldysfunktion som indekseret ved nedsat nitrogenoxidmedieret vasodilatation, en indikator for risiko for udvikling af hjerte-kar-sygdomme. I denne teknik placeres en mikrodialysesonde i hudens dermale lag, og en lokal varmeenhed med en laser Doppler flowmetrisonde placeres over sonden for at måle strømmen af røde blodlegemer. Den lokale hudtemperatur fastspændes eller stimuleres med direkte varmepåføring, og farmakologiske midler perfuseres gennem sonden for at stimulere eller hæmme intracellulære signalveje for at inducere vasodilatation eller vasokonstriktion eller for at forhøre interessemekanismer (co-faktorer, antioxidanter osv.). Den kutane vaskulære konduktans kvantificeres, og mekanismer for endoteldysfunktion i sygdomstilstande kan afgrænses.
Introduction
Kardiovaskulær sygdom (CVD) er den største dødsårsag i USA1. Hypertension (HTN) er en uafhængig risikofaktor for slagtilfælde, koronar hjertesygdom og hjertesvigt og anslås at påvirke op til ~ 50% af USAs befolkning2. HTN kan udvikle sig som en uafhængig CVD (primær HTN) eller som følge af en anden tilstand, såsom polycystisk nyresygdom og / eller endokrine lidelser (sekundær HTN). Bredden af HTN's ætiologier komplicerer undersøgelser af de underliggende mekanismer og slutorganskader, der observeres med HTN. Der er behov for forskellige og nye forskningsmetoder til patofysiologien af slutorganskader forbundet med HTN.
Et af de tidligste patologiske tegn på CVD er endoteldysfunktion, som karakteriseret ved nedsat nitrogenoxid (NO)-medieret vasodilatation 3,4,5. Flowmedieret dilatation er en almindelig tilgang, der anvendes til at kvantificere endoteldysfunktionen forbundet med CVD, men endoteldysfunktion i mikrovaskulære senge kan være både uafhængig af og forløber for store ledningsarterier 6,7,8. Desuden påvirkes resistensarterioler mere direkte af lokalt væv end ledningsarterier og har mere øjeblikkelig kontrol over leveringen af iltrigt blod. Mikrovaskulær funktion er prædiktiv for uønsket kardiovaskulær hændelsesfri overlevelse 9,10,11. Den kutane mikrovaskulatur er et tilgængeligt vaskulært leje, der kan bruges til at undersøge responser på fysiologiske og farmakologiske vasokonstriktive eller vasodilatoriske stimuli. Intradermal mikrodialyse er en minimalt invasiv teknik, hvis mål er at undersøge mekanismerne for både vaskulær glat muskel og endotelfunktion i den kutane mikrovaskulatur med målrettet farmakologisk dissektion. Denne metode står i kontrast til andre teknikker, såsom postokklusiv reaktiv hyperæmi, som ikke tillader farmakologisk dissektion, og iontoforese, som muliggør farmakologisk levering, men er mindre præcis i sin virkningsmekanisme (gennemgået grundigt andetsteds12).
Begrundelsen for udviklingen og anvendelsen af denne teknik gennemgås udførligt andetsteds13. Denne tilgang blev oprindeligt udviklet til brug i neurologisk forskning hos gnavere og blev derefter først anvendt på mennesker for at undersøge mekanismerne bag aktiv vasodilatation fra et termoregulerende synspunkt. I slutningen af 1990'erne blev denne metode brugt til at undersøge både neurale og endotelmekanismer med hensyn til lokal opvarmning af huden. Siden da er teknikken blevet brugt til at undersøge en række neurovaskulære signalmekanismer i huden.
Ved hjælp af denne teknik har vores gruppe og andre undersøgt mekanismerne for endoteldysfunktion i mikrovaskulaturen hos flere kliniske populationer, herunder, men ikke begrænset til, dyslipidæmi, primær aldring, diabetes, kronisk nyresygdom, polycystisk ovariesyndrom, præeklampsi, større depressiv lidelse 14,15,16,17,18,19 og hypertension 20,21,22,23,24. For eksempel viste en tidligere undersøgelse, at normotensive kvinder med en historie med præeklampsi, som har en øget risiko for CVD, havde reduceret NO-medieret vasodilatation i kutancirkulationen sammenlignet med kvinder med en historie med normotensiv graviditet20. I en anden undersøgelse viste voksne diagnosticeret med primær HTN øget angiotensin II-følsomhed i mikrovaskulaturen sammenlignet med raske kontroller21, og kronisk sulfhydryldonerende antihypertensiv farmakoterapi hos primære HTN-patienter har vist sig at sænke blodtrykket og forbedre både hydrogensulfid- og NO-medieret vasodilatation22. Wong et al.23 fandt nedsat sensorisk medieret og NO-medieret vasodilatation hos præhypertensive voksne, sammenfaldende med vores fund af en progression af endoteldysfunktion med stigende HTN-stadier, som kategoriseret af 2017 American Heart Association og American College of Cardiology retningslinjer24.
