Summary
Intradermal mikrodialyse er en minimalt invasiv teknikk som brukes til å undersøke mikrovaskulær funksjon i helse og sykdom. Både dose-respons og lokale oppvarmingsprotokoller kan benyttes for denne teknikken for å utforske mekanismer for vasodilatasjon og vasokonstriksjon i den kutane sirkulasjonen.
Abstract
Kutan vaskulatur er et tilgjengelig vev som kan brukes til å vurdere mikrovaskulær funksjon hos mennesker. Intradermal mikrodialyse er en minimalt invasiv teknikk som brukes til å undersøke mekanismer for vaskulær glatt muskulatur og endotelfunksjon i kutan sirkulasjon. Denne teknikken tillater farmakologisk disseksjon av patofysiologien ved mikrovaskulær endoteldysfunksjon som indeksert ved redusert nitrogenoksidmediert vasodilatasjon, en indikator på kardiovaskulær sykdomsutviklingsrisiko. I denne teknikken plasseres en mikrodialysesonde i det dermale laget av huden, og en lokal varmeenhet med en laserdoppler-strømningsmetrisonde plasseres over sonden for å måle fluksen av røde blodlegemer. Den lokale hudtemperaturen klemmes eller stimuleres med direkte varmepåføring, og farmakologiske midler perfuseres gjennom sonden for å stimulere eller hemme intracellulære signalveier for å indusere vasodilatasjon eller vasokonstriksjon eller for å forhøre mekanismer av interesse (kofaktorer, antioksidanter, etc.). Den kutane vaskulære konduktansen kvantifiseres, og mekanismer for endoteldysfunksjon i sykdomstilstander kan avgrenses.
Introduction
Kardiovaskulær sykdom (CVD) er den ledende dødsårsaken i USA1. Hypertensjon (HTN) er en uavhengig risikofaktor for hjerneslag, koronar hjertesykdom og hjertesvikt og anslås å påvirke oppover på ~ 50% av USAs befolkning2. HTN kan utvikle seg som en uavhengig CVD (primær HTN) eller som et resultat av en annen tilstand, for eksempel polycystisk nyresykdom og / eller endokrine lidelser (sekundær HTN). Bredden av etiologier av HTN kompliserer undersøkelser av de underliggende mekanismene og endeorganskader observert med HTN. Ulike og nye forskningsmetoder i patofysiologien til endeorganskaden forbundet med HTN er nødvendig.
Et av de tidligste patologiske tegnene på CVD er endoteldysfunksjon, som preget av nedsatt nitrogenoksid (NO) -mediert vasodilatasjon 3,4,5. Flow-mediert dilatasjon er en vanlig tilnærming som brukes til å kvantifisere endoteldysfunksjon assosiert med CVD, men endoteldysfunksjon i mikrovaskulære senger kan være både uavhengig av og forløper til den for store kanalarterier 6,7,8. Videre påvirkes resistensarterioler mer direkte av lokalt vev enn kanalarterier og har mer umiddelbar kontroll over levering av oksygenrikt blod. Mikrovaskulær funksjon prediktiv for uønsket kardiovaskulær hendelsesfri overlevelse 9,10,11. Kutan mikrovaskulatur er en tilgjengelig vaskulær seng som kan brukes til å undersøke responser på fysiologiske og farmakologiske vasokonstriktive eller vasodilatoriske stimuli. Intradermal mikrodialyse er en minimalt invasiv teknikk, hvis mål er å undersøke mekanismene for både vaskulær glatt muskulatur og endotelfunksjon i kutan mikrovaskulatur med målrettet farmakologisk disseksjon. Denne metoden står i kontrast til andre teknikker, som postokklusiv reaktiv hyperemi, som ikke tillater farmakologisk disseksjon, og iontoforese, som muliggjør farmakologisk levering, men er mindre presis i virkningsmekanismen (grundig gjennomgått andre steder12).
Begrunnelsen for utvikling og bruk av denne teknikken er grundig gjennomgått andre steder13. Denne tilnærmingen ble opprinnelig utviklet for bruk i nevrologisk forskning hos gnagere og ble deretter først brukt på mennesker for å undersøke mekanismene som ligger til grunn for aktiv vasodilatasjon fra et termoregulerende synspunkt. På slutten av 1990-tallet ble denne metoden brukt til å undersøke både nevrale og endoteliale mekanismer med hensyn til lokal oppvarming av huden. Siden den gang har teknikken blitt brukt til å undersøke en rekke nevrovaskulære signalmekanismer i huden.
Ved hjelp av denne teknikken har vår gruppe og andre forhørt mekanismene for endoteldysfunksjon i mikrovaskulaturen til flere kliniske populasjoner, inkludert, men ikke begrenset til, dyslipidemi, primær aldring, diabetes, kronisk nyresykdom, polycystisk ovariesyndrom, preeklampsi, alvorlig depressiv lidelse 14,15,16,17,18,19 og hypertensjon 20,21,22,23,24. For eksempel fant en tidligere studie at normotensive kvinner med en historie med preeklampsi, som har økt risiko for CVD, hadde redusert NO-mediert vasodilatasjon i kutan sirkulasjon sammenlignet med kvinner med en historie med normotensiv graviditet20. I en annen studie viste voksne diagnostisert med primær HTN økt angiotensin II-følsomhet i mikrovaskulaturen sammenlignet med friske kontroller21, og kronisk sulfhydryldonerende antihypertensiv farmakoterapi hos primære HTN-pasienter har vist seg å redusere blodtrykket og forbedre både hydrogensulfid- og NO-mediert vasodilatasjon22. Wong et al.23 fant nedsatt sensorisk mediert og NO-mediert vasodilatasjon hos prehypertensive voksne, sammenfallende med vårt funn av en progresjon av endoteldysfunksjon med økende HTN-stadier, som kategorisert av 2017 American Heart Association og American College of Cardiology retningslinjer24.
