Summary
皮内微小透析は、健康と疾患における微小血管機能を調査するために使用される低侵襲技術です。この技術には、用量反応と局所加熱の両方のプロトコルを利用して、皮膚循環における血管拡張と血管収縮のメカニズムを調べることができます。
Abstract
皮膚血管系は、ヒトの微小血管機能を評価するために使用できるアクセス可能な組織です。皮内微小透析は、皮膚循環における血管平滑筋および内皮機能のメカニズムを調査するために使用される低侵襲技術です。この技術により、心血管疾患発症リスクの指標である一酸化窒素を介した血管拡張の減少によって指標化された微小血管内皮機能障害の病態生理の薬理学的解剖が可能になります。この技術では、皮膚の真皮層にマイクロ透析プローブを配置し、レーザードップラー流量測定プローブを備えた局所加熱ユニットをプローブの上に配置して、赤血球フラックスを測定します。局所的な皮膚温度を直接加熱してクランプまたは刺激し、薬理学的薬剤をプローブを通して灌流して細胞内シグナル伝達経路を刺激または阻害し、血管拡張または血管収縮を誘発したり、目的のメカニズム(補因子、抗酸化物質など)を調べたりします。皮膚血管コンダクタンスを定量化し、病態における内皮機能障害のメカニズムを明らかにすることができます。
Introduction
心血管疾患(CVD)は、米国における主要な死因です1。高血圧(HTN)は、脳卒中、冠状動脈性心疾患、心不全の独立した危険因子であり、米国人口の~50%以上が罹患していると推定されています2。HTNは、独立したCVD(原発性HTN)として発症することもあれば、多発性嚢胞腎や内分泌障害などの別の疾患の結果として発症することもあります(続発性HTN)。HTNの病因は多岐にわたるため、HTNで観察される根本的なメカニズムと末端臓器の損傷の調査は複雑です。HTNに関連する末端臓器損傷の病態生理学に関する多様で新しい研究アプローチが必要です。
CVDの最も初期の病理学的徴候の1つは、一酸化窒素(NO)を介した血管拡張の障害を特徴とする内皮機能障害です3,4,5。血流媒介性拡張は、CVDに関連する内皮機能障害を定量化するために使用される一般的なアプローチですが、微小血管床の内皮機能障害は、大きな導管動脈の内皮機能障害とは無関係であり、前兆である可能性があります6,7,8。さらに、抵抗細動脈は、導管動脈よりも局所組織によってより直接的に作用し、酸素が豊富な血液の送達をより直接的に制御します。微小血管機能は、有害な心血管イベントフリー生存を予測します9,10,11。皮膚微小血管系は、生理学的および薬理学的血管収縮または血管拡張刺激に対する反応を調べるために使用できるアクセス可能な血管床です。皮内微小透析は低侵襲技術であり、その目的は、標的を絞った薬理学的解剖を用いて、皮膚微小血管系における血管平滑筋と内皮機能の両方のメカニズムを調査することです。この方法は、薬理学的解剖を許さない閉塞後反応性充血や、薬理学的送達を可能にするが作用機序の精度が低いイオントフォレーシスなどの他の技術とは対照的である(他の場所で徹底的にレビューされている12)。
この技術の開発と使用の背後にある理論的根拠は、他の場所で広くレビューされています13。このアプローチは、もともとげっ歯類の神経学的研究で使用するために開発され、その後、体温調節の観点から活発な血管拡張の根底にあるメカニズムを調査するために最初にヒトに適用されました。1990年代後半には、この方法を使用して、皮膚の局所加熱に関する神経および内皮メカニズムの両方を調べました。それ以来、この技術は皮膚の多くの神経血管シグナル伝達メカニズムを調査するために利用されてきました。
この技術を用いて、私たちのグループと他の人は、脂質異常症、原発性老化、糖尿病、慢性腎臓病、多嚢胞性卵巣症候群、子癇前症、大うつ病性障害を含むがこれらに限定されないいくつかの臨床集団の微小血管系における内皮機能障害のメカニズムを調べました14,15,16,17,18,19、および高血圧20,21、22、23、24。例えば、以前の研究では、CVDのリスクが高い子癇前症の既往歴のある正常血圧の女性は、正常血圧妊娠の病歴のある女性と比較して、皮膚循環におけるNO媒介性血管拡張が減少したことがわかりました20。別の研究では、原発性HTNと診断された成人は、健常者と比較して微小血管系におけるアンジオテンシンII感受性の増加を示し21、原発性HTN患者における慢性スルフヒドリル供与降圧薬物療法は、血圧を低下させ、硫化水素とNOを介した血管拡張の両方を改善することが示されています22。Wongら23は、2017年の米国心臓協会および米国心臓病学会のガイドライン24で分類されているように、HTNステージの増加に伴う内皮機能障害の進行の発見と一致して、高血圧症の成人における感覚介在性および非媒介性血管拡張障害を発見しました。
