Summary
Intradermale microdialyse is een minimaal invasieve techniek die wordt gebruikt om de microvasculaire functie bij gezondheid en ziekte te onderzoeken. Zowel dosis-respons- als lokale verwarmingsprotocollen kunnen voor deze techniek worden gebruikt om mechanismen van vasodilatatie en vasoconstrictie in de huidcirculatie te onderzoeken.
Abstract
Het cutane vasculatuur is een toegankelijk weefsel dat kan worden gebruikt om de microvasculaire functie bij mensen te beoordelen. Intradermale microdialyse is een minimaal invasieve techniek die wordt gebruikt om mechanismen van vasculaire gladde spieren en endotheelfunctie in de huidcirculatie te onderzoeken. Deze techniek maakt de farmacologische dissectie mogelijk van de pathofysiologie van microvasculaire endotheeldisfunctie, zoals geïndexeerd door verminderde stikstofmonoxide-gemedieerde vasodilatatie, een indicator van het risico op de ontwikkeling van hart- en vaatziekten. Bij deze techniek wordt een microdialysesonde in de huidlaag van de huid geplaatst en wordt een lokale verwarmingseenheid met een laser Doppler-flowmetriesonde over de sonde geplaatst om de flux van rode bloedcellen te meten. De lokale huidtemperatuur wordt vastgeklemd of gestimuleerd met directe warmtetoepassing, en farmacologische middelen worden door de sonde geperfundeerd om intracellulaire signaalroutes te stimuleren of te remmen om vasodilatatie of vasoconstrictie te induceren of om interessante mechanismen (co-factoren, antioxidanten, enz.) te ondervragen. De vasculaire geleiding van de huid wordt gekwantificeerd en mechanismen van endotheeldisfunctie in ziektetoestanden kunnen worden afgebakend.
Introduction
Hart- en vaatziekten (HVZ) zijn de belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Hypertensie (HTN) is een onafhankelijke risicofactor voor beroerte, coronaire hartziekten en hartfalen en treft naar schatting meer dan ~50% vande bevolking van de Verenigde Staten 2. HTN kan zich ontwikkelen als een onafhankelijke HVZ (primaire HTN) of als gevolg van een andere aandoening, zoals polycysteuze nierziekte en/of endocriene aandoeningen (secundaire HTN). De breedte van de etiologieën van HTN bemoeilijkt het onderzoek naar de onderliggende mechanismen en de schade aan de eindorganen die met HTN worden waargenomen. Diverse en nieuwe onderzoeksbenaderingen naar de pathofysiologie van de schade aan eindorganen geassocieerd met HTN zijn nodig.
Een van de vroegste pathologische symptomen van hart- en vaatziekten is endotheeldisfunctie, zoals gekenmerkt door verminderde stikstofmonoxide (NO)-gemedieerde vasodilatatie 3,4,5. Flow-gemedieerde dilatatie is een veelgebruikte benadering die wordt gebruikt om de endotheeldisfunctie geassocieerd met HVZ te kwantificeren, maar endotheeldisfunctie in microvasculaire bedden kan zowel onafhankelijk zijn van als voorloper zijn van die van grote leidingslagaders 6,7,8. Bovendien worden weerstandsarteriolen directer beïnvloed door lokaal weefsel dan leidingslagaders en hebben ze meer directe controle over de afgifte van zuurstofrijk bloed. Microvasculaire functie is voorspellend voor ongunstige cardiovasculaire gebeurtenisvrije overleving 9,10,11. De cutane microvasculatuur is een toegankelijk vaatbed dat kan worden gebruikt om reacties op fysiologische en farmacologische vasoconstrictieve of vaatverwijdende stimuli te onderzoeken. Intradermale microdialyse is een minimaal invasieve techniek, die tot doel heeft de mechanismen van zowel de vasculaire gladde spier als de endotheelfunctie in de cutane microvasculatuur te onderzoeken met gerichte farmacologische dissectie. Deze methode staat in contrast met andere technieken, zoals post-occlusieve reactieve hyperemie, die geen farmacologische dissectie mogelijk maakt, en iontoforese, die farmacologische toediening mogelijk maakt, maar minder nauwkeurig is in zijn werkingsmechanisme (elders grondig besproken12).
De grondgedachte achter de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek wordt elders uitgebreid besproken13. Deze benadering werd oorspronkelijk ontwikkeld voor gebruik in neurologisch onderzoek bij knaagdieren en werd vervolgens voor het eerst toegepast op mensen om de mechanismen die ten grondslag liggen aan actieve vasodilatatie te onderzoeken vanuit een thermoregulerend standpunt. Aan het eind van de jaren 1990 werd deze methode gebruikt om zowel neurale als endotheelmechanismen te onderzoeken met betrekking tot lokale verwarming van de huid. Sinds die tijd wordt de techniek gebruikt om een aantal neurovasculaire signaleringsmechanismen in de huid te onderzoeken.