Den intradermale mikrodialyseteknikken muliggjør tett kontrollerte mekanistiske undersøkelser av mikrovaskulær funksjon i helse- og sykdomstilstander. Derfor har dette papiret som mål å beskrive den intradermale mikrodialyseteknikken som brukes av vår gruppe og andre. Vi beskriver prosedyrene for både farmakologisk stimulering av endotelet med acetylkolin (ACh) for å undersøke dose-responsforholdet og fysiologisk stimulering av endogen NO-produksjon med enten 39 °C eller 42 °C lokal oppvarmingsstimulusprotokoll. Vi presenterer representative resultater for hver tilnærming og diskuterer de kliniske implikasjonene av funnene som har oppstått fra denne teknikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer er godkjent av Institutional Review Board ved Pennsylvania State University før deltakerrekruttering.
1. Oppsett av utstyr
- Slå på den lokale varmeenheten og laserdoppler-mengdemåleren.
MERK: Begge bør kalibreres før datainnsamling i henhold til produsentens instruksjoner. Laserdopplermengdemåleren skal kobles til datainnsamlingsmaskinvare med prøvetaking ved 100 Hz (100 prøver/min) og kontinuerlig opptak i en datainnsamlingsprogramvare. Mens annen maskinvare og programvare for datainnsamling kan brukes, gjenspeiler de gjenværende instruksjonene for enkelhets skyld PowerLab-maskinvaren og LabChart-programvarefunksjonene. - Åpne en LabChart programvarefil.
MERK: En referansefil med ønsket datainngang og kontinuerlig datainnsamling bør gjøres på forhånd. Det skal være ett panel for hver laserdoppler og lokal varmeapparat som tilsvarer hvert mikrodialysested, og panelene skal tilsvare de aktuelle kanalinngangene i datainnsamlingsmaskinvareenheten.
2. Plassering av mikrodialysefiber
- Identifiser de store, synlige blodkarene i huden i det ventrale aspektet av underarmen, og angi dem med en permanent markør (bruk en turniquet for å visualisere karene om nødvendig; identifisering av kar i mørkt pigmentert hud kan kreve større tillit til palpasjon).
- Vattpinne området som omfatter merkene og en sjenerøs del av det omkringliggende området ved hjelp av betadinpinner. Tørk bort betadinen med spritservietter. Dekk det steriliserte hudområdet med en steril drapering, og påfør is i ~ 5 min for å dumpe området.
- Fjern isen, og sett inn en introduksjonsnål (23 G, 25 mm lengde), skrått vendt oppover, inn i hudlaget på en dybde på 2-3 mm (avhengig av den individuelle hudtykkelsen). Advance nålen, pass på å forbli i dermal laget, og gå ut huden ~ 20 mm fra punktet for innsetting.
MERK: For å bekrefte riktig dybde av plassering i huden, bør formen på nålen være synlig og lett palpabel, men fargen på nålen skal være skjult. Hvis mer enn én mikrodialysesonde er nødvendig for forsøket, må to introduksjonsnåler plasseres ≥2,5 cm fra hverandre og plasseres før mikrodialysesonden settes inn. Sonder skal ikke plasseres langs samme store fartøy. - La kanylen være på plass, koble sonden (via Luer-låsen) til en sprøyte som inneholder laktert Ringer-oppløsning. Før den motsatte enden av sonden gjennom introduksjonsnålen til sondens semipermeable membran er nær, men fortsatt utenfor åpningen av introduksjonsnålen. Perfus sakte en liten mengde Ringers løsning gjennom fiberen til løsningen er synlig perfusert gjennom porene i membranen for å bekrefte membranets integritet.
- Hvis du bruker en Harvard Bioscience mikrodialysesonde og introduksjonsnål, følg trinn 2.5.1-2.5.2.
- Ved bekreftelse av sondefunksjonen, mate sonden videre gjennom introduksjonsnålen til membranen er helt inneholdt i det dermale laget av huden i introduksjonsnålen.
- Bruk en finger til å feste sonden på plass proksimalt for nålen, og trekk nålen i motsatt retning ut av innsettingen. Teip den ytre delen av fiberen på plass på huden for å forhindre forskyvning av den semipermeable membranen under forsøket.
- Hvis du bruker en mikrodialysesonde og introduksjonsnål for bioanalytiske systemer, følg trinn 2.6.1-2.6.2.
- Når sondefunksjonen er bekreftet, tar du tak i navet på introduksjonsnålen og den distale delen av mikrodialysesonden i den ene hånden, og trekker samtidig nålen motsatt av innføringsretningen, og flytter mikrodialysesonden på plass.