Den intradermale mikrodialyseteknik muliggør tæt kontrollerede mekanistiske undersøgelser af mikrovaskulær funktion i sundheds- og sygdomstilstande. Derfor har dette papir til formål at beskrive den intradermale mikrodialyseteknik, som den anvendes af vores gruppe og andre. Vi beskriver procedurerne for både farmakologisk stimulering af endotelet med acetylcholin (ACh) for at undersøge dosis-responsforholdet og fysiologisk stimulering af endogen NO-produktion med enten en 39 °C eller 42 °C lokal opvarmningsstimulusprotokol. Vi præsenterer repræsentative resultater for hver tilgang og diskuterer de kliniske konsekvenser af de fund, der er opstået fra denne teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer er godkendt af Institutional Review Board ved Pennsylvania State University forud for deltagerrekruttering.
1. Opsætning af udstyr
- Tænd for den lokale varmeenhed og laser-Doppler-flowmåleren.
BEMÆRK: Begge skal kalibreres inden dataindsamling i henhold til producentens anvisninger. Doppler-laserflowmåleren skal tilsluttes dataindsamlingshardware med prøveudtagning ved 100 Hz (100 prøver / min) og kontinuerlig optagelse i en dataindsamlingssoftware. Mens anden dataindsamlingshardware og -software kan bruges, afspejler de resterende instruktioner for nemheds skyld PowerLab-hardwaren og LabChart-softwarefunktionerne. - Åbn en LabChart-softwarefil.
BEMÆRK: En referencefil med de ønskede datainput og kontinuerlige dataindsamlingsfunktioner skal laves på forhånd. Der skal være et panel for hver laserdoppler og lokal varmelegeme, der svarer til hvert mikrodialysested, og panelerne skal svare til de relevante kanalindgange i dataopsamlingshardwareenheden.
2. Placering af mikrodialysefiber
- Identificer de store, synlige blodkar i huden i det ventrale aspekt af underarmen, og angiv dem med en permanent markør (brug en tourniquet til at visualisere karrene, hvis det er nødvendigt; identifikation af skibe i mørkt pigmenteret hud kan kræve større afhængighed af palpation).
- Swab området, der omfatter mærkerne og en generøs del af det omkringliggende område ved hjælp af betadinservietter. Tør betadinen væk med spritservietter. Dæk det steriliserede hudområde med en steril gardin, og påfør is i ~ 5 minutter for at bedøve området.
- Fjern isen, og indsæt en introduktionsnål (23 G, 25 mm længde), skrå vendt opad, i hudens dermale lag i en dybde på 2-3 mm (afhængigt af den enkelte hudtykkelse). Skub nålen frem, pas på at forblive i det dermale lag, og gå ud af huden ~ 20 mm fra indsættelsespunktet.
BEMÆRK: For at bekræfte den korrekte dybde af placering i huden skal nålens form være synlig og let håndgribelig, men nålens farve skal skjules. Hvis der kræves mere end en mikrodialysesonde til eksperimentet, skal to introduktionsnåle placeres ≥2,5 cm fra hinanden og placeres inden indsættelse af mikrodialysesonde. Sonder bør ikke placeres langs det samme større fartøj. - Lad kanylen blive siddende, og tilslut sonden (via Luer-låsen) til en sprøjte, der indeholder lakterede Ringers opløsning. Den modsatte ende af sonden føres gennem indledningsnålen, indtil sondens semipermeable membran er nær, men stadig uden for åbningen af indledningsnålen. Langsomt perfuseres en lille mængde af Ringers opløsning gennem fiberen, indtil opløsningen synligt perfuseres gennem membranens porer for at bekræfte membranens integritet.
- Hvis du bruger en Harvard Bioscience mikrodialysesonde og introduktionsnål, skal du følge trin 2.5.1-2.5.2.
- Efter bekræftelse af sondefunktionen føres sonden yderligere gennem indledningsnålen, indtil membranen er helt indeholdt i hudens dermale lag inde i indføringsnålen.
- Brug en finger til at fastgøre sonden på plads proksimal til nålen, og træk nålen i modsat retning fra indsættelsen. Tape den ydre del af fiberen på plads på huden for at forhindre forskydning af den semipermeable membran under eksperimentet.
- Hvis der anvendes en mikrodialysesonde og en introduktionsnål til bioanalytiske systemer, skal du følge trin 2.6.1-2.6.2.
- Når sondefunktionen er bekræftet, skal du tage fat i navet på indføringsnålen og den distale del af mikrodialysesonden i den ene hånd og samtidig trække nålen modsat indsættelsesretningen og flytte mikrodialysesonden på plads.
- Juster sonden efter behov for at sikre, at den semipermeable membran er begravet helt i huden. Tape den eksterne fiber på plads på huden for at forhindre forskydning af den semipermeable membran under eksperimentet.
3. Hyperæmi
- Mens du venter på, at det hyperemiske respons på kanyleindsættelsen skal aftage (~60-90 min), skal du placere engangssprøjten i sprøjteholderbakken på mikroinfusionspumperne. Perfus lakteret Ringers opløsning, saltvand eller vehikel opløsning (den opløsning, hvori det eksperimentelle farmakologiske middel opløses; 2 μL/min) under hyperæmifasen.
