Summary
La microdiálisis intradérmica es una técnica mínimamente invasiva que se utiliza para investigar la función microvascular en la salud y la enfermedad. Tanto los protocolos dosis-respuesta como los de calentamiento local se pueden utilizar para esta técnica para explorar los mecanismos de vasodilatación y vasoconstricción en la circulación cutánea.
Abstract
La vasculatura cutánea es un tejido accesible que se puede utilizar para evaluar la función microvascular en humanos. La microdiálisis intradérmica es una técnica mínimamente invasiva que se utiliza para investigar los mecanismos del músculo liso vascular y la función endotelial en la circulación cutánea. Esta técnica permite la disección farmacológica de la fisiopatología de la disfunción endotelial microvascular indexada por la disminución de la vasodilatación mediada por óxido nítrico, un indicador del riesgo de desarrollo de enfermedades cardiovasculares. En esta técnica, se coloca una sonda de microdiálisis en la capa dérmica de la piel y se coloca una unidad de calentamiento local con una sonda de flujometría láser Doppler sobre la sonda para medir el flujo de glóbulos rojos. La temperatura local de la piel se restringe o estimula con la aplicación directa de calor, y los agentes farmacológicos se perfunden a través de la sonda para estimular o inhibir las vías de señalización intracelular con el fin de inducir vasodilatación o vasoconstricción o para interrogar mecanismos de interés (cofactores, antioxidantes, etc.). Se cuantifica la conductancia vascular cutánea y se pueden delinear los mecanismos de disfunción endotelial en estados patológicos.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte enlos Estados Unidos. La hipertensión arterial (HTA) es un factor de riesgo independiente para el accidente cerebrovascular, la enfermedad coronaria y la insuficiencia cardíaca y se estima que afecta a más del ~ 50% de la población de los Estados Unidos2. La HTA puede desarrollarse como una ECV independiente (HTA primaria) o como resultado de otra afección, como la enfermedad renal poliquística y/o los trastornos endocrinos (HTA secundaria). La amplitud de las etiologías de la HTA complica las investigaciones sobre los mecanismos subyacentes y el daño a los órganos terminales observado con la HTA. Se necesitan enfoques de investigación diversos y novedosos sobre la fisiopatología del daño a los órganos terminales asociado con la HTA.
Uno de los primeros signos patológicos de ECV es la disfunción endotelial, caracterizada por una vasodilatación mediada por óxido nítrico (NO)alterada 3,4,5. La dilatación mediada por flujo es un enfoque común utilizado para cuantificar la disfunción endotelial asociada con la ECV, pero la disfunción endotelial en los lechos microvasculares puede ser independiente y precursora de la de las grandes arterias de los conductos 6,7,8. Además, las arteriolas de resistencia actúan más directamente sobre el tejido local que las arterias conducto y tienen un control más inmediato sobre el suministro de sangre rica en oxígeno. La función microvascular es predictiva de supervivencia libre de eventos cardiovasculares adversos 9,10,11. La microvasculatura cutánea es un lecho vascular accesible que se puede utilizar para examinar las respuestas a estímulos vasoconstrictores o vasodilatadores fisiológicos y farmacológicos. La microdiálisis intradérmica es una técnica mínimamente invasiva, cuyo objetivo es investigar los mecanismos de la función vascular del músculo liso y endotelial en la microvasculatura cutánea con disección farmacológica dirigida. Este método contrasta con otras técnicas, como la hiperemia reactiva post-oclusiva, que no permite la disección farmacológica, y la iontoforesis, que permite la administración farmacológica pero es menos precisa en su mecanismo de acción (revisado en profundidad en otro lugar12).
La justificación del desarrollo y uso de esta técnica se examina ampliamente en otro lugar13. Este enfoque se desarrolló originalmente para su uso en la investigación neurológica en roedores y luego se aplicó por primera vez a los humanos para investigar los mecanismos subyacentes a la vasodilatación activa desde un punto de vista termorregulador. A finales de la década de 1990, este método se utilizó para examinar los mecanismos neurales y endoteliales con respecto al calentamiento local de la piel. Desde entonces, la técnica se ha utilizado para investigar una serie de mecanismos de señalización neurovascular en la piel.
Utilizando esta técnica, nuestro grupo y otros han interrogado los mecanismos de la disfunción endotelial en la microvasculatura de varias poblaciones clínicas, incluyendo, entre otras, dislipidemia, envejecimiento primario, diabetes, enfermedad renal crónica, síndrome de ovario poliquístico, preeclampsia, trastorno depresivo mayor 14,15,16,17,18,19 e hipertensión 20,21,22,23,24. Por ejemplo, un estudio previo encontró que las mujeres normotensas con antecedentes de preeclampsia, que tienen un mayor riesgo de ECV, tenían una vasodilatación mediada por NO reducida en la circulación cutánea en comparación con las mujeres con antecedentes de embarazo normotenso20. En otro estudio, los adultos diagnosticados con HTA primaria demostraron una mayor sensibilidad a la angiotensina II en la microvasculatura en comparación con los controles sanos21, y se ha demostrado que la farmacoterapia antihipertensiva con donación crónica de sulfhidrilo en pacientes con HTA primaria disminuye la presión arterial y mejora tanto la vasodilatación mediada por sulfuro de hidrógeno como por NO22. Wong et al.23 encontraron una vasodilatación sensitiva y mediada por NO en adultos prehipertensos, coincidiendo con nuestro hallazgo de una progresión de la disfunción endotelial con el aumento de los estadios de HTA, según la categorización de las guías de la Asociación Americana del Corazón y el Colegio Americano de Cardiología de 201724.