- Juster sonden etter behov for å sikre at den semipermeable membranen er begravet i huden helt. Teip den eksterne fiberen på plass på huden for å forhindre forskyvning av den semipermeable membranen under forsøket.
3. Hyperemi
- Mens du venter på at den hyperemiske responsen på nålestikk skal avta (~60-90 min), plasser engangssprøyten i sprøyteholderbrettet på mikroinfusjonspumpene. Perfuse laktert Ringers løsning, saltvann eller kjøretøyløsning (løsningen der det eksperimentelle farmakologiske middelet er oppløst; 2 μL / min) under hyperemifasen.
MERK: Mens mikrodialyseprobene ikke kan fjernes i løpet av denne ~ 60-90 min fasen, kan deltakeren justere kroppsposisjonen eller bevege hånden, eller sondens Luer-lås kan fjernes fra sprøyten og festes med tape til deltakerens arm for å gi dem fritt bevegelsesområde for å stå kort. Når de er instrumentert med lokale varmeovner og laser Doppler flowmetry (LDF) sonder, og når datainnsamlingen har begynt, kan LDF-sondene ikke flyttes. - Når hudrødheten, som er en indikator på den hyperemiske responsen på nåltraumer, har avtatt, fest den lokale varmeenheten til huden som dekker den semipermeable membranen via sondeskiven, og sørg for at midten av varmeren stemmer overens med banen til mikrodialysesonden.
- Plasser LDF-sonden i åpningen i midten av den lokale varmeren slik at laseren er direkte vinkelrett på overflaten av huden. Når LDF-sondene er plassert og sikret, klikker du på start på datainnsamlingsprogramvaren for kontinuerlig å registrere og vise de røde blodlegemenes fluksverdier (RBC-fluks; perfusjonsenheter, PUer). Hvis hyperemi har gått helt ned, vil RBC-fluksen være stabil ved ~ 5-20 PU (pulsatiliteten til karene under LDF-sonden kan reflekteres av små forhøyninger i PU som sammenfaller med hjerteslagene).
- Plasser en automatisk blodtrykksmansjett på armen til et motiv som ikke er instrumentert.
- Sett de lokale ovnene på 33 °C for å klemme hudtemperaturen innenfor et termonøytralt område25, og dermed fjerne eventuelle variasjoner i påvirkning av termiske stimuli. Hvis du vil legge til en kommentar til det kontinuerlige opptaket i datainnsamlingsprogramvaren for å angi hendelser i eksperimentet, klikker du på tekstboksen øverst til høyre på skjermen, skriver inn en kommentar, velger hvilke kanaler som skal motta kommentaren, og klikker på legg til.
4. Acetylkolin dose-respons protokoll
- Når RBC-fluksen har stabilisert seg som respons på 33 °C lokal varme, begynner baseline datainnsamling, skilt i datainnsamlingsprogramvarefilen ved en kommentar begynne baseline. Minst 5-10 min stabil grunnlinje er nødvendig for dataanalyse; Start grunnlinjen på nytt når som helst i løpet av dette punktet i datainnsamlingen om nødvendig, og merk dette i LabChart-filen. I det siste minuttet av baseline samler du inn en blodtrykksmåling og skriver inn verdiene i en kommentar i LabChart-filen.
- På slutten av 5-10 min av baseline datainnsamling, måle og registrere baseline blodtrykk, og skriv inn kommentaren slutten baseline i datainnsamling programvare.
- Slå av mikroinfusjonspumpene, og bytt ut sprøytene fulle av laktert Ringer-oppløsning mot sprøyten fylt med den laveste konsentrasjonen av ACh (10-10 M).
- Fest de nye sprøytene på plass, og bekreft perfusjonen av væsken gjennom enden av sonden før du slår på mikroinfusjonspumpene igjen. Skriv inn kommentaren begynner -10 i datainnsamlingsprogramvareopptaket.
- Hver konsentrasjon av ACh vil bli perfundert i 5-10 minutter ved 2 μL / min. I det siste minuttet av perfusjon, for hver konsentrasjon, måle og registrere blodtrykket. Når perfusjonstiden for en gitt konsentrasjon er avsluttet, erstattes sprøyten med den nest høyeste konsentrasjonen (f.eks. 10-10 M ACh-oppløsning byttes ut med 10-9 M ACh-oppløsning ), som beskrevet i trinn 4.2-4.4.
- Umiddelbart etter perfusing av den endelige konsentrasjonen av ACh (10-1 M), bytt ACh sprøyten med en som inneholder Ringers løsning, og øk den lokale varmeovnen temperatur til 43 ° C. Når RBC-fluksen har stabilisert seg, erstatt Ringer-løsningen med natriumnitroprussid (28 mM) for å produsere både en varmeindusert og farmakologisk indusert maksimal lokal vasodilatasjon. Mål og registrer blodtrykket hvert ~3 minutt i løpet av denne maksimale vasodilatasjonsfasen.
- Når et maksimalt RBC-fluksplatå har oppstått (~5 min stabil PU), avslutt eksperimentet. Velg stopp nederst til høyre i datainnsamlingsprogramvaren for å avslutte den kontinuerlige datainnsamlingen.