皮内微小透析技術により、健康状態や病態における微小血管機能のメカニズムを厳密に制御することができます。そこで、本稿では、当グループなどが適用している皮内微小透析技術について述べることを目的とする。アセチルコリン(ACh)による内皮の薬理学的刺激の両方の手順を詳述して、用量反応関係と内因性NO産生の生理学的刺激を39°Cまたは42°Cの局所加熱刺激プロトコルで調べます。各アプローチの代表的な結果を提示し、この手法から生じた所見の臨床的意味合いについて説明します。
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Protocol
すべての手順は、参加者の募集前にペンシルベニア州立大学の治験審査委員会によって承認されます。
1. 設備のセットアップ
- 局所加熱ユニットとレーザードップラー流量計をオンにします。
注意: どちらも、製造元の指示に従って、データ収集の前に校正する必要があります。レーザードップラー流量計は、100 Hz(100サンプル/分)でサンプリングし、データ収集ソフトウェアで連続的に記録するデータ収集ハードウェアに接続する必要があります。他のデータ収集ハードウェアやソフトウェアも使用できますが、わかりやすくするために、残りの手順はPowerLabハードウェアとLabChartソフトウェアの機能を反映しています。 - LabChartソフトウェアファイルを開きます。
注:必要なデータ入力と継続的なデータ収集機能を備えた参照ファイルを事前に作成する必要があります。各マイクロダイアリシス部位に対応するレーザードップラーと局所ヒーターごとに1つのパネルが必要であり、パネルはデータ収集ハードウェアユニットの適切なチャンネル入力に対応している必要があります。
2. 微小透析ファイバーの配置
- 前腕の腹側にある皮膚の大きな目に見える血管を特定し、それらを油性マーカーで示します(必要に応じて止血帯を利用して血管を視覚化します;色素沈着の濃い皮膚の血管を特定するには、触診への依存度が高くなる場合があります)。
- ベタジン綿棒を使用して、マークを取り囲む領域と周囲の寛大な部分を綿棒で拭きます。.ベタジンをアルコール綿棒で拭き取ります。皮膚の滅菌領域を滅菌ドレープで覆い、~5分間氷を当てて領域を麻痺させます。.
- 氷を取り除き、イントロデューサー針(23 G、長さ25 mm)を上向きに面取りして、皮膚の真皮層に2〜3 mmの深さで挿入します(個々の皮膚の厚さによって異なります)。真皮層に留まるように注意しながら針を進め、挿入点から~20mm皮膚から出ます。
注意: 皮膚への適切な配置の深さを確認するには、針の形状が見えて簡単に触知できる必要がありますが、針の色は隠す必要があります。実験に複数のマイクロダイアリシスプローブが必要な場合は、マイクロダイアリシスプローブを挿入する前に、任意の2つのイントロデューサー針を≥2.5cm離して配置する必要があります。プローブは、同じ主要な容器に沿って配置しないでください。 - 針を所定の位置に残したまま、プローブを(ルアーロックを介して )授乳リンゲル溶液を含むシリンジに接続します。プローブの半透膜がイントロデューサーニードルの開口部の外側に近づくまで、プローブの反対側の端をイントロデューサーニードルに通します。少量のリンゲル溶液を繊維にゆっくりと灌流し、溶液が膜の細孔から目に見えて灌流されるまで、膜の完全性を確認します。
- ハーバードバイオサイエンスのマイクロダイアリシスプローブとイントロデューサーニードルを使用する場合は、手順2.5.1-2.5.2に従います。
- プローブ機能を確認したら、膜がイントロデューサー針内の皮膚の真皮層に完全に封じ込められるまで、さらにイントロデューサー針を通してプローブを送り込む。
- 指を使用して、プローブを針の近位の位置に固定し、針を挿入とは反対方向に引き出します。実験中の半透膜の変位を防ぐために、繊維の外部部分を皮膚の所定の位置にテープで貼り付けます。
- Bioanalytical Systemsのマイクロダイアリシスプローブとイントロデューサーニードルを使用する場合は、手順2.6.1-2.6.2に従います。
- プローブの機能を確認したら、イントロデューサー針のハブと微小透析プローブの遠位部を片手でつかみ、同時に針を挿入方向と反対に引き抜き、微小透析プローブを所定の位置に移動させます。
- 必要に応じてプローブを調整し、半透膜が皮膚に完全に埋もれていることを確認します。実験中の半透膜の変位を防ぐために、外部繊維を皮膚の所定の位置にテープで貼り付けます。
3.充血
- 針挿入に対する充血反応が治まるのを待っている間(60~90分)、使い捨てシリンジをマイクロインフュージョンポンプのシリンジホルダートレイに入れます。.充血期に乳酸リンゲル溶液、生理食塩水、またはビヒクル溶液(実験薬理剤を溶解した溶液、2 μL / min)を灌流します。.