BEMÆRK: Mens mikrodialysesonderne ikke kan fjernes i denne ~ 60-90 min fase, kan deltageren justere deres kropsposition eller bevæge hånden, eller sondens Luer-lås kan fjernes fra sprøjten og fastgøres med tape til deltagerens arm for at give dem fri bevægelsesområde til kortvarigt at stå. Når LDF-sonderne først er instrumenteret med lokale varmeapparater og LDF-sonder (laser Doppler flowmetri), og når dataindsamlingen er begyndt, kan LDF-sonderne ikke flyttes. - Når hudens rødme, som er en indikator for det hyperemiske respons på nåletraumer, er aftaget, skal du fastgøre den lokale varmeenhed til huden, der dækker den semipermeable membran via sondeklæbeskiven, og sørg for, at midten af varmelegemet flugter med mikrodialysesondens vej.
- Placer LDF-sonden i åbningen i midten af det lokale varmelegeme, så laseren er direkte vinkelret på hudens overflade. Når LDF-sonderne er placeret og sikret, skal du klikke på start på dataindsamlingssoftwaren for kontinuerligt at registrere og vise de røde blodlegemers fluxværdier (RBC-flux; perfusionsenheder, PU'er). Hvis hyperæmi er helt aftaget, vil RBC-fluxen være stabil ved ~ 5-20 PU (pulsatiliteten af karrene under LDF-sonden kan afspejles ved små stigninger i PU, der falder sammen med hjerteslag).
- Placer en automatisk blodtryksmanchet på armen af et emne, der ikke er instrumenteret.
- Indstil de lokale varmeapparater til 33 °C for at fastspænde hudtemperaturen inden for et termoneutralt område25, hvorved eventuelle variationer i påvirkningen af termiske stimuli fjernes. For at tilføje en kommentar til den kontinuerlige optagelse i dataindsamlingssoftwaren for at angive begivenheder i eksperimentet skal du klikke på tekstfeltet i øverste højre hjørne af skærmen, skrive en kommentar, vælge hvilke kanaler der skal modtage kommentaren og klikke på tilføj.
4. Acetylcholin dosis-respons protokol
- Når RBC-fluxen har stabiliseret sig som reaktion på den lokale varme på 33 °C, skal du begynde baseline-dataindsamlingen, der skelnes i dataindsamlingssoftwarefilen ved en kommentar begynde baseline. Der kræves mindst 5-10 minutters stabil baseline til dataanalyse; genstart grundlinjen når som helst i løbet af dette punkt i dataindsamlingen, hvis det er nødvendigt, og markér dette i LabChart-filen. I det sidste minut af baseline skal du indsamle en blodtryksmåling og indtaste værdierne i en kommentar i LabChart-filen.
- Ved afslutningen af de 5-10 minutters baseline dataindsamling skal du måle og registrere baseline blodtryk og indtaste kommentaren end baseline i dataindsamlingssoftwaren.
- Sluk for mikroinfusionspumperne, og skift sprøjterne fulde af lakterede Ringers opløsning ud med sprøjten fyldt med den laveste koncentration af ACh (10-10 M).
- Fastgør de nye sprøjter på plads, og bekræft perfusionen af væsken gennem sondens ende, før mikroinfusionspumperne tændes igen. Indtast kommentaren begynder -10 i dataindsamlingssoftwareoptagelsen.
- Hver koncentration af ACh vil blive perfuseret i 5-10 minutter ved 2 μL/min. I det sidste minut af perfusion, for hver koncentration, måle og registrere blodtrykket. Når perfusionstiden for en given koncentration er afsluttet, udskiftes sprøjten med den næsthøjeste koncentration (f.eks. udskiftes 10-10 M ACh-opløsning med 10-9 M ACh-opløsning ) som beskrevet i trin 4.2-4.4.
- Umiddelbart efter perfusering af den endelige koncentration af ACh (10-1 M) udskiftes ACh-sprøjten med en, der indeholder Ringers opløsning, og temperaturen ved lokalvarmeren øges til 43 °C. Når RBC-fluxen er stabiliseret, udskiftes Ringers opløsning med natriumnitroprussid (28 mM) for at producere både en varmeinduceret og farmakologisk induceret maksimal lokal vasodilatation. Mål og registrer blodtrykket hvert ~ 3 minut i denne maksimale vasodilatationsfase.
- Når et maksimalt RBC-fluxplateau er opstået (~ 5 min stabil PU), skal du afslutte eksperimentet. Vælg stop i nederste højre hjørne af dataindsamlingssoftwaren for at afslutte den kontinuerlige dataindsamling.
5. Protokol for lokal opvarmning
- Når RBC-fluxen er stabiliseret efter hyperæmi, skal du begynde baseline-dataindsamlingen og angive dette i dataindsamlingssoftwarefilen med en kommentar. I det sidste minut af baseline skal du indsamle en blodtryksmåling og indtaste værdierne i en kommentar i dataindsamlingssoftwarefilen.
- Forøg de lokale varmeapparater til enten 39 °C eller 42 °C, afhængigt af protokollens behov (forklaret i diskussionsafsnittet).