5. Lokal oppvarmingsprotokoll
- Når RBC-fluksen har stabilisert seg etter hyperemi, begynner du baseline datainnsamlingen, og angir dette i datainnsamlingsprogramvarefilen med en kommentar. I det siste minuttet av baseline, samle en blodtrykksmåling, og skriv inn verdiene i en kommentar i datainnsamlingsprogramvarefilen.
- Øk de lokale ovnene til enten 39 °C eller 42 °C, avhengig av protokollens behov (forklart i diskusjonsdelen).
- Når RBC-fluksen har platået som respons på lokal varmeapplikasjon (~ 40-60 min oppvarming), perfuse N G-nitro-l-arginin metylester (L-NAME; 15 mM oppløst i Ringers løsning; 2 μL / min; en NO-syntasehemmer) gjennom mikrodialyseproben (e).
- Når RBC-fluksen har flatet ut som respons på L-NAME (~15-25 min perfusjon), øk de lokale ovnene til 43 °C.
- Når RBC-fluksen har flatet ut som respons på 43 °C (et ~2-5 min platå oppstår etter ~20-45 min oppvarming), perfusser natriumnitroprussid (28 mM oppløst i Ringers løsning) gjennom mikrodialyseproben(e).
- Når et maksimalt RBC-fluksplatå har oppstått (~5 min stabil PU), avslutt eksperimentet. Velg stopp nederst til høyre i datainnsamlingsprogramvaren for å avslutte datainnsamlingen.
6. Fjerning av mikrodialyseprobene
- Etter avslutning av forsøket, bruk en kirurgisk saks for å kutte mikrodialyseprobene. Fjern forsiktig LDF-sondene fra varmeovnene, og fjern varmeovnene fra huden. Fjern forsiktig båndet som holder sondene på plass på huden.
- Identifiser visuelt hvilket punkteringssted på hver side av sonden som har dannet den minste blodproppen. Klipp delen av sonden nær stedet med den mindre blodproppen, og la ~ 1 i sonden utenfor huden være uskåret.
- Rengjør den delen av huden som omgir inngangs- og utgangsstedene til sonden med en spritserviett, samt ~ 1 i lengden på sonden som er igjen på det mindre koagulerte stedet.
- La alkoholen tørke på huden. Ta deretter tak i den delen av sonden som strekker seg fra punkteringsstedet med større blodpropp, motsatt ~ 1 i del på den mindre koagulerte enden. Trekk sonden sakte mot den større blodproppen.
- Plasser sterilt gasbind over blødning som skyldes sonden fjerning, og bruke trykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dosering-respons-protokoll for acetylkolin
Figur 1A viser et skjema som beskriver ACh dose-respons-protokollen. Figur 1B illustrerer representative sporinger av RBC-fluksverdiene (perfusjonsenheter, PU; 30 s gjennomsnitt) fra den standardiserte ACh dose-respons-protokollen for en pasient over tid. Figur 1C illustrerer en rådatafil av en ACh dose-respons-protokoll. Ytterligere baselinemålinger ble opprettholdt i rådatafilen, men bare ~10 minutter fra baseline ble benyttet til dataanalysen.
Etter at hyperemi har opphørt og en stabil RBC-fluks i 5 minutter, kan datainnsamlingen på 10 minutter ved baseline begynne. Grunnlinjen er avbildet som en relativt stabil horisontal RBC-flukslinje, der enhver årsak til avvik (f.eks. bevegelsesartefakter, sondejusteringer) skal logges som datainnsamlingsprogramvarekommentarer for analyseformål. Dose-respons-protokollen følger baselineperioden, og sprøytene må endres med hver dose, fra 10-10 M til 10-1 M ACh. Før du starter 5-10 min perfusjon av hver dose, må man sørge for at farmakologisk middel har fullstendig perfusert gjennom fiberens lengde. I datainnsamlingsprogramvaren vil det være en innledende økning i RBC-fluksen på grunn av perfusjonen, men dette er ikke inkludert i analysene, da datainnsamlingen på 5 minutter for den konsentrasjonen ikke har begynt. Når perfusjonen for hver dose har begynt, vil det være en kontinuerlig økning i RBC-fluksen til en topp, etterfulgt av en jevn nedgang. Denne krøllete responsen på farmakologiske midler vil bli replikert gjennom hele protokollen, men RBC-fluksen vil være relativt større med økende konsentrasjoner av ACh. Med lavere konsentrasjoner av ACh kan den krøllete responsen ikke være like fremtredende. Eksempler på ikke-optimal RBC-fluks inkluderer følgende: 1) en ikke-krøllete respons, hvor RBC-fluksen ikke øker og forblir platået, eller 2) økende ACh-konsentrasjoner som har minimal innvirkning på RBC-fluksen, hvor RBC-fluksen ikke øker relativt med hver konsentrasjon av ACh. Dette er avhengig av forskningsspørsmålet og den kliniske kohorten som testes.