注:この~60〜90分の段階ではマイクロ透析プローブを取り外すことはできませんが、参加者は体の位置を調整したり、手を動かしたり、プローブのルアーロックをシリンジから取り外してテープで固定したりできます 参加者の腕にテープで固定して、自由な可動域を短時間立たせることができます。局所ヒーターとレーザードップラーフローメトリー(LDF)プローブで計装され、データ収集が開始されると、LDFプローブは移動できません。 - 針外傷に対する充血反応の指標である皮膚の発赤が治まったら、プローブ接着ディスク を介して 半透膜を覆う皮膚に局所加熱ユニットを取り付け、ヒーターの中心がマイクロ透析プローブの経路に揃うようにします。
- LDFプローブをローカルヒーターの中央にある開口部に配置して、レーザーが皮膚の表面に直接垂直になるようにします。LDFプローブを装着して固定したら、データ収集ソフトウェアの [開始 ]をクリックして、赤血球フラックス値(赤血球フラックス、灌流ユニット、PU)を連続的に記録して表示します。充血が完全に治まった場合、赤血球束は5~20PUで安定します(LDFプローブの下の血管の脈動度は、心拍と一致するPUのわずかな上昇によって反映される可能性があります)。
- 自動血圧計を装着していない被験者の腕に自動血圧計を装着する。
- 局所ヒーターを33°Cに設定して、皮膚温度を中性範囲25にクランプし、熱刺激の影響の変動を取り除きます。データ集録ソフトウェアの連続記録にコメントを追加して実験のイベントを示すには、画面右上のテキストボックスをクリックしてコメントを入力し、コメントを受け取るチャンネルを選択して、[ 追加]をクリックします。
4.アセチルコリンの用量反応プロトコル
- 赤血球フラックスが33°Cの局所的な熱に反応して安定したら、ベースラインデータ収集を開始し、データ取得ソフトウェアファイルでベースライン 開始というコメントで区別します。データ分析には、少なくとも5〜10分の安定したベースラインが必要です。必要に応じて、データ収集のこの時点でいつでもベースラインを再開し、LabChartファイルでこれをマークします。ベースラインの最後の1分間に、血圧測定値を収集し、LabChartファイルのコメントに値を入力します。
- ベースラインデータ収集の5〜10分の終わりに、ベースライン血圧を測定して記録し、コメント 終了ベースライン をデータ収集ソフトウェアに入力します。
- マイクロインフュージョンポンプをオフにし、授乳したリンゲル溶液でいっぱいのシリンジを、最低濃度のACh(10〜10 M)で満たされたシリンジと交換します。.
- 新しいシリンジを所定の位置に固定し、プローブの端を通る液体の灌流を確認してから、マイクロインフュージョンポンプを再度オンにします。データ集録ソフトウェアの記録に コメント begin -10 を入力します。
- AChの各濃度は、2μL / minで5〜10分間灌流されます。灌流の最後の1分間に、すべての濃度について、血圧を測定して記録します。所定の濃度の灌流時間が終了したら、ステップ4.2〜4.4で説明したように、シリンジを次に高い濃度と交換します(たとえば、10-10 M ACh溶液を10-9 M ACh溶液と交換します)。
- 最終濃度のACh(10-1 M)を灌流した直後に、AChシリンジをリンゲル溶液を含むシリンジと交換し、局所ヒーター温度を43°Cに上げます。 赤血球フラックスが安定したら、リンゲル溶液をニトロプルシドナトリウム(28 mM)に置き換えて、熱誘発性および薬理学的に誘発される最大局所血管拡張の両方を生成します。この最大血管拡張期の間、~3分ごとに血圧を測定して記録します。.