Met behulp van deze techniek hebben onze groep en anderen de mechanismen van endotheeldisfunctie in de microvasculatuur van verschillende klinische populaties onderzocht, waaronder, maar niet beperkt tot, dyslipidemie, primaire veroudering, diabetes, chronische nierziekte, polycysteus ovariumsyndroom, pre-eclampsie, depressieve stoornis 14,15,16,17,18,19 en hypertensie 20,21,22,23,24. Uit een eerdere studie bleek bijvoorbeeld dat normotensieve vrouwen met een voorgeschiedenis van pre-eclampsie, die een verhoogd risico lopen op HVZ, een verminderde NO-gemedieerde vasodilatatie in de huidcirculatie hadden in vergelijking met vrouwen met een voorgeschiedenis van normotensieve zwangerschap20. In een ander onderzoek vertoonden volwassenen met de diagnose primaire HTN een verhoogde angiotensine II-gevoeligheid in de microvasculatuur in vergelijking met gezonde controles21, en het is aangetoond dat chronische sulfhydryldonerende antihypertensieve farmacotherapie bij primaire HTN-patiënten de bloeddruk verlaagt en zowel waterstofsulfide- als NO-gemedieerde vasodilatatie verbetert22. Wong et al.23 vonden verminderde sensorisch gemedieerde en NO-gemedieerde vasodilatatie bij prehypertensieve volwassenen, wat samenviel met onze bevinding van een progressie van endotheeldisfunctie met toenemende HTN-stadia, zoals gecategoriseerd door de richtlijnen van de American Heart Association en het American College of Cardiologyuit 2017 24.
De intradermale microdialysetechniek maakt streng gecontroleerd mechanistisch onderzoek naar de microvasculaire functie in gezondheids- en ziektetoestanden mogelijk. Daarom heeft dit artikel tot doel de intradermale microdialysetechniek te beschrijven zoals toegepast door onze groep en anderen. We beschrijven de procedures voor zowel farmacologische stimulatie van het endotheel met acetylcholine (ACh) om de dosis-responsrelatie te onderzoeken als fysiologische stimulatie van endogene NO-productie met een lokaal verwarmingsstimuleringsprotocol van 39 °C of 42 °C. We presenteren representatieve resultaten voor elke benadering en bespreken de klinische implicaties van de bevindingen die uit deze techniek zijn voortgekomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures worden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Pennsylvania State University voorafgaand aan de werving van deelnemers.
1. Installatie van de apparatuur
- Schakel de lokale verwarmingseenheid en de laser Doppler-debietmeter in.
NOTITIE: Beide moeten worden gekalibreerd voordat de gegevens worden verzameld volgens de instructies van de fabrikant. De laser Doppler-debietmeter moet worden aangesloten op data-acquisitiehardware met bemonstering bij 100 Hz (100 samples/min) en continue registratie in data-acquisitiesoftware. Hoewel andere hardware en software voor data-acquisitie kan worden gebruikt, weerspiegelen de overige instructies voor de eenvoud de PowerLab-hardware en LabChart-softwaremogelijkheden. - Open een LabChart-softwarebestand.
OPMERKING: Er moet vooraf een referentiebestand worden gemaakt met de gewenste gegevensinvoer en continue gegevensverzamelingsmogelijkheden. Er moet één paneel zijn voor elke laserdoppler en lokale verwarming die overeenkomt met elke microdialyselocatie, en de panelen moeten overeenkomen met de juiste kanaalingangen in de hardware-eenheid voor data-acquisitie.
2. Plaatsing van microdialysevezels
- Identificeer de grote, zichtbare bloedvaten van de huid in het ventrale aspect van de onderarm en geef ze aan met een permanente marker (gebruik indien nodig een tourniquet om de bloedvaten te visualiseren; het identificeren van bloedvaten in een donker gepigmenteerde huid kan een grotere afhankelijkheid van palpatie vereisen).
- Veeg het gebied dat de markeringen en een groot deel van het omliggende gebied omvat met behulp van beadine-wattenstaafjes. Veeg de betadine weg met alcoholdoekjes. Bedek het gesteriliseerde deel van de huid met een steriel laken en breng ijs aan gedurende ~ 5 minuten om het gebied te verdoven.
- Verwijder het ijs en steek een inbrengnaald (23 G, lengte 25 mm), schuin naar boven gericht, op een diepte van 2-3 mm (afhankelijk van de individuele huiddikte) in de huidlaag. Schuif de naald naar voren, zorg ervoor dat deze in de huidlaag blijft en verlaat de huid ~20 mm vanaf het inbrengpunt.
NOTITIE: Om de juiste diepte van plaatsing in de huid te bevestigen, moet de vorm van de naald zichtbaar en gemakkelijk voelbaar zijn, maar de kleur van de naald moet worden verborgen. Als er meer dan één microdialysesonde nodig is voor het experiment, moeten twee willekeurige inbrengnaalden ≥2,5 cm uit elkaar worden geplaatst en worden gepositioneerd voordat de microdialysesonde wordt ingebracht. Sondes mogen niet langs hetzelfde grote vat worden geplaatst. - Laat de naald op zijn plaats zitten en sluit de sonde (via de Luer-vergrendeling) aan op een spuit met Ringer-lactaatoplossing. Voer het andere uiteinde van de sonde door de inbrengnaald totdat het semipermeabele membraan van de sonde zich in de buurt van maar nog steeds buiten de opening van de inbrengnaald bevindt. Laat langzaam een kleine hoeveelheid Ringer's oplossing door de vezel doordringen totdat de oplossing zichtbaar door de poriën van het membraan is geperfuseerd om de integriteit van het membraan te bevestigen.
- Als u een microdialysesonde en inbrengnaald van Harvard Bioscience gebruikt, volgt u de stappen 2.5.1-2.5.2.
- Na bevestiging van de sondefunctie, voert u de sonde verder door de inbrengnaald totdat het membraan volledig in de huidlaag van de huid in de inbrengnaald zit.
- Bevestig de sonde met een vinger op zijn plaats proximaal van de naald en trek de naald terug in de tegenovergestelde richting van het inbrengen. Plak het buitenste deel van de vezel op zijn plaats op de huid om verplaatsing van het semipermeabele membraan tijdens het experiment te voorkomen.
- Als u een microdialysesonde en inbrengnaald van Bioanalytical Systems gebruikt, volgt u de stappen 2.6.1-2.6.2.