La técnica de microdiálisis intradérmica permite realizar investigaciones mecanicistas estrictamente controladas sobre la función microvascular en estados de salud y enfermedad. Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo describir la técnica de microdiálisis intradérmica aplicada por nuestro grupo y otros. Detallamos los procedimientos tanto para la estimulación farmacológica del endotelio con acetilcolina (ACh) para examinar la relación dosis-respuesta como para la estimulación fisiológica de la producción endógena de NO con un protocolo de estímulo de calentamiento local a 39 °C o 42 °C. Presentamos resultados representativos para cada abordaje y discutimos las implicaciones clínicas de los hallazgos que han surgido de esta técnica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos son aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Estatal de Pensilvania antes del reclutamiento de los participantes.
1. Configuración del equipo
- Encienda la unidad de calefacción local y el caudalímetro láser Doppler.
NOTA: Ambos deben calibrarse antes de la recopilación de datos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El caudalímetro láser Doppler debe conectarse a un hardware de adquisición de datos con muestreo a 100 Hz (100 muestras/min) y registro continuo en un software de adquisición de datos. Si bien se puede utilizar otro hardware y software de adquisición de datos, para simplificar, las instrucciones restantes reflejan el hardware de PowerLab y las capacidades del software LabChart. - Abra un archivo de software LabChart.
NOTA: Se debe crear de antemano un archivo de referencia con la entrada de datos deseada y las capacidades de recopilación continua de datos. Debe haber un panel para cada láser Doppler y calentador local que corresponda a cada sitio de microdiálisis, y los paneles deben corresponder a las entradas de canal apropiadas en la unidad de hardware de adquisición de datos.
2. Colocación de fibras de microdiálisis
- Identifique los vasos sanguíneos grandes y visibles de la piel en la cara ventral del antebrazo e indíquelos con un marcador permanente (utilice un torniquete para visualizar los vasos si es necesario; la identificación de vasos en la piel de pigmentación oscura puede requerir una mayor dependencia de la palpación).
- Frote el área que abarca las marcas y una porción generosa del área circundante con hisopos de betadine. Limpie el betadine con hisopos con alcohol. Cubra el área esterilizada de la piel con un paño estéril y aplique hielo durante ~ 5 minutos para adormecer el área.
- Retire el hielo e inserte una aguja introductora (23 G, 25 mm de longitud), biselada hacia arriba, en la capa dérmica de la piel a una profundidad de 2-3 mm (dependiendo del grosor de la piel individual). Avance la aguja, teniendo cuidado de permanecer en la capa dérmica, y salga de la piel ~ 20 mm desde el punto de inserción.
NOTA: Para confirmar la profundidad adecuada de colocación en la piel, la forma de la aguja debe ser visible y fácilmente palpable, pero el color de la aguja debe estar oculto. Si se requiere más de una sonda de microdiálisis para el experimento, será necesario colocar dos agujas introductoras a una distancia de ≥2,5 cm y colocarlas antes de la inserción de la sonda de microdiálisis. Las sondas no deben colocarse a lo largo del mismo recipiente principal. - Dejando la aguja en su lugar, conecte la sonda (a través del bloqueo Luer) a una jeringa que contenga solución de Ringer lactato. Pase el extremo opuesto de la sonda a través de la aguja introductora hasta que la membrana semipermeable de la sonda esté cerca pero aún fuera de la abertura de la aguja introductora. Perfundir lentamente una pequeña cantidad de solución de Ringer a través de la fibra hasta que la solución se perfunda visiblemente a través de los poros de la membrana para confirmar la integridad de la membrana.
- Si utiliza una sonda de microdiálisis de Harvard Bioscience y una aguja introductora, siga los pasos 2.5.1-2.5.2.
- Una vez confirmada la función de la sonda, pase la sonda a través de la aguja introductora hasta que la membrana esté completamente contenida en la capa dérmica de la piel dentro de la aguja introductora.
- Con un dedo, asegure la sonda en su lugar proximal a la aguja y retire la aguja en la dirección opuesta a la inserción. Coloque cinta adhesiva en la parte externa de la fibra en su lugar sobre la piel para evitar el desplazamiento de la membrana semipermeable durante el experimento.
- Si utiliza una sonda de microdiálisis de Bioanalytical Systems y una aguja introductora, siga los pasos 2.6.1-2.6.2.
- Una vez confirmada la función de la sonda, tome el cubo de la aguja introductora y la parte distal de la sonda de microdiálisis con una mano y, simultáneamente, retire la aguja opuesta a la dirección de inserción, moviendo la sonda de microdiálisis a su lugar.
- Ajuste la sonda según sea necesario para asegurarse de que la membrana semipermeable esté enterrada completamente en la piel. Coloque cinta adhesiva con cinta adhesiva la fibra externa en su lugar sobre la piel para evitar el desplazamiento de la membrana semipermeable durante el experimento.