Etter den endelige konsentrasjonen av ACh perfuseres lakterte Ringer, og de lokale ovnene økes til 43 °C. I denne fasen må et platå oppnås før natriumnitroprussid perfuseres. Dette kan ta opptil ~45 min, avhengig av tidligere midler perfusert. Denne fasen er ikke inkludert i analysene. Når platået er oppnådd i 5 minutter, perfuseres natriumnitroprussid for å produsere maksimal lokal vasodilatasjon. Denne maksimale lokale vasodilatasjonen er avbildet som en økning i RBC-fluksen, hvor et platå oppnås etter ~ 20 min perfusjon, eller ved at RBC-fluksen når en topp og avtar umiddelbart etter. Når et platå eller en nedgang i RBC-fluksen er oppnådd for natriumnitroprussid, er protokollen fullført. Et vanlig eksempel på ikke-optimal RBC-fluks er den høyeste verdien av RBC-fluks som oppnås i en annen fase av protokollen (f.eks. under dose-respons-protokollen) i stedet for under maksimal lokal vasodilatasjon.
Doserings-responsprotokoll for acetylkolin: Hemming av nitrogenoksidsyntase
For å kvantifisere bidraget fra NO til kutan blodstrøm som respons på ACh, blir N G-nitro-l-argininmetylester (L-NAME), en NO-syntasehemmer, perfundert i kombinasjon med ACh gjennom en ekstra fiber. Figur 2A viser et skjema som beskriver ACh dose-respons-protokollen med L-NAME. Figur 2B illustrerer representative sporinger av RBC-fluksen (30 s gjennomsnitt) fra den standardiserte ACh dose-respons-protokollen for ett forsøksperson over tid med L-NAME. Figur 2C illustrerer en rådatafil av en ACh dose-respons-protokoll med L-NAME. Ytterligere baselinemålinger ble opprettholdt i rådatafilen, men bare ~10 minutter fra baseline ble benyttet til dataanalysen.
Etter at hyperemi har opphørt, en stabil RBC-fluks i 5 minutter og tilstrekkelig tid til å fullstendig blokkere den enzymatiske stien av interesse (f.eks. NO-syntase) og/eller levere tilstrekkelige konsentrasjoner av kofaktorer, kan datainnsamlingen på 10 minutter begynne (vist som en relativt stabil horisontal linje). Dose-respons-protokollen følger baseline, og sprøytene må endres for hver dose fra 1010 M til 101 M ACh med NO-syntasehemmeren (f.eks. 15 mM L-NAVN). I nærvær av en NO-syntaseinhibitor replikeres den krøllete responsen ikke godt til høyere konsentrasjoner av ACh. En relativt lavere RBC-fluks, sammenlignet med et sted uten INGEN syntasehemming, vil bli observert. Et vanlig eksempel på ikke-optimal RBC-fluks er NO-syntaseinhiberingen, sammenlignet med forholdene uten INGEN syntasehemming, noe som resulterer i en høyere RBC-fluks. Dette indikerer at protokollen har mislyktes.
Etter perfusjon av den endelige konsentrasjonen av ACh, perfuseres lakterte Ringer, og de lokale ovnene økes til 43 °C. I denne fasen bør et platå oppnås før natriumnitroprussid perfuseres. Denne fasen er ikke inkludert i analysene. Når platået er oppnådd i 5 minutter, perfuseres natriumnitroprussid og gir maksimal lokal vasodilatasjon. Under maksimal lokal vasodilatasjon vil det være en eksponentiell økning i RBC-fluksen på grunn av tidligere NO-syntasehemming. Et platå vil bli oppnådd etter ~ 20 min perfusjon, eller RBC-fluksen vil nå sin absolutte topp og avta umiddelbart etter. Når et platå eller en nedgang i RBC-fluksen er oppnådd for natriumnitroprussid, er protokollen fullført. Et vanlig eksempel på ikke-optimal RBC-fluks er å oppnå den høyeste RBC-fluksverdien i en annen fase av protokollen (f.eks. under dose-respons-protokollen) i stedet for under maksimal lokal vasodilatasjon.
Lokal oppvarmingsprotokoll
Figur 3A viser et skjema som beskriver den lokale oppvarmingsprotokollen. Figur 3B illustrerer representative sporinger av RBC-fluksen (30 s gjennomsnitt) for den standardiserte lokale oppvarmingsprotokollen for ett emne over tid. Figur 3C illustrerer en rådatafil av en lokal oppvarmingsprotokoll. Etter hyperemioppløsning og en stabil RBC-fluks i 5 minutter, kan 10 minutter med baseline datainnsamling begynne (vist som en relativt stabil horisontal linje). De lokale ovnene er satt til enten 39 °C eller 42 °C, og en innledende topp og nadirrespons vil oppstå i RBC-fluksen. For å kvantifisere bidraget fra NO til den kutane blodstrømmen som respons på en lokal varmestimulus, blir L-NAME perfundert etter at et stabilt platå i RBC-fluksen er oppnådd. Det vil være en rask nedgang i RBC-fluksen til den når et nytt platå som svar på L-NAME. Etter 5 min med stabile RBC-fluksverdier perfuseres lakterte Ringer, og de lokale ovnene økes til 43 °C. Oppvarmingen vil gi en ekstra topp og nadir respons i RBC-fluksen. I denne fasen må man sørge for at et platå er oppnådd før natriumnitroprussid perfuseres. Denne fasen er ikke inkludert i analysene. For å indusere lokal maksimal vasodilatasjon perfuseres natriumnitroprussid, og en rask økning i RBC-fluksen vil forekomme. Når et platå eller en nedgang i RBC-fluksen er observert som respons på natriumnitroprussid, er protokollen fullført.