- Na bevestiging van de sondefunctie, pakt u de naaf van de inbrengnaald en het distale gedeelte van de microdialysesonde in één hand vast en trekt u tegelijkertijd de naald terug die tegengesteld is aan de inbrengrichting, waarbij u de microdialysesonde op zijn plaats beweegt.
- Pas de sonde indien nodig aan om ervoor te zorgen dat het semipermeabele membraan volledig in de huid wordt begraven. Plak de externe vezel op zijn plaats op de huid om verplaatsing van het semipermeabele membraan tijdens het experiment te voorkomen.
3. Hyperemie
- Terwijl u wacht tot de hyperemische respons op het inbrengen van de naald afneemt (~60-90 min), plaatst u de spuit voor eenmalig gebruik in de spuithouder op de micro-infuuspompen. Perfuseer Ringer-lactaatoplossing, zoutoplossing of mediumoplossing (de oplossing waarin het experimentele farmacologische middel is opgelost; 2 μL/min) tijdens de hyperemiefase.
NOTITIE: Hoewel de microdialysesondes niet kunnen worden verwijderd tijdens deze fase van ~60-90 minuten, kan de deelnemer zijn lichaamshouding aanpassen of zijn hand bewegen, of de Luer-vergrendeling van de sonde kan uit de spuit worden verwijderd en met tape aan de arm van de deelnemer worden bevestigd, zodat deze vrij kan bewegen om kort te staan. Eenmaal geïnstrumenteerd met lokale verwarmers en laser Doppler flowmetry (LDF)-sondes en zodra het verzamelen van gegevens is begonnen, kunnen de LDF-sondes niet worden verplaatst. - Wanneer de roodheid van de huid, die een indicator is van de hyperemische reactie op naaldtrauma, is verdwenen, bevestigt u de lokale verwarmingseenheid aan de huid die het semipermeabele membraan bedekt via de sondeplakschijf, waarbij u ervoor zorgt dat het midden van de verwarmer is uitgelijnd met het pad van de microdialysesonde.
- Plaats de LDF-sonde in de opening in het midden van de lokale verwarmer zodat de laser loodrecht op het huidoppervlak staat. Zodra de LDF-sondes zijn geplaatst en vastgezet, klikt u op start in de data-acquisitiesoftware om continu de fluxwaarden van de rode bloedcellen (RBC-flux; perfusie-eenheden, PU's) te registreren en weer te geven. Als hyperemie volledig is verdwenen, zal de RBC-flux stabiel zijn op ~5-20 PU (de pulsatiliteit van de bloedvaten onder de LDF-sonde kan worden weerspiegeld door lichte verhogingen in de PU die samenvallen met de hartslag).
- Plaats een automatische bloeddrukmanchet om de arm van een proefpersoon die niet is geïnstrumenteerd.
- Stel de lokale kachels in op 33 °C om de huidtemperatuur binnen een thermoneutraal bereikvan 25 te klemmen, waardoor eventuele variaties in de invloed van thermische prikkels worden uitgesloten. Als u een opmerking wilt toevoegen aan de doorlopende opname in de data-acquisitiesoftware om gebeurtenissen in het experiment aan te duiden, klikt u op het tekstvak in de rechterbovenhoek van het scherm, typt u een opmerking, selecteert u welke kanalen de opmerking moeten ontvangen en klikt u op toevoegen.
4. Dosis-responsprotocol voor acetylcholine
- Zodra de RBC-flux is gestabiliseerd als reactie op de lokale hitte van 33 °C, begint u met het verzamelen van basisgegevens, die in het softwarebestand voor gegevensacquisitie worden onderscheiden door een opmerking bij het begin van de basislijn. Voor gegevensanalyse is ten minste minimaal 5-10 minuten stabiele basislijn vereist; start de basislijn indien nodig op elk gewenst moment tijdens dit punt in de gegevensverzameling opnieuw en markeer dit in het LabChart-bestand. Verzamel in de laatste minuut van de basislijn een bloeddrukmeting en voer de waarden in een opmerking in het LabChart-bestand in.
- Meet en registreer aan het einde van de 5-10 minuten van de basislijngegevensverzameling de basislijnbloeddruk en voer de basislijn aan het einde van de opmerking in de gegevensverzamelingssoftware in.
- Schakel de micro-infuuspompen uit en vervang de spuiten vol met Ringer-lactaatoplossing door de spuit gevuld met de laagste concentratie ACh (10-10 M).
- Zet de nieuwe spuiten op hun plaats vast en bevestig de perfusie van de vloeistof door het uiteinde van de sonde voordat u de micro-infuuspompen weer inschakelt. Voer het commentaarbegin −10 in de opname van de gegevensacquisitiesoftware in.
- Elke concentratie ACh wordt gedurende 5-10 minuten geperfundeerd bij 2 μL/min. Meet en registreer in de laatste minuut van de perfusie voor elke concentratie de bloeddruk. Zodra de perfusietijd voor een bepaalde concentratie is verstreken, vervangt u de spuit door de op één na hoogste concentratie (bijv. 10−10 M ACh-oplossing wordt vervangen door 10−9 M ACh-oplossing), zoals beschreven in de stappen 4.2-4.4.
- Vervang onmiddellijk na het doorbloeden van de eindconcentratie ACh (10−1 M) de ACh-spuit door een spuit met Ringer-oplossing en verhoog de plaatselijke verwarmingstemperatuur tot 43 °C. Zodra de RBC-flux is gestabiliseerd, vervangt u de oplossing van de Ringer door natriumnitroprusside (28 mM) om zowel een door warmte geïnduceerde als farmacologisch geïnduceerde maximale lokale vasodilatatie te produceren. Meet en registreer de bloeddruk elke ~3 minuten tijdens deze maximale vaatverwijdingsfase.