- 最大赤血球フラックスプラトー(~5分安定PU)が発生したら、実験を終了します。データ集録ソフトウェアの右下隅にある 停止 を選択して、継続的なデータ収集を終了します。
5.局所加熱プロトコル
- 充血後に赤血球束が安定したら、ベースラインデータ収集を開始し、データ集録ソフトウェアファイルにコメントを付けてその旨を記入します。ベースラインの最後の1分間に、血圧測定値を収集し、その値をコメントにデータ集録ソフトウェアファイルに入力します。
- プロトコルのニーズに応じて、局所ヒーターを39°Cまたは42°Cに上げます(ディスカッションセクションで説明)。
- 局所的な熱印加(40~60分の加熱)に反応して赤血球フラックスが頭打ちになったら、 NG-ニトロ-l-アルギニンメチルエステル(L-NAME;リンゲル溶液に溶解した15 mM、2 μL/分、NO合成酵素阻害剤)を微小透析プローブに灌流します。
- L-NAMEに反応して赤血球フラックスが横ばいになったら(~15-25分の灌流)、局所ヒーターを43°Cに上げます。
- 赤血球フラックスが43°Cに反応してプラトー状態になったら(~20〜45分の加熱後に2~5分のプラトーが発生します)、マイクロダイアリシスプローブを介してニトロプルシドナトリウム(リンゲル溶液に溶解した28 mM)を灌流します。
- 最大赤血球フラックスプラトー(~5分安定PU)が発生したら、実験を終了します。データ収集ソフトウェアの右下隅にある 停止 を選択して、データ収集を終了します。
6. 微小透析プローブの取り外し
- 実験終了後、手術用ハサミを使用してマイクロダイアリシスプローブを切断します。LDFプローブをヒーターから慎重に取り外し、ヒーターを皮膚から取り外します。プローブを皮膚の所定の位置に固定しているテープをそっとはがします。
- プローブの両側のどの穿刺部位が最小の血栓を形成したかを視覚的に特定します。小さな血栓のある部位の近くのプローブの部分を切断し、皮膚の外側のプローブの~1インチを切断せずに残します。
- プローブの入口部位と出口部位の周囲の皮膚の部分をアルコール綿棒で洗浄し、凝固の少ない部位に残ったプローブの長さ~1を清掃します。
- アルコールを肌で乾かします。次に、穿刺部位から伸びる血栓の大きい方のプローブの部分を、凝固の少ない方の端の~1の部分の反対側につかみます。プローブをゆっくりと大きな血栓に向かって引きます。
- プローブの取り外しによる出血の上に滅菌ガーゼを置き、圧力をかけます。
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Representative Results
アセチルコリンの用量反応プロトコル
図1A は、AChの用量反応プロトコルを詳述した概略図を示す。 図1B は、1人の被験者の標準化されたACh用量反応プロトコルからの赤血球フラックス値(灌流単位、PU;30秒平均)の経時的な代表的な追跡を示しています。 図1C は、ACh用量反応プロトコルの生データファイルを示す。追加のベースライン測定値は生データファイルに保持されましたが、データ分析にはベースラインの~10分のみが使用されました。
充血が解消し、5分間安定したRBCフラックスが得られた後、10分間のベースラインデータ収集が開始される場合があります。ベースラインは、比較的安定した水平の赤血球フラックス線として描かれており、偏差の原因(動きのアーチファクト、プローブの調整など)は、分析目的でデータ収集ソフトウェアのコメントとして記録する必要があります。用量反応プロトコルはベースライン期間に従い、シリンジは10-10 Mから10-1 M AChまで線量ごとに交換する必要があります。各用量の5〜10分間の灌流を開始する前に、薬理学的薬剤が繊維の長さを通して完全に灌流していることを確認する必要があります。データ収集ソフトウェアでは、灌流による赤血球フラックスの初期上昇がありますが、その濃度の5分間のデータ収集は開始されていないため、これは分析に含まれません。各用量の灌流が始まると、赤血球フラックスはピークまで継続的に増加し、その後着実に減少します。薬理学的薬剤に対するこの曲線反応は、プロトコル全体で再現されますが、赤血球流束は、ACh の濃度が増加するにつれて比較的大きくなります。AChの濃度が低いと、曲線応答はそれほど顕著にならない場合があります。非最適赤血球フラックスの例には、1)赤血球フラックスが増加せず、横ばいのままである非曲線応答、または2)赤血球フラックスへの影響が最小限に抑えられ、赤血球フラックスがAChの各濃度で相対的に増加しないACh濃度の増加が含まれます。これは、研究課題とテストされる臨床コホートによって異なります。