Figur 1: Doserings-responsprotokoll for acetylkolin (ACh). (A) Skjematisk fremstilling av en ACh dose-respons protokoll. (B) Representativ sporing (30 s gjennomsnitt) av en ACh dose-respons-protokoll. (C) Rådata for en ACh dose-respons-protokoll. Ytterligere basislinjemålinger opprettholdes i rådatafilen for å demonstrere svingningene før stabilisering, men bare ~10 min stabile hviledata ble benyttet for dataanalysen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: ACh dose-respons-protokoll med nitrogenoksid (NO) syntasehemming. (A) Skjematisk fremstilling av en ACh dose-respons protokoll med INGEN syntasehemming. (B) Representativ sporing av en ACh dose-respons-protokoll med INGEN syntasehemming. (C) Rådata fra en ACh dose-respons-protokoll med INGEN syntasehemming. Ytterligere basislinjemålinger opprettholdes i rådatafilen for å demonstrere svingningene før stabilisering, men bare ~10 min stabile hviledata ble benyttet for dataanalysen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Lokal oppvarmingsprotokoll. (A) Skjematisk fremstilling av en lokal oppvarmingsprotokoll. (B) Representativ sporing av en lokal oppvarmingsprotokoll. (C) Rådata for en lokal oppvarmingsprotokoll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den intradermale mikrodialyseteknikken er et allsidig verktøy i human vaskulær forskning. Etterforskere kan endre protokollen for å diversifisere applikasjonene ytterligere. For eksempel beskriver vi en ACh dose-respons-protokoll, men andre undersøkelser av mekanismene for vasokonstriksjon eller vasomotorisk tone, i stedet for vasodilatasjon alene, har benyttet noradrenalin eller natriumnitroprussid dose-respons tilnærminger 26,27,28,29,30,31. Andre mediatorer av vasodilatasjon, som mentol eller metaklorklorid, har også blitt brukt i dose-responsprotokollen31,32. Dose-respons-protokollen som en farmakologisk vurdering av vaskulær funksjon er en mer målrettet, mekanistisk teknikk for å isolere spesifikke signalmekanismer sammenlignet med den lokale oppvarmingsprotokollen, da den fjerner variasjoner i sympatisk respons på termiske stimuli. Lokal oppvarming er imidlertid en kostnadseffektiv tilnærming som bruker en fysiologisk stimulans for å indusere vasodilatasjon via både nevrogene og endotelavhengige mekanismer. Det er også viktig å vurdere mekanismen av interesse når du velger mellom en 39 ° C eller 42 ° C lokal oppvarming protokoll. 39 °C-protokollen har blitt foreslått for bedre å isolere NO-mediert vasodilatasjon, mens 42 °C-protokollen tillater undersøkelse av både NO-mediert vasodilatasjon og endotelderivert hyperpolariserende faktormediert vasodilatasjon33,34. I tillegg har CVC-økningen som respons på 42 °C lokal oppvarming en tendens til å være mer robust (dvs. nå en høyere% CVCmax34). Imidlertid, når du bruker et nytt middel til å forhøre en bestemt signalvei, må strenge metoder brukes for å evaluere effekten (dvs. fullstendig blokk) og / eller mette konsentrasjoner av kofaktorene.
Endotelfunksjonen måles ofte ved hjelp av den strømningsmedierte dilatasjonsteknikken, men endoteldysfunksjon i mikrovaskulære senger kan forekomme før eller uavhengig av endoteldysfunksjon i store kanalarterier, spesielt i patologier som HTN 6,7,8. Videre tillater ikke den strømningsmedierte dilatasjonsteknikken farmakologisk disseksjon av patofysiologien ved endoteldysfunksjon isolert fra systemiske effekter. Andre metoder for å undersøke mikrovaskulær endotelfunksjon, som iontoforese eller postokklusiv reaktiv hyperemi, er ikke i stand til å målrette endotelfunksjonens mekanismer presist med farmakologisk intervensjon12. Derfor tillater intradermal mikrodialyse unikt målrettede undersøkelser av mekanismene for vaskulær funksjon, og bruken, sammen med strømningsmedierte dilatasjonsresultater, kan gi et mer helhetlig bilde av systemisk vaskulær funksjon.
Uansett hvilken intradermal mikrodialysetilnærming som benyttes, må det tas visse forholdsregler for å sikre validiteten og reproduserbarheten av responsene. Mens spesifikasjonene til den eksperimentelle protokollen kan justeres for å svare på spesifikke forskningsspørsmål, er den nøyaktige plasseringen av mikrodialysesonden helt kritisk. Det må utvises forsiktighet for å sette sonden inn i dermis og for å unngå de større synlige eller palpable blodkarene i huden. Punktering av disse karene vil resultere i unormalt lave perfusjonsenhetsverdier; i dette tilfellet vil laserdopplerstrømningen måle dannelsen av et hematom i stedet for strømmen av røde blodlegemer gjennom et intakt kar. Etter dette er det nest mest kritiske trinnet i denne protokollen oppløsningen av den hyperemiske responsen på nålepunkteringen. Hvis den hyperemiske responsen ikke tillates å avta helt, vil de registrerte perfusjonsenhetene gjennom baseline og tidlige deler av protokollen være større enn de sanne hvileverdiene. Hvis tilstrekkelig restitusjonstid er tillatt, men perfusjonsenhetene forblir unormalt høye, kan det være nødvendig å rekalibrere sondene før baseline datainnsamlingsfasen begynner.