- Zodra een maximaal RBC-fluxplateau is opgetreden (~5 min stabiel PU), beëindigt u het experiment. Selecteer stop in de rechterbenedenhoek van de software voor gegevensverzameling om de continue gegevensverzameling te beëindigen.
5. Lokaal verwarmingsprotocol
- Zodra de RBC-flux is gestabiliseerd na hyperemie, begint u met het verzamelen van basisgegevens en geeft u dit aan in het softwarebestand voor gegevensacquisitie met een opmerking. Verzamel in de laatste minuut van de basislijn een bloeddrukmeting en voer de waarden in een opmerking in het softwarebestand voor gegevensverzameling in.
- Verhoog de lokale verwarmingssystemen tot 39 °C of 42 °C, afhankelijk van de behoeften van het protocol (uitgelegd in het discussiegedeelte).
- Zodra de RBC-flux een plateau heeft bereikt als reactie op lokale warmtetoepassing (~40-60 min verwarming), doordrenkt u N G-nitro-l-argininemethylester (L-NAME; 15 mM opgelost in de oplossing van Ringer; 2 μL/min; een NO-synthaseremmer) door de microdialysesonde(n).
- Zodra de RBC-flux een plateau heeft bereikt als reactie op L-NAME (~15-25 min perfusie), verhoogt u de lokale verwarmers tot 43 °C.
- Zodra de RBC-flux een plateau heeft bereikt als reactie op 43 °C (een plateau van ~2-5 minuten treedt op na ~20-45 minuten verhitting), doordrenkt u natriumnitroprusside (28 mM opgelost in de oplossing van Ringer) door de microdialysesonde(n).
- Zodra een maximaal RBC-fluxplateau is opgetreden (~5 min stabiel PU), beëindigt u het experiment. Selecteer stop in de rechterbenedenhoek van de software voor gegevensverzameling om de gegevensverzameling te beëindigen.
6. Verwijderen van de microdialysesondes
- Gebruik na afloop van het experiment een chirurgische schaar om de microdialysesondes door te knippen. Verwijder voorzichtig de LDF-sondes van de verwarmers en verwijder de verwarmers van de huid. Verwijder voorzichtig de tape die de sondes op hun plaats houdt op de huid.
- Identificeer visueel welke prikplaats aan weerszijden van de sonde het kleinste bloedstolsel heeft gevormd. Snijd het gedeelte van de sonde in de buurt van de plaats met het kleinere stolsel en laat ~1 in de sonde buiten de huid ongesneden.
- Reinig het deel van de huid rond de in- en uitgangen van de sonde met een alcoholdoekje, evenals de ~1 lengte van de sonde die op de minder gestold plaats is achtergebleven.
- Laat de alcohol op de huid drogen. Pak vervolgens het deel van de sonde vast dat zich uitstrekt vanaf de prikplaats met het grotere stolsel, tegenover het gedeelte ~1 aan het minder gestolde uiteinde. Trek de sonde langzaam in de richting van het grotere bloedstolsel.
- Plaats een steriel gaasje over eventuele bloedingen die het gevolg zijn van het verwijderen van de sonde en oefen druk uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Acetylcholine dosis-respons protocol
Figuur 1A toont een schema waarin het ACh dosis-responsprotocol wordt beschreven. Figuur 1B illustreert representatieve traceringen van de RBC-fluxwaarden (perfusie-eenheden, PU; 30 s gemiddelden) van het gestandaardiseerde ACh dosis-responsprotocol voor één proefpersoon in de loop van de tijd. Figuur 1C illustreert een onbewerkt gegevensbestand van een ACh dosis-respons protocol. Aanvullende basismetingen werden bijgehouden in het onbewerkte gegevensbestand, maar slechts ~10 minuten van de basislijn werden gebruikt voor de gegevensanalyse.
Na het verdwijnen van hyperemie en een stabiele RBC-flux gedurende 5 minuten, kan de verzameling van basisgegevens van 10 minuten beginnen. De basislijn wordt weergegeven als een relatief stabiele horizontale RBC-fluxlijn, waarbij elke oorzaak voor afwijkingen (bijv. bewegingsartefacten, sonde-aanpassingen) moet worden geregistreerd als opmerkingen van de data-acquisitiesoftware voor analysedoeleinden. Het dosis-responsprotocol volgt de basislijnperiode en de spuiten moeten bij elke dosis worden vervangen, van 10-10 M tot 10-1 M ACh. Voordat de perfusie van 5-10 minuten van elke dosis wordt gestart, moet men ervoor zorgen dat het farmacologische middel volledig door de lengte van de vezel is doorbloed. In de data-acquisitiesoftware zal er een eerste stijging van de RBC-flux zijn als gevolg van de perfusie, maar dit is niet opgenomen in de analyses, omdat de gegevensverzameling van 5 minuten voor die concentratie nog niet is begonnen. Zodra de perfusie voor elke dosis is begonnen, zal er een voortdurende toename zijn van de RBC-flux tot een piek, gevolgd door een gestage daling. Deze kromlijnige respons op farmacologische middelen zal in het hele protocol worden gerepliceerd, maar de RBC-flux zal relatief groter zijn bij toenemende concentraties ACh. Bij lagere concentraties ACh is de kromlijnige respons mogelijk niet zo prominent. Voorbeelden van niet-optimale RBC-flux zijn de volgende: 1) een niet-kromlijnige respons, waarbij de RBC-flux niet toeneemt en op een plateau blijft, of 2) toenemende ACh-concentraties met een minimale impact op de RBC-flux, waarbij de RBC-flux niet relatief toeneemt met elke concentratie ACh. Dit is afhankelijk van de onderzoeksvraag en het klinische cohort dat wordt getest.