- Når RBC-fluxen er plateauet som reaktion på lokal varmeapplikation (~ 40-60 min opvarmning), perfuseres N G-nitro-l-argininmethylester (L-NAME; 15 mM opløst i Ringers opløsning; 2 μL / min; en NO-syntasehæmmer) gennem mikrodialysesonden (-sonderne).
- Når RBC-fluxen er plateauet som reaktion på L-NAME (~ 15-25 minutters perfusion), øges de lokale varmeapparater til 43 ° C.
- Når RBC-fluxen er plateauet som reaktion på 43 °C (et ~2-5 min plateau opstår efter ~20-45 min opvarmning), perfuseres natriumnitroprussid (28 mM opløst i Ringers opløsning) gennem mikrodialysesonden (-sonderne).
- Når et maksimalt RBC-fluxplateau er opstået (~ 5 min stabil PU), skal du afslutte eksperimentet. Vælg stop i nederste højre hjørne af dataindsamlingssoftwaren for at afslutte dataindsamlingen.
6. Fjernelse af mikrodialysesonderne
- Efter afslutningen af eksperimentet skal du bruge en kirurgisk saks til at skære mikrodialyseproberne. Fjern forsigtigt LDF-sonderne fra varmeapparaterne, og fjern varmelegemerne fra huden. Fjern forsigtigt tapen, der holder sonderne på plads på huden.
- Identificer visuelt, hvilket punkteringssted på hver side af sonden der har dannet den mindste blodprop. Skær den del af sonden nær stedet med den mindre blodprop, og lad ~ 1 ind af sonden uden for huden være uskåret.
- Rens den del af huden, der omgiver sondens ind- og udgangssteder med en alkoholserviet, samt ~ 1 i længden af sonden, der er tilbage på det mindre størknede sted.
- Lad alkoholen tørre på huden. Tag derefter fat i den del af sonden, der strækker sig fra punkteringsstedet med den større blodprop, modsat ~ 1 i del på den mindre størknede ende. Træk langsomt sonden mod den større blodprop.
- Placer sterilt gaze over enhver blødning, der skyldes sondefjernelsen, og påfør tryk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Acetylcholin dosis-respons protokol
Figur 1A viser et skema, der beskriver ACh-dosis-respons-protokollen. Figur 1B illustrerer repræsentative sporinger af RBC-fluxværdierne (perfusionsenheder, PU; 30 s gennemsnit) fra den standardiserede ACh-dosis-responsprotokol for et emne over tid. Figur 1C illustrerer en rå datafil for en ACh-dosis-responsprotokol. Yderligere baseline-målinger blev opretholdt i rådatafilen, men kun ~ 10 min baseline blev brugt til dataanalysen.
Efter hyperæmiopløsning og en stabil RBC-flux i 5 minutter kan dataindsamlingen på 10 minutter begynde. Baseline er afbildet som en relativt stabil vandret RBC-fluxlinje, hvor enhver årsag til afvigelser (f.eks. bevægelsesartefakter, sondejusteringer) skal logges som dataindsamlingssoftwarekommentarer til analyseformål. Dosis-respons-protokollen følger baselineperioden, og sprøjterne skal skiftes med hver dosis, fra 10-10 M til 10-1 M ACh. Før man starter 5-10 minutters perfusion af hver dosis, skal man sikre sig, at det farmakologiske middel er fuldt perfuseret gennem fiberens længde. I dataindsamlingssoftwaren vil der være en indledende stigning i RBC-fluxen på grund af perfusionen, men dette er ikke inkluderet i analyserne, da 5 minutters dataindsamling for denne koncentration ikke er begyndt. Når perfusionen for hver dosis er begyndt, vil der være en kontinuerlig stigning i RBC-fluxen til et højdepunkt, efterfulgt af et støt fald. Dette krøllede respons på farmakologiske midler vil blive replikeret gennem hele protokollen, men RBC-fluxen vil være relativt større med stigende koncentrationer af ACh. Med lavere koncentrationer af ACh er det krøllede respons muligvis ikke så fremtrædende. Eksempler på ikke-optimal RBC-flux omfatter følgende: 1) et ikke-krøllet respons, hvor RBC-fluxen ikke øges og forbliver plateau, eller 2) stigende ACh-koncentrationer, der har en minimal indvirkning på RBC-fluxen, hvor RBC-fluxen ikke stiger relativt med hver koncentration af ACh. Dette afhænger af forskningsspørgsmålet og den kliniske kohorte, der testes.
Efter den endelige koncentration af ACh perfuseres lakterede Ringer's, og de lokale varmeapparater øges til 43 °C. I denne fase skal der opnås et plateau, før natriumnitroprussid perfussides. Dette kan tage op til ~45 min, afhængigt af de tidligere perfuserede midler. Denne fase indgår ikke i analyserne. Når plateauet er opnået i 5 min, perfuseres natriumnitroprussid for at producere maksimal lokal vasodilatation. Denne maksimale lokale vasodilatation er afbildet som en stigning i RBC-fluxen, hvor et plateau opnås efter ~ 20 minutters perfusion, eller ved at RBC-fluxen når et højdepunkt og falder umiddelbart efter. Når der er opnået et plateau eller et fald i RBC-fluxen for natriumnitroprussid, er protokollen komplet. Et almindeligt eksempel på ikke-optimal RBC-flux er den højeste værdi af RBC-flux, der opnås i en anden fase af protokollen (f.eks. Under dosis-respons-protokollen) snarere end under den maksimale lokale vasodilatation.