AChの最終濃度に続いて、乳酸リンゲルを灌流し、局所ヒーターを43°Cに上げます。 この段階では、ニトロプルシドナトリウムが灌流される前にプラトーを取得する必要があります。.これには、灌流された以前の薬剤に応じて、最大~45分かかる場合があります。.このフェーズは分析に含まれません。プラトーが5分間得られたら、ニトロプルシドナトリウムを灌流して、最大の局所血管拡張を引き起こします。.この最大の局所血管拡張は、赤血球フラックスの上昇として描かれ、灌流の~20分後にプラトーが得られるか、赤血球フラックスがピークに達し、直後に減少することによって表されます。ニトロプルシドナトリウムの赤血球フラックスのプラトーまたは低下が得られると、プロトコルは完了です。非最適赤血球フラックスの一般的な例は、最大局所血管拡張中ではなく、プロトコルの異なる段階(例、用量反応プロトコル中)で得られた赤血球フラックスの最高値です。
アセチルコリンの用量応答のプロトコル: 一酸化窒素のシンターゼの阻止
AChに応答する皮膚血流に対するNOの寄与を定量化するために、NO合成酵素阻害剤であるNG-ニトロ-l-アルギニンメチルエステル(L-NAME)を、追加のファイバーを介してAChと組み合わせて灌流します。 図2A は、L-NAMEを用いたACh用量反応プロトコルを詳述した概略図を示しています。 図 2B は、L-NAME を使用した 1 人の被験者の標準化された ACh 用量反応プロトコルからの RBC フラックス (平均 30 秒) の代表的なトレースを示しています。 図2C は、L-NAMEを用いたACh用量反応プロトコルの生データファイルを示しています。追加のベースライン測定値は生データファイルに保持されましたが、データ分析にはベースラインの~10分のみが使用されました。
充血の解消、5分間の安定したRBCフラックス、および目的の酵素経路(例:NO合成酵素)を完全にブロックするのに十分な時間、および/または適切な濃度の補因子を送達した後、10分間のベースラインデータ収集が開始される場合があります(比較的安定した水平線として示されています)。用量反応プロトコルはベースラインに従い、シリンジは、NO合成酵素阻害剤(例:.、15 mM L-NAME)を使用して、1010 Mから101 M AChまでの用量ごとに交換する必要があります。.NO合成酵素阻害剤の存在下では、曲線応答はAChの濃度が高くなるまで十分に再現されません。NO合成酵素阻害のない部位と比較して、比較的低いRBCフラックスが観察されます。最適でない赤血球フラックスの一般的な例は、NO合成酵素阻害を伴わない条件と比較して、NO合成酵素阻害であり、その結果、赤血球フラックスが高くなります。これは、プロトコルが失敗したことを示します。
最終濃度のAChを灌流した後、授乳中のリンゲル病を灌流し、局所ヒーターを43°Cに上げます。 この段階では、ニトロプルシドナトリウムが灌流される前にプラトーを得る必要があります。.このフェーズは分析に含まれません。プラトーが5分間得られると、ニトロプルシドナトリウムが灌流され、最大の局所血管拡張が生じます。局所血管拡張が最大になると、以前のNO合成酵素阻害により、赤血球フラックスが指数関数的に上昇します。プラトーは灌流の~20分後に得られます、または赤血球フラックスは絶対ピークに達し、直後に減少します。ニトロプルシドナトリウムの赤血球フラックスのプラトーまたは低下が得られると、プロトコルは完了です。最適でない赤血球フラックスの一般的な例は、最大局所血管拡張中ではなく、プロトコルの異なる段階(例、用量反応プロトコル中)で最も高い赤血球フラックス値を得ることです。
局所加熱プロトコル