Na de eindconcentratie ACh wordt Ringer-lactaat geperfundeerd en worden de lokale verwarmers verhoogd tot 43 °C. Tijdens deze fase moet een plateau worden verkregen voordat natriumnitroprusside wordt geperfuseerd. Dit kan tot ~45 minuten duren, afhankelijk van de eerder toegediende middelen. Deze fase wordt niet meegenomen in de analyses. Zodra het plateau gedurende 5 minuten is verkregen, wordt natriumnitroprusside geperfundeerd om maximale lokale vasodilatatie te produceren. Deze maximale lokale vasodilatatie wordt afgebeeld als een stijging van de RBC-flux, waarbij een plateau wordt verkregen na ~20 minuten perfusie, of doordat de RBC-flux een piek bereikt en onmiddellijk daarna afneemt. Zodra een plateau of een daling van de RBC-flux is verkregen voor natriumnitroprusside, is het protocol voltooid. Een veelvoorkomend voorbeeld van niet-optimale RBC-flux is dat de hoogste waarde van RBC-flux wordt verkregen in een andere fase van het protocol (bijv. tijdens het dosis-responsprotocol) in plaats van tijdens de maximale lokale vasodilatatie.
Acetylcholine dosis-respons protocol: remming van stikstofmonoxidesynthase
Om de bijdrage van NO aan de doorbloeding van de huid als reactie op ACh te kwantificeren, wordt N-G-nitro-l-argininemethylester (L-NAME), een NO-synthaseremmer, geperfundeerd in combinatie met ACh via een extra vezel. Figuur 2A toont een schema van het ACh dosis-respons protocol met L-NAME. Figuur 2B illustreert representatieve traceringen van de RBC-flux (30 s-gemiddelden) van het gestandaardiseerde ACh-dosis-responsprotocol voor één proefpersoon in de loop van de tijd met L-NAME. Figuur 2C illustreert een onbewerkt gegevensbestand van een ACh dosis-responsprotocol met L-NAME. Aanvullende basismetingen werden bijgehouden in het onbewerkte gegevensbestand, maar slechts ~10 minuten van de basislijn werden gebruikt voor de gegevensanalyse.
Na het verdwijnen van hyperemie, een stabiele RBC-flux gedurende 5 minuten en voldoende tijd om de enzymatische route van belang volledig te blokkeren (bijv. NO-synthase) en/of adequate concentraties co-factoren af te geven, kan de 10 minuten van het verzamelen van basisgegevens beginnen (afgebeeld als een relatief stabiele horizontale lijn). Het dosis-responsprotocol volgt de uitgangswaarde en de spuiten moeten bij elke dosis worden vervangen, beginnend bij 1010 M tot 101 M ACh met de NO-synthaseremmer (bijv. 15 mM L-NAME). In aanwezigheid van een NO-synthaseremmer wordt de kromlijnige respons niet goed gerepliceerd tot hogere concentraties ACh. Een relatief lagere RBC-flux zal worden waargenomen in vergelijking met een site zonder remming van NO synthase. Een veelvoorkomend voorbeeld van niet-optimale RBC-flux is de NO-synthase-remming, in vergelijking met de omstandigheden zonder NO-synthase-remming, wat resulteert in een hogere RBC-flux. Dit geeft aan dat het protocol heeft gefaald.
Na perfusie van de eindconcentratie ACh wordt Ringer-lactaat geperfundeerd en worden de lokale verwarmers verhoogd tot 43 °C. Tijdens deze fase moet een plateau worden verkregen voordat natriumnitroprusside wordt geperfuseerd. Deze fase wordt niet meegenomen in de analyses. Zodra het plateau gedurende 5 minuten is verkregen, wordt natriumnitroprusside geperfundeerd, waardoor maximale lokale vasodilatatie ontstaat. Tijdens maximale lokale vasodilatatie zal er een exponentiële stijging van de RBC-flux zijn als gevolg van de eerdere NO-synthaseremming. Een plateau wordt verkregen na ~20 minuten perfusie, of de RBC-flux bereikt zijn absolute piek en daalt onmiddellijk daarna. Zodra een plateau of een daling van de RBC-flux is verkregen voor natriumnitroprusside, is het protocol voltooid. Een veelvoorkomend voorbeeld van niet-optimale RBC-flux is het verkrijgen van de hoogste RBC-fluxwaarde in een andere fase van het protocol (bijv. tijdens het dosis-responsprotocol) in plaats van tijdens de maximale lokale vasodilatatie.
Lokaal verwarmingsprotocol
Figuur 3A toont een schema waarin het lokale verwarmingsprotocol wordt weergegeven. Figuur 3B illustreert representatieve traceringen van de RBC-flux (30 s-gemiddelden) voor het gestandaardiseerde lokale verwarmingsprotocol voor één proefpersoon in de loop van de tijd. Figuur 3C illustreert een onbewerkt gegevensbestand van een lokaal verwarmingsprotocol. Na het verdwijnen van hyperemie en een stabiele RBC-flux gedurende 5 minuten, kan de 10 minuten van baseline gegevensverzameling beginnen (afgebeeld als een relatief stabiele horizontale lijn). De lokale verwarmers zijn ingesteld op 39 °C of 42 °C, en een eerste piek- en nadirrespons zal optreden in de RBC-flux. Om de bijdrage van NO aan de huidbloedstroom als reactie op een lokale warmteprikkel te kwantificeren, wordt L-NAME geperfundeerd nadat een stabiel plateau in de RBC-flux is bereikt. Er zal een snelle daling zijn in de RBC-flux totdat deze een nieuw plateau bereikt als reactie op L-NAME. Na 5 minuten stabiele RBC-fluxwaarden wordt Ringer-lactaat geperfundeerd en worden de lokale verwarmers verhoogd tot 43 °C. De verwarming zal een extra piek- en nadirrespons in de RBC-flux produceren. Tijdens deze fase moet men ervoor zorgen dat er een plateau is verkregen voordat natriumnitroprusside wordt geperfuseerd. Deze fase wordt niet meegenomen in de analyses. Om lokale maximale vasodilatatie te induceren, wordt natriumnitroprusside geperfundeerd en zal een snelle toename van de RBC-flux optreden. Zodra een plateau of een afname van de RBC-flux is waargenomen als reactie op natriumnitroprusside, is het protocol voltooid.