3. Hiperemia
- Mientras espera a que disminuya la respuesta hiperémica a la inserción de la aguja (~60-90 min), coloque la jeringa de un solo uso en la bandeja portajeringas de las bombas de microinfusión. Perfundir solución de Ringer, solución salina o solución vehicular lactato (la solución en la que se disuelve el agente farmacológico experimental; 2 μL/min) durante la fase de hiperemia.
NOTA: Si bien las sondas de microdiálisis no se pueden quitar durante esta fase de ~ 60-90 minutos, el participante puede ajustar la posición de su cuerpo o mover la mano, o el bloqueo Luer de la sonda se puede quitar de la jeringa y asegurar con cinta adhesiva al brazo del participante para permitirle un rango de movimiento libre para pararse brevemente. Una vez instrumentadas con calentadores locales y sondas de flujo Doppler láser (LDF) y una vez que ha comenzado la recopilación de datos, las sondas LDF no se pueden mover. - Cuando el enrojecimiento de la piel, que es un indicador de la respuesta hiperémica al traumatismo con aguja, haya disminuido, conecte la unidad de calentamiento local a la piel que cubre la membrana semipermeable a través del disco adhesivo de la sonda, asegurándose de que el centro del calentador se alinee con la trayectoria de la sonda de microdiálisis.
- Coloque la sonda LDF en la abertura en el centro del calentador local de modo que el láser quede directamente perpendicular a la superficie de la piel. Una vez colocadas y aseguradas las sondas LDF, haga clic en iniciar en el software de adquisición de datos para registrar y mostrar continuamente los valores de flujo de glóbulos rojos (flujo de glóbulos rojos; unidades de perfusión, PU). Si la hiperemia ha disminuido por completo, el flujo de glóbulos rojos será estable en ~5-20 PU (la pulsatilidad de los vasos debajo de la sonda LDF puede reflejarse por ligeras elevaciones en la PU que coinciden con los latidos del corazón).
- Coloque un manguito automático de presión arterial en el brazo de un sujeto que no haya sido instrumentado.
- Ajuste los calentadores locales a 33 °C para mantener la temperatura de la piel dentro de un rango termoneutrode 25, eliminando así cualquier variación en la influencia de los estímulos térmicos. Para agregar un comentario a la grabación continua en el software de adquisición de datos para denotar eventos en el experimento, haga clic en el cuadro de texto en la esquina superior derecha de la pantalla, escriba un comentario, seleccione qué canales deben recibir el comentario y haga clic en agregar.
4. Protocolo dosis-respuesta acetilcolina
- Una vez que el flujo de glóbulos rojos se haya estabilizado en respuesta al calor local de 33 °C, comience la recopilación de datos de referencia, que se distingue en el archivo de software de adquisición de datos mediante un comentario de inicio de línea de base. Se requiere al menos un mínimo de 5-10 minutos de línea de base estable para el análisis de datos; reinicie la línea de base en cualquier momento durante este punto de la recopilación de datos si es necesario, y márquelo en el archivo LabChart. En el último minuto de la línea de base, recopile una medición de la presión arterial e ingrese los valores en un comentario en el archivo LabChart.
- Al final de los 5-10 minutos de la recopilación de datos de referencia, mida y registre la presión arterial de referencia e ingrese el comentario final de la línea de base en el software de adquisición de datos.
- Apague las bombas de microinfusión y cambie las jeringas llenas de solución de Ringer lactato por la jeringa llena con la concentración más baja de ACh (10−10 M).
- Asegure las jeringas nuevas en su lugar y confirme la perfusión del líquido a través del extremo de la sonda antes de volver a encender las bombas de microinfusión. Introduzca el comentario begin −10 en la grabación del software de adquisición de datos.
- Cada concentración de ACh se perfundirá durante 5-10 min a 2 μL/min. En el último minuto de perfusión, para cada concentración, mida y registre la presión arterial. Una vez finalizado el tiempo de perfusión para una concentración dada, sustituya la jeringa por la siguiente concentración más alta (por ejemplo, se cambia la solución de 10−10 M ACh por una solución de 10−9 M de ACh), como se describe en los pasos 4.2-4.4.
- Inmediatamente después de perfundir la concentración final de ACh (10−1 M), sustituya la jeringa de ACh por una que contenga solución de Ringer y aumente la temperatura del calentador local a 43 °C. Una vez que el flujo de glóbulos rojos se haya estabilizado, reemplace la solución de Ringer con nitroprusiato de sodio (28 mM) para producir una vasodilatación local máxima inducida por calor e inducida farmacológicamente. Mida y registre la presión arterial cada ~3 minutos durante esta fase de vasodilatación máxima.
- Una vez que se haya producido una meseta máxima de flujo de glóbulos rojos (~5 min de PU estable), finalice el experimento. Seleccione detener en la esquina inferior derecha del software de adquisición de datos para finalizar la recopilación continua de datos.
5. Protocolo de calefacción local
- Una vez que el flujo de glóbulos rojos se haya estabilizado después de la hiperemia, comience la recopilación de datos de referencia e indíquelo en el archivo del software de adquisición de datos con un comentario. En el último minuto de la línea de base, recopile una medición de la presión arterial e ingrese los valores en un comentario en el archivo de software de adquisición de datos.
- Aumente los calentadores locales a 39 °C o 42 °C, según las necesidades del protocolo (explicado en la sección de discusión).