En begrensning av den intradermale mikrodialyseteknikken er at den ikke spesifikt kan isolere en vevstype for å evaluere vaskulære signalveier. Siden karene i huden ikke kan dissekeres og visualiseres in vivo, er det ingen måte å sikre at den semipermeable delen av en mikrodialysesonde er umiddelbart tilstøtende til vevet av interesse (f.eks. Det vaskulære endotelet). Derfor er resultatene oppnådd fra denne teknikken representative for den integrerende naturen til menneskelig fysiologi og gir innsikt i den kollektive funksjonen til endotel, vaskulær glatt muskel og nevrale påvirkninger på lokal blodstrøm. Imidlertid, hvis du bruker en lokal oppvarmingsprotokoll, tillater RBC-fluksen å nå et platå ved den første økningen i varme til 39 ° C eller 42 ° C, oppløsningen av den aksonale refleksen til varmen, som deretter tillater en primært endotelmediert respons, som diskutert andre steder35. En ytterligere begrensning av denne teknikken er bruken av laser Doppler flowmetry som en indeks av hudens blodstrøm. Laserdopplerstrømning kvantifiserer den røde blodcellefluksen, som ikke tar hensyn til endringene i kardiameteren (dvs. utvidelse av mikrovaskulaturen), som ville være nødvendig for å kvantifisere den absolutte strømmen. Det kan være følsomt for forskjeller mellom deltakere eller mellom tilstander36. Fremtidige anvendelser av intradermal mikrodialyse kan inkludere teknikker for å kvantifisere den absolutte mikrovaskulære blodstrømmen. For eksempel tillater den nylige utviklingen av optisk koherenstomografi kvantifisering av kardiameteren ved hjelp av tredimensjonal avbildning av hudmikrovaskulaturen13. Den intradermale mikrodialyseteknikken er kontraindisert i svært få, men viktige tilfeller, som inkluderer, men er ikke begrenset til, deltakere med hudforhold, deltakere med allergier relatert til stoffene beskrevet her, deltakere med alvorlig trypanofobi og deltakere med tatoveringer som dekker hele det ventrale aspektet av underarmen (men små tatoveringer i dette området er ikke ekskluderende).
Den unike evnen til mikrodialysetilnærmingen til å hjelpe til med å isolere og avgrense underliggende patofysiologiske mekanismer gjør det fordelaktig for å undersøke den variable etiologien til HTN, blant andre CVDer. Etter protokolloptimalisering tillater denne teknikken å evaluere effekten av nye CVD-behandlinger. Videre gir intradermal mikrodialyse en metode for å vurdere off-target effekter av hypotetisk ikke-relaterte farmakoterapier, noe som gjør det til et svært verdifullt verktøy for å informere større kliniske studier. Samlet sett er denne teknikken en uvurderlig ressurs i mikrovaskulær forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter og ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
References
- Xu, J. Q., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Arias, E.
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93 (2023).
- Cohuet, G., Struijker-Boudier, H. Mechanisms of target organ damage caused by hypertension: Therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 111 (1), 81-98 (2006).
- Park, K. H., Park, W. J. Endothelial dysfunction: Clinical implications in cardiovascular disease and therapeutic approaches. Journal of Korean Medical Science. 30 (9), 1213-1225 (2015).
- Levy, B. I., Ambrosio, G., Pries, A. R., Struijker-Boudier, H. A. Microcirculation in hypertension: a new target for treatment. Circulation. 104 (6), 735-740 (2001).
- Sara, J. D., et al. Prevalence of coronary microvascular dysfunction among patients with chest pain and nonobstructive coronary artery disease. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Interventions. 8 (11), 1445-1453 (2015).
- Weis, M., Hartmann, A., Olbrich, H. G., Hör, G., Zeiher, A. M. Prognostic significance of coronary flow reserve on left ventricular ejection fraction in cardiac transplant recipients. Transplantation. 65 (1), 103-108 (1998).
- Rossi, M., et al. Investigation of skin vasoreactivity and blood flow oscillations in hypertensive patients: Effect of short-term antihypertensive treatment. Journal of Hypertension. 29 (8), 1569-1576 (2011).
- Pepine, C. J., et al. Coronary microvascular reactivity to adenosine predicts adverse outcome in women evaluated for suspected ischemia results from the National Heart, Lung and Blood Institute WISE (Women's Ischemia Syndrome Evaluation) study. Journal of the American College of Cardiology. 55 (25), 2825-2832 (2010).
- Matsuda, J., et al. Prevalence and clinical significance of discordant changes in fractional and coronary flow reserve after elective percutaneous coronary intervention. Journal of the American Heart Association. 5 (12), e004400 (2016).
- Gupta, A., et al. Integrated noninvasive physiological assessment of coronary circulatory function and impact on cardiovascular mortality in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 136 (24), 2325-2336 (2017).
- Roustit, M., Cracowski, J. L. Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 373-384 (2013).