Figuur 1: Acetylcholine (ACh) dosis-respons protocol. (A) Schema van een ACh dosis-respons protocol. (B) Representatief traceren (30 s gemiddelden) van een ACh dosis-respons protocol. (C) Ruwe gegevens van een ACh dosis-responsprotocol. Aanvullende basismetingen worden bijgehouden in het onbewerkte gegevensbestand om de fluctuaties voorafgaand aan stabilisatie aan te tonen, maar slechts ~10 minuten aan stabiele rustgegevens werden gebruikt voor de gegevensanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: ACh dosis-responsprotocol met remming van stikstofmonoxide (NO)-synthase. (A) Schema van een ACh dosis-responsprotocol zonder remming van synthase. (B) Representatief traceren van een ACh dosis-responsprotocol zonder remming van synthase. (C) Ruwe gegevens van een ACh dosis-responsprotocol zonder synthaseremming. Aanvullende basismetingen worden bijgehouden in het onbewerkte gegevensbestand om de fluctuaties voorafgaand aan stabilisatie aan te tonen, maar slechts ~10 minuten aan stabiele rustgegevens werden gebruikt voor de gegevensanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Lokaal verwarmingsprotocol. (A) Schema van een lokaal verwarmingsprotocol. (B) Representatief traceren van een lokaal verwarmingsprotocol. (C) Ruwe gegevens van een lokaal verwarmingsprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De intradermale microdialysetechniek is een veelzijdig hulpmiddel in menselijk vasculair onderzoek. Onderzoekers kunnen het protocol wijzigen om de toepassingen verder te diversifiëren. We beschrijven bijvoorbeeld een ACh dosis-responsprotocol, maar andere onderzoeken naar de mechanismen van vasoconstrictie of vasomotorische tonus, in plaats van alleen vasodilatatie, hebben gebruik gemaakt van norepinefrine of natriumnitroprusside dosis-responsbenaderingen 26,27,28,29,30,31. Andere mediatoren van vasodilatatie, zoals menthol of metachloorchloride, zijn ook gebruikt in het dosis-responsprotocol31,32. Het dosis-responsprotocol als farmacologische beoordeling van de vasculaire functie is een meer gerichte, mechanistische techniek om specifieke signaleringsmechanismen te isoleren in vergelijking met het lokale verwarmingsprotocol, omdat het variaties in de sympathische respons op thermische stimuli verwijdert. Lokale verwarming is echter een kosteneffectieve benadering die een fysiologische stimulus gebruikt om vasodilatatie te induceren via zowel neurogene als endotheelafhankelijke mechanismen. Het is ook belangrijk om rekening te houden met het mechanisme dat van belang is bij de keuze tussen een lokaal verwarmingsprotocol van 39 °C of 42 °C. Het 39 °C-protocol is voorgesteld om NO-gemedieerde vasodilatatie beter te isoleren, terwijl het 42 °C-protocol het onderzoek van zowel NO-gemedieerde vasodilatatie als endotheel-afgeleide hyperpolarisatiefactor-gemedieerde vasodilatatie mogelijk maakt 33,34. Bovendien is de CVC-toename als reactie op lokale verwarming van 42 °C meestal robuuster (d.w.z. het bereiken van een hoger %CVCmax34). Bij het gebruik van een nieuw middel om een specifieke signaalroute te ondervragen, moeten echter rigoureuze methoden worden gebruikt om de werkzaamheid (d.w.z. volledig blokkeren) en/of de concentraties van de co-factoren te verzadigen.
De endotheelfunctie wordt vaak gemeten met behulp van de flow-gemedieerde dilatatietechniek, maar endotheeldisfunctie in microvasculaire bedden kan optreden voorafgaand aan of onafhankelijk van endotheeldisfunctie in grote leidingslagaders, vooral bij pathologieën zoals HTN 6,7,8. Bovendien laat de flow-gemedieerde dilatatietechniek de farmacologische dissectie van de pathofysiologie van endotheeldisfunctie niet toe in isolatie van systemische effecten. Andere methoden voor het onderzoeken van de microvasculaire endotheelfunctie, zoals iontoforese of postocclusieve reactieve hyperemie, zijn niet in staat om de mechanismen van de endotheelfunctie nauwkeurig aan te pakken met farmacologische interventie12. Daarom maakt intradermale microdialyse op unieke wijze gericht onderzoek mogelijk naar de mechanismen van de vasculaire functie, en het gebruik ervan, samen met flow-gemedieerde dilatatie-uitkomsten, kan een meer holistisch beeld geven van de systemische vasculaire functie.