- Una vez que el flujo de glóbulos rojos se ha estabilizado en respuesta a la aplicación de calor local (~40-60 min de calentamiento), perfundir N G-nitro-l-arginina éster metílico (L-NAME; 15 mM disuelto en la solución de Ringer; 2 μL/min; un inhibidor de la NO sintasa) a través de la(s) sonda(s) de microdiálisis.
- Una vez que el flujo de glóbulos rojos se haya estabilizado en respuesta a L-NAME (~15-25 min de perfusión), aumente los calentadores locales a 43 °C.
- Una vez que el flujo de glóbulos rojos se ha estabilizado en respuesta a 43 °C (se produce una meseta de ~2-5 min después de ~20-45 min de calentamiento), perfundir nitroprusiato de sodio (28 mM disueltos en la solución de Ringer) a través de la(s) sonda(s) de microdiálisis.
- Una vez que se haya producido una meseta máxima de flujo de glóbulos rojos (~5 min de PU estable), finalice el experimento. Seleccione detener en la esquina inferior derecha del software de adquisición de datos para finalizar la recopilación de datos.
6. Extracción de las sondas de microdiálisis
- Una vez finalizado el experimento, utilice unas tijeras quirúrgicas para cortar las sondas de microdiálisis. Retire con cuidado las sondas LDF de los calentadores y retire los calentadores de la piel. Retire con cuidado la cinta que sujeta las sondas en su lugar sobre la piel.
- Identifique visualmente qué sitio de punción a cada lado de la sonda ha formado el coágulo de sangre más pequeño. Corte la parte de la sonda cerca del sitio con el coágulo más pequeño, dejando ~ 1 pulgada de la sonda fuera de la piel sin cortar.
- Limpie la parte de la piel que rodea los sitios de entrada y salida de la sonda con un hisopo con alcohol, así como la longitud de ~ 1 de la sonda que queda en el sitio menos coagulado.
- Deja que el alcohol se seque en la piel. Luego, agarre la parte de la sonda que se extiende desde el sitio de punción con el coágulo mayor, opuesta a la porción de ~ 1 en el extremo menos coagulado. Tire lentamente de la sonda hacia el coágulo de sangre más grande.
- Coloque una gasa estéril sobre cualquier sangrado que resulte de la extracción de la sonda y aplique presión.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protocolo dosis-respuesta acetilcolina
La Figura 1A muestra un esquema que detalla el protocolo dosis-respuesta de ACh. La Figura 1B ilustra los trazados representativos de los valores de flujo de glóbulos rojos (unidades de perfusión, PU; promedios de 30 s) del protocolo estandarizado de dosis-respuesta de ACh para un sujeto a lo largo del tiempo. La Figura 1C ilustra un archivo de datos sin procesar de un protocolo de dosis-respuesta ACh. Se mantuvieron mediciones de línea de base adicionales en el archivo de datos sin procesar, pero solo se utilizaron ~ 10 minutos de línea de base para el análisis de datos.
Después de la resolución de la hiperemia y un flujo estable de glóbulos rojos durante 5 minutos, puede comenzar la recolección de datos basales de 10 minutos. La línea de base se representa como una línea de flujo RBC horizontal relativamente estable, donde cualquier causa de desviaciones (por ejemplo, artefactos de movimiento, ajustes de sonda) debe registrarse como comentarios del software de adquisición de datos con fines de análisis. El protocolo dosis-respuesta sigue el período basal, y las jeringas deben cambiarse con cada dosis, de 10−10 M a 10−1 M ACh. Antes de iniciar la perfusión de 5-10 min de cada dosis, hay que asegurarse de que el agente farmacológico se ha perfundido completamente a lo largo de la fibra. En el software de adquisición de datos, habrá un aumento inicial en el flujo de glóbulos rojos debido a la perfusión, pero esto no se incluye en los análisis, ya que la recopilación de datos de 5 min para esa concentración no ha comenzado. Una vez que la perfusión para cada dosis ha comenzado, habrá un aumento continuo en el flujo de glóbulos rojos hasta un pico, seguido de una disminución constante. Esta respuesta curvilínea a los agentes farmacológicos se replicará a lo largo del protocolo, pero el flujo de glóbulos rojos será relativamente mayor con el aumento de las concentraciones de ACh. Con concentraciones más bajas de ACh, la respuesta curvilínea puede no ser tan prominente. Ejemplos de flujo de glóbulos rojos no óptimo incluyen los siguientes: 1) una respuesta no curvilínea, en la que el flujo de glóbulos rojos no aumenta y permanece estancado, o 2) concentraciones crecientes de ACh que tienen un impacto mínimo en el flujo de glóbulos rojos, donde el flujo de glóbulos rojos no aumenta relativamente con cada concentración de ACh. Esto depende de la pregunta de investigación y de la cohorte clínica que se esté probando.