Acetylcholin dosis-respons protokol: Nitrogenoxidsyntase hæmning
For at kvantificere bidraget fra NO til kutan blodgennemstrømning som reaktion på ACh perfuseres N G-nitro-l-argininmethylester (L-NAME), en NO-syntasehæmmer, i kombination med ACh gennem en yderligere fiber. Figur 2A viser et skema, der beskriver ACh-dosis-respons-protokollen med L-NAME. Figur 2B illustrerer repræsentative sporinger af RBC-fluxen (30 s gennemsnit) fra den standardiserede ACh-dosis-responsprotokol for et emne over tid med L-NAME. Figur 2C illustrerer en rådatafil af en ACh dosis-respons protokol med L-NAME. Yderligere baseline-målinger blev opretholdt i rådatafilen, men kun ~ 10 min baseline blev brugt til dataanalysen.
Efter hyperæmiopløsning, en stabil RBC-flux i 5 minutter og tilstrækkelig tid til fuldt ud at blokere den enzymatiske vej af interesse (f.eks. NO-syntase) og/eller levere tilstrækkelige koncentrationer af co-faktorer, kan 10 minutters baseline-dataindsamling begynde (afbildet som en relativt stabil vandret linje). Dosis-respons-protokollen følger baseline, og sprøjterne skal skiftes med hver dosis startende fra 1010 M til 101 M ACh med NO-syntasehæmmeren (f.eks. 15 mM L-NAVN). I nærvær af en NO-syntasehæmmer replikeres det krøllede respons ikke godt før højere koncentrationer af ACh. En relativt lavere RBC-flux sammenlignet med et sted uden INGEN syntasehæmning vil blive observeret. Et almindeligt eksempel på ikke-optimal RBC-flux er NO-syntasehæmning sammenlignet med betingelserne uden NO-syntasehæmning, hvilket resulterer i en højere RBC-flux. Dette indikerer, at protokollen mislykkedes.
Efter perfusion af den endelige koncentration af ACh perfuseres lakterede Ringer's, og de lokale varmeapparater øges til 43 °C. I denne fase skal der opnås et plateau, før natriumnitroprussid perfussides. Denne fase indgår ikke i analyserne. Når plateauet er opnået i 5 min, perfuseres natriumnitroprussid, hvilket giver maksimal lokal vasodilatation. Under maksimal lokal vasodilatation vil der være en eksponentiel stigning i RBC-fluxen på grund af den tidligere NO-syntasehæmning. Et plateau opnås efter ~ 20 minutters perfusion, eller RBC-fluxen når sit absolutte højdepunkt og falder umiddelbart efter. Når der er opnået et plateau eller et fald i RBC-fluxen for natriumnitroprussid, er protokollen komplet. Et almindeligt eksempel på ikke-optimal RBC-flux er opnåelse af den højeste RBC-fluxværdi i en anden fase af protokollen (f.eks. Under dosis-respons-protokollen) snarere end under den maksimale lokale vasodilatation.
Protokol for lokal opvarmning
Figur 3A viser et skema, der beskriver den lokale opvarmningsprotokol. Figur 3B illustrerer repræsentative sporinger af RBC-fluxen (30 s gennemsnit) for den standardiserede lokale opvarmningsprotokol for et emne over tid. Figur 3C illustrerer en rå datafil for en lokal opvarmningsprotokol. Efter hyperæmiopløsning og en stabil RBC-flux i 5 minutter kan 10 minutters baseline-dataindsamling begynde (afbildet som en relativt stabil vandret linje). De lokale varmeapparater er indstillet til enten 39 °C eller 42 °C, og en indledende top- og nadirrespons vil forekomme i RBC-fluxen. For at kvantificere bidraget fra NO til den kutane blodgennemstrømning som reaktion på en lokal varmestimulus perfuseres L-NAME, efter at der er opnået et stabilt plateau i RBC-fluxen. Der vil være et hurtigt fald i RBC-fluxen, indtil den når et nyt plateau som reaktion på L-NAME. Efter 5 minutters stabile RBC-fluxværdier perfuseres lakterede Ringer's, og de lokale varmeapparater øges til 43 °C. Opvarmningen vil producere en yderligere top og nadir respons i RBC flux. I denne fase skal man sikre sig, at der er opnået et plateau, før natriumnitroprussid perfuseres. Denne fase indgår ikke i analyserne. For at inducere lokal maksimal vasodilatation perfuseres natriumnitroprussid, og en hurtig stigning i RBC-fluxen vil forekomme. Når et plateau eller et fald i RBC-fluxen er blevet observeret som reaktion på natriumnitroprussid, er protokollen komplet.