Welke intradermale microdialysebenadering ook wordt gebruikt, er moeten bepaalde voorzorgsmaatregelen worden genomen om de validiteit en reproduceerbaarheid van de reacties te waarborgen. Hoewel de specifieke kenmerken van het experimentele protocol kunnen worden aangepast om specifieke onderzoeksvragen te beantwoorden, is de precieze plaatsing van de microdialysesonde absoluut cruciaal. Er moet voor worden gezorgd dat de sonde in de dermis wordt ingebracht en dat de grotere zichtbare of voelbare bloedvaten van de huid worden vermeden. Het doorboren van deze vaten zal resulteren in abnormaal lage perfusie-eenheidswaarden; in dit geval meet de laser Doppler-flowmetrie de vorming van een hematoom in plaats van de stroom van rode bloedcellen door een intact vat. Hierna is de volgende meest kritische stap van dit protocol het oplossen van de hyperemische respons op de naaldpunctie. Als de hyperemische respons niet volledig afneemt, zullen de geregistreerde perfusie-eenheden gedurende de basislijn en de vroege delen van het protocol groter zijn dan de werkelijke rustwaarden. Als er voldoende hersteltijd is toegestaan, maar de perfusie-eenheden abnormaal hoog blijven, kan een herkalibratie van de sondes nodig zijn voordat met de basisfase van het verzamelen van gegevens wordt begonnen.
Een beperking van de intradermale microdialysetechniek is dat het niet specifiek een weefseltype kan isoleren om vasculaire signaalroutes te evalueren. Aangezien de bloedvaten van de huid niet in vivo kunnen worden ontleed en gevisualiseerd, is er geen manier om ervoor te zorgen dat het semipermeabele deel van een microdialysesonde onmiddellijk grenst aan het weefsel van belang (bijv. het vasculaire endotheel). Daarom zijn de resultaten van deze techniek representatief voor de integratieve aard van de menselijke fysiologie en geven ze inzicht in de collectieve functie van het endotheel, vasculaire gladde spieren en neurale invloeden op de lokale bloedstroom. Bij gebruik van een lokaal verwarmingsprotocol kan de axonale reflex op de warmte worden opgelost door de RBC-flux een plateau te laten bereiken bij de aanvankelijke toename van de warmte tot 39 °C of 42 °C, waardoor een voornamelijk endotheel-gemedieerde respons mogelijk wordt, zoals elders besproken35. Een bijkomende beperking van deze techniek is het gebruik van laser Doppler flowmetrie als index van de doorbloeding van de huid. Laser Doppler-flowmetrie kwantificeert de flux van rode bloedcellen, die geen rekening houdt met de veranderingen in de vaatdiameter (d.w.z. verwijding van de microvasculatuur), zoals nodig zou zijn om de absolute stroom te kwantificeren. Het kan gevoelig zijn voor verschillen tussen deelnemers of tussen omstandigheden36. Toekomstige toepassingen van intradermale microdialyse kunnen technieken bevatten om de absolute microvasculaire bloedstroom te kwantificeren. De recente ontwikkeling van optische coherentietomografie maakt het bijvoorbeeld mogelijk om de diameter van de bloedvaten te kwantificeren met behulp van driedimensionale beeldvorming van de huidmicrovasculatuur13. De intradermale microdialysetechniek is gecontra-indiceerd in zeer weinig maar belangrijke gevallen, waaronder, maar niet beperkt tot, deelnemers met huidaandoeningen, deelnemers met allergieën die verband houden met de hier beschreven stoffen, deelnemers met ernstige trypanofobie en deelnemers met tatoeages die het hele ventrale aspect van de onderarm bedekken (maar kleine tatoeages in dit gebied zijn niet exclusief).
Het unieke vermogen van de microdialysebenadering om te helpen bij het isoleren en afbakenen van onderliggende pathofysiologische mechanismen maakt het voordelig voor het onderzoeken van de variabele etiologie van HTN, naast andere HVZ's. Na protocoloptimalisatie maakt deze techniek het mogelijk om de werkzaamheid van nieuwe CVD-behandelingen te evalueren. Bovendien biedt intradermale microdialyse een methode voor het beoordelen van de off-target effecten van hypothetisch niet-verwante farmacotherapieën, waardoor het een zeer waardevol hulpmiddel is voor het informeren van grootschaligere klinische onderzoeken. Alles bij elkaar is deze techniek van onschatbare waarde in microvasculair onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten en niets te onthullen.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
References
- Xu, J. Q., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Arias, E.
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93 (2023).
- Cohuet, G., Struijker-Boudier, H. Mechanisms of target organ damage caused by hypertension: Therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 111 (1), 81-98 (2006).
- Park, K. H., Park, W. J. Endothelial dysfunction: Clinical implications in cardiovascular disease and therapeutic approaches. Journal of Korean Medical Science. 30 (9), 1213-1225 (2015).
- Levy, B. I., Ambrosio, G., Pries, A. R., Struijker-Boudier, H. A. Microcirculation in hypertension: a new target for treatment. Circulation. 104 (6), 735-740 (2001).
- Sara, J. D., et al. Prevalence of coronary microvascular dysfunction among patients with chest pain and nonobstructive coronary artery disease. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Interventions. 8 (11), 1445-1453 (2015).
- Weis, M., Hartmann, A., Olbrich, H. G., Hör, G., Zeiher, A. M. Prognostic significance of coronary flow reserve on left ventricular ejection fraction in cardiac transplant recipients. Transplantation. 65 (1), 103-108 (1998).
- Rossi, M., et al. Investigation of skin vasoreactivity and blood flow oscillations in hypertensive patients: Effect of short-term antihypertensive treatment. Journal of Hypertension. 29 (8), 1569-1576 (2011).
- Pepine, C. J., et al. Coronary microvascular reactivity to adenosine predicts adverse outcome in women evaluated for suspected ischemia results from the National Heart, Lung and Blood Institute WISE (Women's Ischemia Syndrome Evaluation) study. Journal of the American College of Cardiology. 55 (25), 2825-2832 (2010).