図3A は、局所加熱プロトコルを詳述した概略図を示しています。 図 3B は、1 人の被験者の標準化された局所加熱プロトコルの RBC フラックス (平均 30 秒) の経時的な代表的なトレースを示しています。 図3C は、局所加熱プロトコルの生データファイルを示しています。充血が解消し、5分間安定した赤血球フラックスが得られた後、10分間のベースラインデータ収集が開始されます(比較的安定した水平線として示されています)。局所ヒーターは39°Cまたは42°Cに設定され、赤血球フラックスで初期ピークと直下応答が発生します。局所的な熱刺激に応答する皮膚血流へのNOの寄与を定量化するために、L-NAMEは、赤血球フラックスの安定したプラトーが達成された後に灌流されます。赤血球フラックスは、L-NAMEに反応して新たなプラトーに達するまで、急速に減少するでしょう。安定した赤血球フラックス値を5分間放置した後、授乳中のリンゲルを灌流し、局所ヒーターを43°Cに上げます。 加熱により、赤血球フラックスに追加のピーク応答と直下応答が生成されます。この段階では、ニトロプルシドナトリウムが灌流される前にプラトーが得られていることを確認する必要があります。.このフェーズは分析に含まれません。局所的な最大血管拡張を誘発するために、ニトロプルシドナトリウムが灌流され、赤血球フラックスが急速に増加します。.ニトロプルシドナトリウムに反応して赤血球フラックスのプラトーまたは低下が観察されると、プロトコルは完了です。
図1:アセチルコリン(ACh)用量反応プロトコル。 (A)ACh用量反応プロトコルの概略図。(B)ACh用量反応プロトコルの代表的なトレース(平均30秒)。(C)ACh用量反応プロトコルの生データ。安定化前の変動を実証するために、追加のベースライン測定値が生データファイルに保持されますが、データ分析には~10分間の安定した安静時データのみが利用されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:一酸化窒素(NO)合成酵素阻害を伴うACh用量応答プロトコル。 (A)NO合成酵素阻害を伴うACh用量応答プロトコルの概略図。(B)NO合成酵素阻害を伴うACh用量反応プロトコルの代表的なトレース。(C)NO合成酵素阻害を伴うACh用量反応プロトコルの生データ。安定化前の変動を実証するために、追加のベースライン測定値が生データファイルに保持されますが、データ分析には~10分間の安定した安静時データのみが利用されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:局所加熱プロトコル。 (A)局所加熱プロトコルの概略図。(B)局所加熱プロトコルの代表的なトレース。(C)局所加熱プロトコルの生データ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
皮内微小透析技術は、ヒト血管研究における汎用性の高いツールです。研究者は、プロトコルを変更して、その用途をさらに多様化することができます。たとえば、ACh用量反応プロトコルについて説明しますが、血管拡張のみではなく、血管収縮または血管運動緊張のメカニズムに関する他の調査では、ノルエピネフリンまたはニトロプルシドナトリウムの用量反応アプローチが利用されています26,27,28,29,30,31。メントールや塩化メタ塩素などの血管拡張の他のメディエーターも、用量反応プロトコルで採用されています31,32。血管機能の薬理学的評価としての用量反応プロトコルは、熱刺激に対する交感神経反応の変動を除去するため、局所加熱プロトコルと比較して特定のシグナル伝達メカニズムを分離するための、より的を絞ったメカニズム的な手法です。ただし、局所加熱は、生理学的刺激を使用して、神経原性および内皮依存性の両方のメカニズムを介して血管拡張を誘導する費用対効果の高いアプローチです。また、39°Cまたは42°Cの局所加熱プロトコルを選択する際には、対象となるメカニズムを考慮することも重要です。39°Cプロトコルは、NO媒介性血管拡張をよりよく分離することが示唆されているが、42°Cプロトコルは、NO媒介性血管拡張と内皮由来の過分極因子媒介性血管拡張の両方の調査を可能にする33,34。さらに、42°Cの局所加熱に応答するCVCの増加は、より頑健になる傾向があります(つまり、より高い%CVC最大34に達します)。ただし、新しい薬剤を使用して特定のシグナル伝達経路を調べる場合は、補因子の有効性(つまり、完全にブロック)および/または飽和濃度を評価するために厳密な方法を採用する必要があります。