Después de la concentración final de ACh, se perfunde el Ringer lactato y se aumentan los calentadores locales a 43 °C. Durante esta fase, se debe obtener una meseta antes de que se perfunda el nitroprusiato de sodio. Esto puede tardar hasta ~45 min, dependiendo de los agentes perfundidos anteriormente. Esta fase no se incluye en los análisis. Una vez que se ha obtenido la meseta durante 5 min, se perfunde nitroprusiato de sodio para producir la vasodilatación local máxima. Esta vasodilatación local máxima se representa como un aumento en el flujo de glóbulos rojos, donde se obtiene una meseta después de ~ 20 minutos de perfusión, o por el flujo de glóbulos rojos que alcanza un pico y disminuye inmediatamente después. Una vez que se ha obtenido una meseta o una disminución en el flujo de glóbulos rojos para el nitroprusiato de sodio, el protocolo está completo. Un ejemplo común de flujo de glóbulos rojos no óptimo es que el valor más alto de flujo de glóbulos rojos se obtiene en una fase diferente del protocolo (p. ej., durante el protocolo dosis-respuesta) en lugar de durante la vasodilatación local máxima.
Protocolo dosis-respuesta acetilcolina: inhibición de la óxido nítrico sintasa
Para cuantificar la contribución del NO al flujo sanguíneo cutáneo en respuesta a la ACh, el éster metílico deN G-nitro-l-arginina (L-NAME), un inhibidor de la NO sintasa, se perfunde en combinación con la ACh a través de una fibra adicional. La Figura 2A muestra un esquema que detalla el protocolo dosis-respuesta ACh con L-NAME. La Figura 2B ilustra los trazados representativos del flujo de glóbulos rojos (promedios de 30 s) del protocolo estandarizado de dosis-respuesta ACh para un sujeto a lo largo del tiempo con L-NAME. La Figura 2C ilustra un archivo de datos sin procesar de un protocolo de dosis-respuesta ACh con L-NAME. Se mantuvieron mediciones de línea de base adicionales en el archivo de datos sin procesar, pero solo se utilizaron ~ 10 minutos de línea de base para el análisis de datos.
Después de la resolución de la hiperemia, un flujo estable de glóbulos rojos durante 5 minutos y un tiempo adecuado para bloquear completamente la vía enzimática de interés (p. ej., NO sintasa) y/o administrar concentraciones adecuadas de cofactores, pueden comenzar los 10 minutos de recopilación de datos basales (representados como una línea horizontal relativamente estable). El protocolo dosis-respuesta sigue la línea de base, y las jeringas deben cambiarse con cada dosis a partir de 1010 M a 101 M ACh con el inhibidor de la NO sintasa (p. ej., 15 mM L-NAME). En presencia de un inhibidor de la NO sintasa, la respuesta curvilínea no se replica bien hasta concentraciones más altas de ACh. Se observará un flujo de glóbulos rojos relativamente menor, en comparación con un sitio sin inhibición de la NO sintasa. Un ejemplo común de flujo de glóbulos rojos no óptimo es la inhibición de la NO sintasa, en comparación con las condiciones sin inhibición de la NO sintasa, lo que resulta en un mayor flujo de glóbulos rojos. Esto indica que el protocolo ha fallado.
Después de la perfusión de la concentración final de ACh, se perfunde el lactato de Ringer y los calentadores locales se aumentan a 43 °C. Durante esta fase, se debe obtener una meseta antes de que se perfunda el nitroprusiato de sodio. Esta fase no se incluye en los análisis. Una vez obtenida la meseta durante 5 min, se perfunde el nitroprusiato sódico, produciendo una vasodilatación local máxima. Durante la vasodilatación local máxima, habrá un aumento exponencial en el flujo de glóbulos rojos debido a la inhibición previa de la NO sintasa. Se obtendrá una meseta después de ~ 20 min de perfusión, o el flujo de glóbulos rojos alcanzará su pico absoluto y disminuirá inmediatamente después. Una vez que se ha obtenido una meseta o una disminución en el flujo de glóbulos rojos para el nitroprusiato de sodio, el protocolo está completo. Un ejemplo común de flujo de glóbulos rojos no óptimo es obtener el valor más alto de flujo de glóbulos rojos en una fase diferente del protocolo (p. ej., durante el protocolo dosis-respuesta) en lugar de durante la vasodilatación local máxima.
Protocolo de calefacción local
La Figura 3A muestra un esquema que detalla el protocolo de calefacción local. La Figura 3B ilustra trazos representativos del flujo de glóbulos rojos (promedios de 30 s) para el protocolo de calentamiento local estandarizado para un sujeto a lo largo del tiempo. La Figura 3C ilustra un archivo de datos sin procesar de un protocolo de calefacción local. Después de la resolución de la hiperemia y un flujo estable de glóbulos rojos durante 5 minutos, pueden comenzar los 10 minutos de la recopilación de datos basales (representados como una línea horizontal relativamente estable). Los calentadores locales se ajustan a 39 °C o 42 °C, y se producirá una respuesta inicial de pico y nadir en el flujo de RBC. Para cuantificar la contribución del NO al flujo sanguíneo cutáneo en respuesta a un estímulo de calor local, se perfunde L-NAME después de que se haya alcanzado una meseta estable en el flujo de glóbulos rojos. Habrá una rápida disminución en el flujo de glóbulos rojos hasta que alcance una nueva meseta en respuesta a L-NAME. Después de 5 min de valores estables de flujo de glóbulos rojos, se perfunde el lactato de Ringer y los calentadores locales se aumentan a 43 °C. El calentamiento producirá una respuesta adicional de pico y nadir en el flujo de glóbulos rojos. Durante esta fase, se debe asegurarse de que se ha obtenido una meseta antes de que se perfunda el nitroprusiato de sodio. Esta fase no se incluye en los análisis. Para inducir la vasodilatación máxima local, se perfunde nitroprusiato de sodio y se produce un rápido aumento del flujo de glóbulos rojos. Una vez que se ha observado una meseta o una disminución en el flujo de glóbulos rojos en respuesta al nitroprusiato de sodio, el protocolo está completo.