- Matsuda, J., et al. Prevalence and clinical significance of discordant changes in fractional and coronary flow reserve after elective percutaneous coronary intervention. Journal of the American Heart Association. 5 (12), e004400 (2016).
- Gupta, A., et al. Integrated noninvasive physiological assessment of coronary circulatory function and impact on cardiovascular mortality in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 136 (24), 2325-2336 (2017).
- Roustit, M., Cracowski, J. L. Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 373-384 (2013).
- Low, D. A., Jones, H., Cable, N. T., Alexander, L. M., Kenney, W. L. Historical reviews of the assessment of human cardiovascular function: interrogation and understanding of the control of skin blood flow. European Journal of Applied Physiology. 120 (1), 1-16 (2020).
- Kenney, W. L., Cannon, J. G., Alexander, L. M. Cutaneous microvascular dysfunction correlates with serum LDL and sLOX-1 receptor concentrations. Microvascular Research. 85, 112-117 (2013).
- Holowatz, L. A., Thompson, C. S., Minson, C. T., Kenney, W. L. Mechanisms of acetylcholine-mediated vasodilatation in young and aged human skin. Journal of Physiology. 563, 965-973 (2005).
- Sokolnicki, L. A., Roberts, S. K., Wilkins, B. W., Basu, A., Charkoudian, N. Contribution of nitric oxide to cutaneous microvascular dilation in individuals with type 2 diabetes mellitus. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 292 (1), E314-E318 (2007).
- DuPont, J. J., Ramick, M. G., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species contribute to impaired cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 306 (12), F1499-F1506 (2014).
- Sprung, V. S., et al. Nitric oxide-mediated cutaneous microvascular function is impaired in polycystic ovary syndrome but can be improved by exercise training. Journal of Physiology. 591 (6), 1475-1487 (2013).
- Greaney, J. L., Saunders, E. F. H., Santhanam, L., Alexander, L. M. Oxidative stress contributes to microvascular endothelial dysfunction in men and women with major depressive disorder. Circulatory Research. 124 (4), 564-574 (2019).
- Stanhewicz, A. E., Jandu, S., Santhanam, L., Alexander, L. M. Increased angiotensin II sensitivity contributes to microvascular dysfunction in women who have had preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 382-389 (2017).
- Greaney, J. L., et al. Impaired hydrogen sulfide-mediated vasodilation contributes to microvascular endothelial dysfunction in hypertensive adults. Hypertension. 69 (5), 902-909 (2017).
- Dillon, G. A., Stanhewicz, A. E., Serviente, C., Greaney, J. L., Alexander, L. M. Hydrogen sulfide-dependent microvascular vasodilation is improved following chronic sulfhydryl-donating antihypertensive pharmacotherapy in adults with hypertension. Journal of Physiology. 321 (4), H728-H734 (2021).
- Wong, B. J., et al. Sensory nerve-mediated and nitric oxide-dependent cutaneous vasodilation in normotensive and prehypertensive non-Hispanic blacks and whites. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (2), H271-H281 (2020).
- Dillon, G. A., Greaney, J. L., Shank, S., Leuenberger, U. A., Alexander, L. M. AHA/ACC-defined stage 1 hypertensive adults do not display cutaneous microvascular endothelial dysfunction. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (3), H539-H546 (2020).
- Gagge, A. P., Stolwijk, J. A., Hardy, J. D. Comfort and thermal sensations and associated physiological responses at various ambient temperatures. Environmental Research. 1 (1), 1-20 (1967).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Lack of limb or sex differences in the cutaneous vascular responses to exogenous norepinephrine. Journal of Applied Physiology. 117 (12), 1417-1423 (2014).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Impaired increases in skin sympathetic nerve activity contribute to age-related decrements in reflex cutaneous vasoconstriction. Journal of Physiology. 593 (9), 2199-2211 (2015).
- Alba, B. K., Greaney, J. L., Ferguson, S. B., Alexander, L. M. Endothelial function is impaired in the cutaneous microcirculation of adults with psoriasis through reductions in nitric oxide-dependent vasodilation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (2), H343-H349 (2018).
- Greaney, J. L., Surachman, A., Saunders, E. F. H., Alexander, L. M., Almeida, D. M. Greater daily psychosocial stress exposure is associated with increased norepinephrine-induced vasoconstriction in young adults. Journal of the American Heart Association. 9 (9), e015697 (2020).
- Nakata, T., et al. Quantification of catecholamine neurotransmitters released from cutaneous vasoconstrictor nerve endings in men with cervical spinal cord injury. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (3), R345-R352 (2023).
- Tucker, M. A., et al. Postsynaptic cutaneous vasodilation and sweating: Influence of adiposity and hydration status. European Journal of Applied Physiology. 118 (8), 1703-1713 (2018).
- Craighead, D. H., Alexander, L. M. Menthol-induced cutaneous vasodilation is preserved in essential hypertensive men and women. American Journal of Hypertension. 30 (12), 1156-1162 (2017).
- Brunt, V. E., Minson, C. T. KCa channels and epoxyeicosatrienoic acids: Major contributors to thermal hyperaemia in human skin. Journal of Physiology. 590 (15), 3523-3534 (2012).
- Choi, P. J., Brunt, V. E., Fujii, N., Minson, C. T. New approach to measure cutaneous microvascular function: An improved test of NO-mediated vasodilation by thermal hyperemia. Journal of Applied Physiology. 117 (3), 277-283 (2014).
- Johnson, J. M., Kellogg, D. L. Jr Local thermal control of the human cutaneous circulation. Journal of Applied Physiology. 109 (4), 1229-1238 (2010).
- Jung, F., et al. Laser Doppler flux measurement for the assessment of cutaneous microcirculation-Critical remarks. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 55 (4), 411-416 (2013).