Figur 1: Acetylcholin (ACh) dosis-respons protokol. (A) Skematisk oversigt over en ACh dosis-respons protokol. B) Repræsentativ sporing (gennemsnit på 30 s) af en ACh-dosis-responsprotokol. C) Rådata for en ACh-dosis-responsprotokol. Yderligere baseline-målinger opretholdes i rådatafilen for at demonstrere udsvingene før stabilisering, men kun ~ 10 minutters stabile hviledata blev brugt til dataanalysen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: ACh-dosis-respons-protokol med nitrogenoxid (NO)-syntasehæmning. (A) Skematisk oversigt over en ACh-dosis-responsprotokol uden syntasehæmning. B) Repræsentativ sporing af en ACh-dosis-respons-protokol uden syntasehæmning. C) Rådata for en ACh-dosis-respons-protokol uden syntasehæmning. Yderligere baseline-målinger opretholdes i rådatafilen for at demonstrere udsvingene før stabilisering, men kun ~ 10 minutters stabile hviledata blev brugt til dataanalysen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Protokol for lokal opvarmning. (A) Skematisk oversigt over en lokal opvarmningsprotokol. B) Repræsentativ sporing af en lokal opvarmningsprotokol. C) Rådata for en lokal opvarmningsprotokol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den intradermale mikrodialyseteknik er et alsidigt værktøj inden for human vaskulær forskning. Efterforskere kan ændre protokollen for yderligere at diversificere dens applikationer. For eksempel beskriver vi en ACh dosis-respons protokol, men andre undersøgelser af mekanismerne for vasokonstriktion eller vasomotorisk tone, snarere end vasodilatation alene, har brugt noradrenalin eller natriumnitroprussid dosis-respons tilgange 26,27,28,29,30,31. Andre mediatorer af vasodilatation, såsom mentol eller metachlorchlorid, er også blevet anvendt i dosis-respons-protokollen31,32. Dosis-respons-protokollen som en farmakologisk vurdering af vaskulær funktion er en mere målrettet, mekanistisk teknik til at isolere specifikke signalmekanismer sammenlignet med den lokale opvarmningsprotokol, da den fjerner variationer i det sympatiske respons på termiske stimuli. Imidlertid er lokal opvarmning en omkostningseffektiv tilgang, der bruger en fysiologisk stimulus til at inducere vasodilatation via både neurogene og endotelafhængige mekanismer. Det er også vigtigt at overveje interessemekanismen, når du vælger mellem en 39 °C eller 42 °C lokal opvarmningsprotokol. 39 °C-protokollen er blevet foreslået for bedre at isolere NO-medieret vasodilatation, mens 42 °C-protokollen muliggør undersøgelse af både NO-medieret vasodilatation og endotelafledt hyperpolariserende faktormedieret vasodilatation33,34. Derudover har CVC-stigningen som reaktion på 42 °C lokal opvarmning tendens til at være mere robust (dvs. nå en højere %CVCmax34). Men når man bruger et nyt middel til at forhøre en bestemt signalvej, skal der anvendes strenge metoder til at evaluere effektiviteten (dvs. fuldt ud blokere) og / eller mætte koncentrationerne af co-faktorerne.
Endotelfunktionen måles ofte ved hjælp af flowmedieret dilatationsteknik, men endoteldysfunktion i mikrovaskulære senge kan forekomme før eller uafhængigt af endoteldysfunktion i store rørarterier, især i patologier som HTN 6,7,8. Desuden tillader den flowmedierede dilatationsteknik ikke den farmakologiske dissektion af patofysiologien af endoteldysfunktion isoleret fra systemiske virkninger. Andre metoder til undersøgelse af mikrovaskulær endotelfunktion, såsom iontoforese eller postokklusiv reaktiv hyperæmi, er ikke i stand til præcist at målrette mekanismerne for endotelfunktion med farmakologisk intervention12. Derfor giver intradermal mikrodialyse entydigt mulighed for målrettede undersøgelser af mekanismerne for vaskulær funktion, og dets anvendelse sammen med flowmedierede dilatationsresultater kan give et mere holistisk billede af systemisk vaskulær funktion.
Uanset hvilken intradermal mikrodialysemetode der anvendes, skal der træffes visse forholdsregler for at sikre responsens validitet og reproducerbarhed. Mens specifikationerne i den eksperimentelle protokol kan justeres for at besvare specifikke forskningsspørgsmål, er den præcise placering af mikrodialysesonden absolut kritisk. Der skal udvises forsigtighed for at indsætte sonden i dermis og undgå de større synlige eller håndgribelige blodkar i huden. Punktering af disse beholdere vil resultere i unormalt lave perfusionsenhedsværdier; i dette tilfælde måler laser Doppler-flowmetrien dannelsen af et hæmatom snarere end strømmen af røde blodlegemer gennem en intakt beholder. Herefter er det næste mest kritiske trin i denne protokol opløsningen af det hyperemiske respons på nålepunkturen. Hvis det hyperemiske respons ikke får lov til at aftage helt, vil de registrerede perfusionsenheder i hele baseline og tidlige dele af protokollen være større end de sande hvileværdier. Hvis der er afsat tilstrækkelig restitutionstid, men perfusionsenhederne forbliver unormalt høje, kan det være nødvendigt at omkalibrere sonderne, inden dataindsamlingsfasen ved baseline påbegyndes.