内皮機能は、多くの場合、フロー媒介拡張技術を使用して測定されますが、微小血管床の内皮機能障害は、特にHTN 6,7,8などの病状において、太い導管動脈の内皮機能障害に先立って、またはそれとは無関係に発生する可能性があります。さらに、フロー媒介拡張技術では、全身効果から分離して内皮機能障害の病態生理学の薬理学的解剖を行うことはできません。イオントフォレーシスや閉塞後の反応性充血など、微小血管内皮機能を調査する他の方法は、薬理学的介入で内皮機能のメカニズムを正確に標的にすることはできません12。したがって、皮内微小透析は、血管機能のメカニズムに的を絞った調査を独自に可能にし、その使用は、フローを介した拡張の結果とともに、全身血管機能のより全体的な全体像を提供する可能性があります。
皮内微小透析アプローチを利用するにしても、反応の妥当性と再現性を確保するために、特定の予防措置を講じる必要があります。.実験プロトコルの詳細は、特定の研究課題に答えるために調整できますが、マイクロダイアリシスプローブの正確な配置は絶対に重要です。プローブを真皮に挿入し、皮膚の大きな目に見える血管または触知可能な血管を避けるように注意する必要があります。これらの血管に穴を開けると、灌流単位値が異常に低くなります。この場合、レーザードップラー流量測定は、無傷の血管を通る赤血球の流れではなく、血腫の形成を測定します。この後、このプロトコルの次の最も重要なステップは、針穿刺に対する充血反応の解決です。充血反応が完全に治まらない場合、ベースラインおよびプロトコルの初期部分全体で記録された灌流単位は、真の安静時値よりも大きくなります。十分な回復時間が許可されているにもかかわらず、灌流ユニットが異常に高いままの場合は、ベースラインデータ収集フェーズを開始する前にプローブの再校正が必要になる場合があります。
皮内微小透析技術の限界は、血管シグナル伝達経路を評価するために組織タイプを特異的に分離できないことです。皮膚の血管をin vivoで解剖して可視化することはできないため、マイクロダイアリシスプローブの半透性部分が目的の組織(血管内皮など)にすぐ隣接していることを確認する方法はありません。したがって、この技術から得られた結果は、人間の生理学の統合的性質を代表しており、内皮、血管平滑筋、および局所血流に対する神経の影響の集合的機能に関する洞察を提供します。しかし、局所加熱プロトコルを使用する場合、39°Cまたは42°Cへの熱の最初の上昇時に赤血球フラックスがプラトーに達することを許容すると、熱に対する軸索反射の分解が可能になり、他の場所で議論されているように、主に内皮を介した応答が可能になります35。この技術の追加の制限は、皮膚血流の指標としてレーザードップラー流量測定を使用することです。レーザードップラー流量測定は、赤血球フラックスを定量化しますが、絶対流量を定量化するために必要な血管径の変化(すなわち、微小血管系の拡張)は考慮されません。参加者間または条件間の違いに敏感である可能性があります36。皮内微小透析の将来のアプリケーションには、絶対微小血管血流を定量化する技術が組み込まれる可能性があります。例えば、光干渉断層撮影法の最近の開発は、皮膚微小血管系の3次元イメージングを用いて血管径の定量化を可能にする13。皮内微小透析技術は、皮膚疾患のある参加者、ここに記載されている物質に関連するアレルギーのある参加者、重度のトリパノフォビアの参加者、および前腕の腹側全体を覆う入れ墨のある参加者を含むがこれらに限定されない、非常に少数ですが重要な例では禁忌です(ただし、この領域の小さな入れ墨は除外されません)。
マイクロダイアリシスアプローチは、根底にある病態生理学的メカニズムの分離と描写を支援する独自の能力を備えているため、他のCVDの中でも特にHTNのさまざまな病因を調査するのに有利です。プロトコルの最適化に続いて、この手法により、新しいCVD治療の有効性を評価することができます。さらに、皮内微小透析は、仮想的に無関係な薬物療法のオフターゲット効果を評価する方法を提供し、より大規模な臨床試験に情報を提供するための非常に価値のあるツールとなっています。まとめると、この技術は微小血管研究において非常に貴重な資産です。
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Disclosures
著者には利益相反はなく、開示するものは何もありません。
Acknowledgments
何一つ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
References
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