- Low, D. A., Jones, H., Cable, N. T., Alexander, L. M., Kenney, W. L. Historical reviews of the assessment of human cardiovascular function: interrogation and understanding of the control of skin blood flow. European Journal of Applied Physiology. 120 (1), 1-16 (2020).
- Kenney, W. L., Cannon, J. G., Alexander, L. M. Cutaneous microvascular dysfunction correlates with serum LDL and sLOX-1 receptor concentrations. Microvascular Research. 85, 112-117 (2013).
- Holowatz, L. A., Thompson, C. S., Minson, C. T., Kenney, W. L. Mechanisms of acetylcholine-mediated vasodilatation in young and aged human skin. Journal of Physiology. 563, 965-973 (2005).
- Sokolnicki, L. A., Roberts, S. K., Wilkins, B. W., Basu, A., Charkoudian, N. Contribution of nitric oxide to cutaneous microvascular dilation in individuals with type 2 diabetes mellitus. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 292 (1), E314-E318 (2007).
- DuPont, J. J., Ramick, M. G., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species contribute to impaired cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 306 (12), F1499-F1506 (2014).
- Sprung, V. S., et al. Nitric oxide-mediated cutaneous microvascular function is impaired in polycystic ovary syndrome but can be improved by exercise training. Journal of Physiology. 591 (6), 1475-1487 (2013).
- Greaney, J. L., Saunders, E. F. H., Santhanam, L., Alexander, L. M. Oxidative stress contributes to microvascular endothelial dysfunction in men and women with major depressive disorder. Circulatory Research. 124 (4), 564-574 (2019).
- Stanhewicz, A. E., Jandu, S., Santhanam, L., Alexander, L. M. Increased angiotensin II sensitivity contributes to microvascular dysfunction in women who have had preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 382-389 (2017).
- Greaney, J. L., et al. Impaired hydrogen sulfide-mediated vasodilation contributes to microvascular endothelial dysfunction in hypertensive adults. Hypertension. 69 (5), 902-909 (2017).
- Dillon, G. A., Stanhewicz, A. E., Serviente, C., Greaney, J. L., Alexander, L. M. Hydrogen sulfide-dependent microvascular vasodilation is improved following chronic sulfhydryl-donating antihypertensive pharmacotherapy in adults with hypertension. Journal of Physiology. 321 (4), H728-H734 (2021).
- Wong, B. J., et al. Sensory nerve-mediated and nitric oxide-dependent cutaneous vasodilation in normotensive and prehypertensive non-Hispanic blacks and whites. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (2), H271-H281 (2020).
- Dillon, G. A., Greaney, J. L., Shank, S., Leuenberger, U. A., Alexander, L. M. AHA/ACC-defined stage 1 hypertensive adults do not display cutaneous microvascular endothelial dysfunction. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (3), H539-H546 (2020).
- Gagge, A. P., Stolwijk, J. A., Hardy, J. D. Comfort and thermal sensations and associated physiological responses at various ambient temperatures. Environmental Research. 1 (1), 1-20 (1967).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Lack of limb or sex differences in the cutaneous vascular responses to exogenous norepinephrine. Journal of Applied Physiology. 117 (12), 1417-1423 (2014).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Impaired increases in skin sympathetic nerve activity contribute to age-related decrements in reflex cutaneous vasoconstriction. Journal of Physiology. 593 (9), 2199-2211 (2015).
- Alba, B. K., Greaney, J. L., Ferguson, S. B., Alexander, L. M. Endothelial function is impaired in the cutaneous microcirculation of adults with psoriasis through reductions in nitric oxide-dependent vasodilation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (2), H343-H349 (2018).
- Greaney, J. L., Surachman, A., Saunders, E. F. H., Alexander, L. M., Almeida, D. M. Greater daily psychosocial stress exposure is associated with increased norepinephrine-induced vasoconstriction in young adults. Journal of the American Heart Association. 9 (9), e015697 (2020).
- Nakata, T., et al. Quantification of catecholamine neurotransmitters released from cutaneous vasoconstrictor nerve endings in men with cervical spinal cord injury. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (3), R345-R352 (2023).
- Tucker, M. A., et al. Postsynaptic cutaneous vasodilation and sweating: Influence of adiposity and hydration status. European Journal of Applied Physiology. 118 (8), 1703-1713 (2018).
- Craighead, D. H., Alexander, L. M. Menthol-induced cutaneous vasodilation is preserved in essential hypertensive men and women. American Journal of Hypertension. 30 (12), 1156-1162 (2017).
- Brunt, V. E., Minson, C. T. KCa channels and epoxyeicosatrienoic acids: Major contributors to thermal hyperaemia in human skin. Journal of Physiology. 590 (15), 3523-3534 (2012).
- Choi, P. J., Brunt, V. E., Fujii, N., Minson, C. T. New approach to measure cutaneous microvascular function: An improved test of NO-mediated vasodilation by thermal hyperemia. Journal of Applied Physiology. 117 (3), 277-283 (2014).
- Johnson, J. M., Kellogg, D. L. Jr Local thermal control of the human cutaneous circulation. Journal of Applied Physiology. 109 (4), 1229-1238 (2010).
- Jung, F., et al. Laser Doppler flux measurement for the assessment of cutaneous microcirculation-Critical remarks. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 55 (4), 411-416 (2013).