En begrænsning af den intradermale mikrodialyseteknik er, at den ikke specifikt kan isolere en vævstype for at evaluere vaskulære signalveje. Da hudens kar ikke kan dissekeres og visualiseres in vivo, er der ingen måde at sikre, at den semipermeable del af en mikrodialysesonde er umiddelbart ved siden af det interessante væv (f.eks. Det vaskulære endotel). Derfor er resultaterne opnået ved denne teknik repræsentative for den menneskelige fysiologis integrerende karakter og giver indsigt i den kollektive funktion af endotel, vaskulær glat muskel og neurale påvirkninger på lokal blodgennemstrømning. Hvis der imidlertid anvendes en lokal opvarmningsprotokol, tillader RBC-fluxen at nå et plateau ved den indledende stigning i varmen til 39 °C eller 42 °C opløsningen af den aksonale refleks til varmen, som derefter muliggør en primært endotelmedieret respons, som diskuteret andetsteds35. En yderligere begrænsning af denne teknik er brugen af laser Doppler flowmetri som et indeks for hudens blodgennemstrømning. Laser Doppler flowmetri kvantificerer strømmen af røde blodlegemer, som ikke tager højde for ændringerne i beholderdiameteren (dvs. udvidelse af mikrovaskulaturen), som det ville være nødvendigt for at kvantificere den absolutte strømning. Det kan være følsomt over for forskelle mellem deltagere eller mellem betingelser36. Fremtidige anvendelser af intradermal mikrodialyse kan omfatte teknikker til kvantificering af den absolutte mikrovaskulære blodgennemstrømning. For eksempel muliggør den nylige udvikling af optisk kohærenstomografi kvantificering af beholderdiameteren ved hjælp af tredimensionel billeddannelse af hudens mikrovaskulatur13. Den intradermale mikrodialyseteknik er kontraindiceret i meget få, men vigtige tilfælde, som omfatter, men ikke er begrænset til, deltagere med hudsygdomme, deltagere med allergier relateret til de stoffer, der er beskrevet her, deltagere med svær trypanofobi og deltagere med tatoveringer, der dækker hele det ventrale aspekt af underarmen (men små tatoveringer i dette område er ikke ekskluderende).
Mikrodialysetilgangens unikke evne til at hjælpe med at isolere og afgrænse underliggende patofysiologiske mekanismer gør det fordelagtigt at undersøge HTN's variable ætiologi, blandt andre CVD'er. Efter protokoloptimering giver denne teknik mulighed for at evaluere effekten af nye CVD-behandlinger. Desuden giver intradermal mikrodialyse en metode til vurdering af off-target effekter af hypotetisk uafhængige farmakoterapier, hvilket gør det til et meget værdifuldt værktøj til at informere større kliniske forsøg. Samlet set er denne teknik et uvurderligt aktiv i mikrovaskulær forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter og intet at afsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
References
- Xu, J. Q., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Arias, E.
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93 (2023).
- Cohuet, G., Struijker-Boudier, H. Mechanisms of target organ damage caused by hypertension: Therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 111 (1), 81-98 (2006).
- Park, K. H., Park, W. J. Endothelial dysfunction: Clinical implications in cardiovascular disease and therapeutic approaches. Journal of Korean Medical Science. 30 (9), 1213-1225 (2015).
- Levy, B. I., Ambrosio, G., Pries, A. R., Struijker-Boudier, H. A. Microcirculation in hypertension: a new target for treatment. Circulation. 104 (6), 735-740 (2001).
- Sara, J. D., et al. Prevalence of coronary microvascular dysfunction among patients with chest pain and nonobstructive coronary artery disease. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Interventions. 8 (11), 1445-1453 (2015).
- Weis, M., Hartmann, A., Olbrich, H. G., Hör, G., Zeiher, A. M. Prognostic significance of coronary flow reserve on left ventricular ejection fraction in cardiac transplant recipients. Transplantation. 65 (1), 103-108 (1998).
- Rossi, M., et al. Investigation of skin vasoreactivity and blood flow oscillations in hypertensive patients: Effect of short-term antihypertensive treatment. Journal of Hypertension. 29 (8), 1569-1576 (2011).
- Pepine, C. J., et al. Coronary microvascular reactivity to adenosine predicts adverse outcome in women evaluated for suspected ischemia results from the National Heart, Lung and Blood Institute WISE (Women's Ischemia Syndrome Evaluation) study. Journal of the American College of Cardiology. 55 (25), 2825-2832 (2010).
- Matsuda, J., et al. Prevalence and clinical significance of discordant changes in fractional and coronary flow reserve after elective percutaneous coronary intervention. Journal of the American Heart Association. 5 (12), e004400 (2016).
- Gupta, A., et al. Integrated noninvasive physiological assessment of coronary circulatory function and impact on cardiovascular mortality in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 136 (24), 2325-2336 (2017).
- Roustit, M., Cracowski, J. L. Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 373-384 (2013).
- Low, D. A., Jones, H., Cable, N. T., Alexander, L. M., Kenney, W. L. Historical reviews of the assessment of human cardiovascular function: interrogation and understanding of the control of skin blood flow. European Journal of Applied Physiology. 120 (1), 1-16 (2020).