Figura 1: Protocolo dosis-respuesta de acetilcolina (ACh). (A) Esquema de un protocolo dosis-respuesta ACh. (B) Rastreo representativo (promedios de 30 s) de un protocolo dosis-respuesta ACh. (C) Datos brutos de un protocolo de dosis-respuesta ACh. Se mantienen mediciones de referencia adicionales en el archivo de datos sin procesar para demostrar las fluctuaciones antes de la estabilización, pero solo se utilizaron ~ 10 minutos de datos estables en reposo para el análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Protocolo dosis-respuesta ACh con inhibición de la óxido nítrico (NO) sintasa. (A) Esquema de un protocolo dosis-respuesta ACh con inhibición de la NO sintasa. (B) Trazado representativo de un protocolo dosis-respuesta ACh con inhibición de la NO sintasa. (C) Datos brutos de un protocolo dosis-respuesta de ACh con inhibición de la NO sintasa. Se mantienen mediciones de referencia adicionales en el archivo de datos sin procesar para demostrar las fluctuaciones antes de la estabilización, pero solo se utilizaron ~ 10 minutos de datos estables en reposo para el análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Protocolo de calefacción local. (A) Esquema de un protocolo de calefacción local. (B) Seguimiento representativo de un protocolo de calefacción local. (C) Datos brutos de un protocolo de calefacción local. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La técnica de microdiálisis intradérmica es una herramienta versátil en la investigación vascular humana. Los investigadores pueden modificar el protocolo para diversificar aún más sus aplicaciones. Por ejemplo, describimos un protocolo dosis-respuesta de ACh, pero otras investigaciones sobre los mecanismos de vasoconstricción o tono vasomotor, en lugar de la vasodilatación sola, han utilizado enfoques dosis-respuesta de norepinefrina o nitroprusiato sódico 26,27,28,29,30,31. Otros mediadores de la vasodilatación, como el mentol o el cloruro de metacloro, también se han empleado en el protocolo dosis-respuesta31,32. El protocolo dosis-respuesta como evaluación farmacológica de la función vascular es una técnica mecanicista más específica para aislar mecanismos de señalización específicos en comparación con el protocolo de calentamiento local, ya que elimina las variaciones en la respuesta simpática a los estímulos térmicos. Sin embargo, el calentamiento local es un enfoque rentable que utiliza un estímulo fisiológico para inducir vasodilatación a través de mecanismos neurogénicos y dependientes del endotelio. También es importante tener en cuenta el mecanismo de interés a la hora de elegir entre un protocolo de calentamiento local de 39 °C o 42 °C. Se ha sugerido que el protocolo de 39 °C aísla mejor la vasodilatación mediada por NO, mientras que el protocolo de 42 °C permite la investigación tanto de la vasodilatación mediada por NO como de la vasodilatación mediada por factores hiperpolarizantes derivados del endotelio33,34. Además, el aumento del CVC en respuesta al calentamiento local de 42 °C tiende a ser más robusto (es decir, alcanzando un % de CVCmáximode 34 grados superiores). Sin embargo, cuando se utiliza un nuevo agente para interrogar una vía de señalización específica, se deben emplear métodos rigurosos para evaluar la eficacia (es decir, bloquear completamente) y/o saturar las concentraciones de los cofactores.
La función endotelial a menudo se mide mediante la técnica de dilatación mediada por flujo, pero la disfunción endotelial en los lechos microvasculares puede ocurrir antes o independientemente de la disfunción endotelial en las grandes arterias de conducto, especialmente en patologías como la HTA 6,7,8. Además, la técnica de dilatación mediada por flujo no permite la disección farmacológica de la fisiopatología de la disfunción endotelial aislada de los efectos sistémicos. Otros métodos para investigar la función endotelial microvascular, como la iontoforesis o la hiperemia reactiva post-oclusiva, son incapaces de dirigirse con precisión a los mecanismos de la función endotelial con intervención farmacológica12. Por lo tanto, la microdiálisis intradérmica permite de manera única investigaciones específicas sobre los mecanismos de la función vascular, y su uso, junto con los resultados de la dilatación mediada por flujo, puede proporcionar una imagen más holística de la función vascular sistémica.
Cualquiera que sea el enfoque de microdiálisis intradérmica que se utilice, se deben tomar ciertas precauciones para garantizar la validez y reproducibilidad de las respuestas. Si bien los detalles del protocolo experimental se pueden ajustar para responder preguntas de investigación específicas, la ubicación precisa de la sonda de microdiálisis es absolutamente crítica. Se debe tener cuidado de insertar la sonda en la dermis y evitar los vasos sanguíneos visibles o palpables más grandes de la piel. La perforación de estos vasos dará como resultado valores unitarios de perfusión anormalmente bajos; en este caso, la flujometría Doppler láser medirá la formación de un hematoma en lugar del flujo de glóbulos rojos a través de un vaso intacto. Después de esto, el siguiente paso más crítico de este protocolo es la resolución de la respuesta hiperémica a la punción con aguja. Si no se permite que la respuesta hiperémica disminuya por completo, las unidades de perfusión registradas a lo largo de la línea de base y las primeras partes del protocolo serán mayores que los valores reales en reposo. Si se ha permitido un tiempo de recuperación suficiente, pero las unidades de perfusión siguen siendo anormalmente altas, puede ser necesario recalibrar las sondas antes de comenzar la fase de recogida de datos de referencia.