- Kenney, W. L., Cannon, J. G., Alexander, L. M. Cutaneous microvascular dysfunction correlates with serum LDL and sLOX-1 receptor concentrations. Microvascular Research. 85, 112-117 (2013).
- Holowatz, L. A., Thompson, C. S., Minson, C. T., Kenney, W. L. Mechanisms of acetylcholine-mediated vasodilatation in young and aged human skin. Journal of Physiology. 563, 965-973 (2005).
- Sokolnicki, L. A., Roberts, S. K., Wilkins, B. W., Basu, A., Charkoudian, N. Contribution of nitric oxide to cutaneous microvascular dilation in individuals with type 2 diabetes mellitus. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 292 (1), E314-E318 (2007).
- DuPont, J. J., Ramick, M. G., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species contribute to impaired cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 306 (12), F1499-F1506 (2014).
- Sprung, V. S., et al. Nitric oxide-mediated cutaneous microvascular function is impaired in polycystic ovary syndrome but can be improved by exercise training. Journal of Physiology. 591 (6), 1475-1487 (2013).
- Greaney, J. L., Saunders, E. F. H., Santhanam, L., Alexander, L. M. Oxidative stress contributes to microvascular endothelial dysfunction in men and women with major depressive disorder. Circulatory Research. 124 (4), 564-574 (2019).
- Stanhewicz, A. E., Jandu, S., Santhanam, L., Alexander, L. M. Increased angiotensin II sensitivity contributes to microvascular dysfunction in women who have had preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 382-389 (2017).
- Greaney, J. L., et al. Impaired hydrogen sulfide-mediated vasodilation contributes to microvascular endothelial dysfunction in hypertensive adults. Hypertension. 69 (5), 902-909 (2017).
- Dillon, G. A., Stanhewicz, A. E., Serviente, C., Greaney, J. L., Alexander, L. M. Hydrogen sulfide-dependent microvascular vasodilation is improved following chronic sulfhydryl-donating antihypertensive pharmacotherapy in adults with hypertension. Journal of Physiology. 321 (4), H728-H734 (2021).
- Wong, B. J., et al. Sensory nerve-mediated and nitric oxide-dependent cutaneous vasodilation in normotensive and prehypertensive non-Hispanic blacks and whites. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (2), H271-H281 (2020).
- Dillon, G. A., Greaney, J. L., Shank, S., Leuenberger, U. A., Alexander, L. M. AHA/ACC-defined stage 1 hypertensive adults do not display cutaneous microvascular endothelial dysfunction. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (3), H539-H546 (2020).
- Gagge, A. P., Stolwijk, J. A., Hardy, J. D. Comfort and thermal sensations and associated physiological responses at various ambient temperatures. Environmental Research. 1 (1), 1-20 (1967).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Lack of limb or sex differences in the cutaneous vascular responses to exogenous norepinephrine. Journal of Applied Physiology. 117 (12), 1417-1423 (2014).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Impaired increases in skin sympathetic nerve activity contribute to age-related decrements in reflex cutaneous vasoconstriction. Journal of Physiology. 593 (9), 2199-2211 (2015).
- Alba, B. K., Greaney, J. L., Ferguson, S. B., Alexander, L. M. Endothelial function is impaired in the cutaneous microcirculation of adults with psoriasis through reductions in nitric oxide-dependent vasodilation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (2), H343-H349 (2018).
- Greaney, J. L., Surachman, A., Saunders, E. F. H., Alexander, L. M., Almeida, D. M. Greater daily psychosocial stress exposure is associated with increased norepinephrine-induced vasoconstriction in young adults. Journal of the American Heart Association. 9 (9), e015697 (2020).
- Nakata, T., et al. Quantification of catecholamine neurotransmitters released from cutaneous vasoconstrictor nerve endings in men with cervical spinal cord injury. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (3), R345-R352 (2023).
- Tucker, M. A., et al. Postsynaptic cutaneous vasodilation and sweating: Influence of adiposity and hydration status. European Journal of Applied Physiology. 118 (8), 1703-1713 (2018).
- Craighead, D. H., Alexander, L. M. Menthol-induced cutaneous vasodilation is preserved in essential hypertensive men and women. American Journal of Hypertension. 30 (12), 1156-1162 (2017).
- Brunt, V. E., Minson, C. T. KCa channels and epoxyeicosatrienoic acids: Major contributors to thermal hyperaemia in human skin. Journal of Physiology. 590 (15), 3523-3534 (2012).
- Choi, P. J., Brunt, V. E., Fujii, N., Minson, C. T. New approach to measure cutaneous microvascular function: An improved test of NO-mediated vasodilation by thermal hyperemia. Journal of Applied Physiology. 117 (3), 277-283 (2014).
- Johnson, J. M., Kellogg, D. L. Jr Local thermal control of the human cutaneous circulation. Journal of Applied Physiology. 109 (4), 1229-1238 (2010).
- Jung, F., et al. Laser Doppler flux measurement for the assessment of cutaneous microcirculation-Critical remarks. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 55 (4), 411-416 (2013).