Una limitación de la técnica de microdiálisis intradérmica es que no puede aislar específicamente un tipo de tejido para evaluar las vías de señalización vascular. Como los vasos de la piel no se pueden diseccionar y visualizar in vivo, no hay forma de garantizar que la parte semipermeable de una sonda de microdiálisis esté inmediatamente adyacente al tejido de interés (por ejemplo, el endotelio vascular). Por lo tanto, los resultados obtenidos de esta técnica son representativos de la naturaleza integradora de la fisiología humana y proporcionan información sobre la función colectiva del endotelio, el músculo liso vascular y las influencias neuronales en el flujo sanguíneo local. Sin embargo, si se utiliza un protocolo de calentamiento local, permitir que el flujo de glóbulos rojos alcance una meseta en el aumento inicial del calor a 39 °C o 42 °C permite la resolución del reflejo axonal al calor, lo que permite una respuesta mediada principalmente por endotelio, como se discute en otra parte35. Una limitación adicional de esta técnica es el uso de la flujometría láser Doppler como índice del flujo sanguíneo cutáneo. La flujometría láser Doppler cuantifica el flujo de glóbulos rojos, que no tiene en cuenta los cambios en el diámetro del vaso (es decir, la dilatación de la microvasculatura), como sería necesario para cuantificar el flujo absoluto. Puede ser sensible a las diferencias entre participantes o entre condiciones36. Las aplicaciones futuras de la microdiálisis intradérmica pueden incorporar técnicas para cuantificar el flujo sanguíneo microvascular absoluto. Por ejemplo, el reciente desarrollo de la tomografía de coherencia óptica permite cuantificar el diámetro de los vasos mediante imágenes tridimensionales de la microvasculatura de la piel13. La técnica de microdiálisis intradérmica está contraindicada en muy pocos pero importantes casos, que incluyen, entre otros, participantes con afecciones de la piel, participantes con alergias relacionadas con las sustancias descritas aquí, participantes con tripanofobia severa y participantes con tatuajes que cubren la totalidad de la cara ventral del antebrazo (pero los tatuajes pequeños en esta área no son excluyentes).
La capacidad única del enfoque de microdiálisis para ayudar a aislar y delinear los mecanismos fisiopatológicos subyacentes lo hace ventajoso para investigar la etiología variable de la HTA, entre otras ECV. Tras la optimización del protocolo, esta técnica permite evaluar la eficacia de nuevos tratamientos para las ECV. Además, la microdiálisis intradérmica proporciona un método para evaluar los efectos fuera del objetivo de farmacoterapias hipotéticamente no relacionadas, lo que la convierte en una herramienta muy valiosa para informar ensayos clínicos a mayor escala. En conjunto, esta técnica es un activo invaluable en la investigación microvascular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses ni nada que revelar.
Acknowledgments
Ninguno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
References
- Xu, J. Q., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Arias, E.
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93 (2023).
- Cohuet, G., Struijker-Boudier, H. Mechanisms of target organ damage caused by hypertension: Therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 111 (1), 81-98 (2006).
- Park, K. H., Park, W. J. Endothelial dysfunction: Clinical implications in cardiovascular disease and therapeutic approaches. Journal of Korean Medical Science. 30 (9), 1213-1225 (2015).
- Levy, B. I., Ambrosio, G., Pries, A. R., Struijker-Boudier, H. A. Microcirculation in hypertension: a new target for treatment. Circulation. 104 (6), 735-740 (2001).
- Sara, J. D., et al. Prevalence of coronary microvascular dysfunction among patients with chest pain and nonobstructive coronary artery disease. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Interventions. 8 (11), 1445-1453 (2015).
- Weis, M., Hartmann, A., Olbrich, H. G., Hör, G., Zeiher, A. M. Prognostic significance of coronary flow reserve on left ventricular ejection fraction in cardiac transplant recipients. Transplantation. 65 (1), 103-108 (1998).
- Rossi, M., et al. Investigation of skin vasoreactivity and blood flow oscillations in hypertensive patients: Effect of short-term antihypertensive treatment. Journal of Hypertension. 29 (8), 1569-1576 (2011).
- Pepine, C. J., et al. Coronary microvascular reactivity to adenosine predicts adverse outcome in women evaluated for suspected ischemia results from the National Heart, Lung and Blood Institute WISE (Women's Ischemia Syndrome Evaluation) study. Journal of the American College of Cardiology. 55 (25), 2825-2832 (2010).
- Matsuda, J., et al. Prevalence and clinical significance of discordant changes in fractional and coronary flow reserve after elective percutaneous coronary intervention. Journal of the American Heart Association. 5 (12), e004400 (2016).
- Gupta, A., et al. Integrated noninvasive physiological assessment of coronary circulatory function and impact on cardiovascular mortality in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 136 (24), 2325-2336 (2017).
- Roustit, M., Cracowski, J. L. Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 373-384 (2013).
- Low, D. A., Jones, H., Cable, N. T., Alexander, L. M., Kenney, W. L. Historical reviews of the assessment of human cardiovascular function: interrogation and understanding of the control of skin blood flow. European Journal of Applied Physiology. 120 (1), 1-16 (2020).
- Kenney, W. L., Cannon, J. G., Alexander, L. M. Cutaneous microvascular dysfunction correlates with serum LDL and sLOX-1 receptor concentrations. Microvascular Research. 85, 112-117 (2013).
- Holowatz, L. A., Thompson, C. S., Minson, C. T., Kenney, W. L. Mechanisms of acetylcholine-mediated vasodilatation in young and aged human skin. Journal of Physiology. 563, 965-973 (2005).
- Sokolnicki, L. A., Roberts, S. K., Wilkins, B. W., Basu, A., Charkoudian, N. Contribution of nitric oxide to cutaneous microvascular dilation in individuals with type 2 diabetes mellitus. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 292 (1), E314-E318 (2007).
- DuPont, J. J., Ramick, M. G., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species contribute to impaired cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 306 (12), F1499-F1506 (2014).
- Sprung, V. S., et al. Nitric oxide-mediated cutaneous microvascular function is impaired in polycystic ovary syndrome but can be improved by exercise training. Journal of Physiology. 591 (6), 1475-1487 (2013).
- Greaney, J. L., Saunders, E. F. H., Santhanam, L., Alexander, L. M. Oxidative stress contributes to microvascular endothelial dysfunction in men and women with major depressive disorder. Circulatory Research. 124 (4), 564-574 (2019).
- Stanhewicz, A. E., Jandu, S., Santhanam, L., Alexander, L. M. Increased angiotensin II sensitivity contributes to microvascular dysfunction in women who have had preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 382-389 (2017).
- Greaney, J. L., et al. Impaired hydrogen sulfide-mediated vasodilation contributes to microvascular endothelial dysfunction in hypertensive adults. Hypertension. 69 (5), 902-909 (2017).
- Dillon, G. A., Stanhewicz, A. E., Serviente, C., Greaney, J. L., Alexander, L. M. Hydrogen sulfide-dependent microvascular vasodilation is improved following chronic sulfhydryl-donating antihypertensive pharmacotherapy in adults with hypertension. Journal of Physiology. 321 (4), H728-H734 (2021).
- Wong, B. J., et al. Sensory nerve-mediated and nitric oxide-dependent cutaneous vasodilation in normotensive and prehypertensive non-Hispanic blacks and whites. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (2), H271-H281 (2020).
- Dillon, G. A., Greaney, J. L., Shank, S., Leuenberger, U. A., Alexander, L. M. AHA/ACC-defined stage 1 hypertensive adults do not display cutaneous microvascular endothelial dysfunction. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (3), H539-H546 (2020).
- Gagge, A. P., Stolwijk, J. A., Hardy, J. D. Comfort and thermal sensations and associated physiological responses at various ambient temperatures. Environmental Research. 1 (1), 1-20 (1967).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Lack of limb or sex differences in the cutaneous vascular responses to exogenous norepinephrine. Journal of Applied Physiology. 117 (12), 1417-1423 (2014).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Impaired increases in skin sympathetic nerve activity contribute to age-related decrements in reflex cutaneous vasoconstriction. Journal of Physiology. 593 (9), 2199-2211 (2015).
- Alba, B. K., Greaney, J. L., Ferguson, S. B., Alexander, L. M. Endothelial function is impaired in the cutaneous microcirculation of adults with psoriasis through reductions in nitric oxide-dependent vasodilation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (2), H343-H349 (2018).
- Greaney, J. L., Surachman, A., Saunders, E. F. H., Alexander, L. M., Almeida, D. M. Greater daily psychosocial stress exposure is associated with increased norepinephrine-induced vasoconstriction in young adults. Journal of the American Heart Association. 9 (9), e015697 (2020).
- Nakata, T., et al. Quantification of catecholamine neurotransmitters released from cutaneous vasoconstrictor nerve endings in men with cervical spinal cord injury. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (3), R345-R352 (2023).
- Tucker, M. A., et al. Postsynaptic cutaneous vasodilation and sweating: Influence of adiposity and hydration status. European Journal of Applied Physiology. 118 (8), 1703-1713 (2018).
- Craighead, D. H., Alexander, L. M. Menthol-induced cutaneous vasodilation is preserved in essential hypertensive men and women. American Journal of Hypertension. 30 (12), 1156-1162 (2017).
- Brunt, V. E., Minson, C. T. KCa channels and epoxyeicosatrienoic acids: Major contributors to thermal hyperaemia in human skin. Journal of Physiology. 590 (15), 3523-3534 (2012).
- Choi, P. J., Brunt, V. E., Fujii, N., Minson, C. T. New approach to measure cutaneous microvascular function: An improved test of NO-mediated vasodilation by thermal hyperemia. Journal of Applied Physiology. 117 (3), 277-283 (2014).
- Johnson, J. M., Kellogg, D. L. Jr Local thermal control of the human cutaneous circulation. Journal of Applied Physiology. 109 (4), 1229-1238 (2010).
- Jung, F., et al. Laser Doppler flux measurement for the assessment of cutaneous microcirculation-Critical remarks. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 55 (4), 411-416 (2013).
