Summary
Внутрикожный микродиализ — это минимально инвазивный метод, используемый для исследования функции микрососудов в норме и при заболеваниях. Для изучения механизмов вазодилатации и сужения сосудов в кожном кровообращении могут быть использованы как протоколы «доза-реакция», так и протоколы локального нагревания.
Abstract
Кожная сосудистая сеть является доступной тканью, которая может быть использована для оценки функции микрососудов у человека. Внутрикожный микродиализ – это минимально инвазивный метод, используемый для исследования механизмов гладкой мускулатуры и функции эндотелия сосудов в кожном кровообращении. Данная методика позволяет провести фармакологическое препарирование патофизиологии эндотелиальной дисфункции микрососудов, которая выражается снижением вазодилатации, опосредованной оксидом азота, что является индикатором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. При этом методе микродиализный зонд помещается в дермальный слой кожи, а над зондом помещается локальный нагревательный блок с лазерным доплеровским флоуметрическим зондом для измерения потока эритроцитов. Локальная температура кожи зажимается или стимулируется прямым применением тепла, а фармакологические агенты перфузируются через зонд для стимуляции или ингибирования внутриклеточных сигнальных путей, чтобы вызвать вазодилатацию или вазоконстрикцию или исследовать интересующие механизмы (кофакторы, антиоксиданты и т. д.). Количественно оценивается кожная сосудистая проводимость и очерчиваются механизмы эндотелиальной дисфункции при болезненных состояниях.
Introduction
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смертив Соединенных Штатах 1. Гипертония (АГ) является независимым фактором риска инсульта, ишемической болезни сердца и сердечной недостаточности и, по оценкам, затрагивает более ~50% населения Соединенных Штатов 2. АГ может развиваться как самостоятельное ССЗ (первичная АГ) или в результате другого состояния, такого как поликистоз почек и/или эндокринные нарушения (вторичная АГ). Широта этиологии АГ затрудняет изучение основных механизмов и повреждений органов-мишеней, наблюдаемых при АГ. Необходимы разнообразные и новые исследовательские подходы к патофизиологии поражения органов-мишеней, ассоциированного с АГ.
Одним из самых ранних патологических признаков ССЗ является эндотелиальная дисфункция, характеризующаяся нарушением вазодилатации, опосредованной оксидом азота (NO) 3,4,5. Дилатация, опосредованная потоком, является распространенным подходом, используемым для количественной оценки эндотелиальной дисфункции, связанной с сердечно-сосудистыми заболеваниями, но эндотелиальная дисфункция в микрососудистых руслах может быть как независимой, так и предшествующей дисфункции крупных кондуитных артерий 6,7,8. Кроме того, артериолы резистентности более непосредственно воздействуют на местные ткани, чем кондуитные артерии, и имеют более непосредственный контроль над доставкой богатой кислородом крови. Микрососудистая функция является прогностическим фактором выживаемости без неблагоприятных сердечно-сосудистых событий 9,10,11. Кожное микроциркуляторное русло представляет собой доступное сосудистое русло, которое может быть использовано для изучения ответов на физиологические и фармакологические сосудосуживающие или сосудорасширяющие раздражители. Внутрикожный микродиализ – это малоинвазивная методика, целью которой является исследование механизмов как гладкой мускулатуры сосудов, так и функции эндотелия в кожном микроциркуляторном русле с помощью целенаправленной фармакологической диссекции. Этот метод отличается от других методов, таких как постокклюзионная реактивная гиперемия, которая не допускает фармакологического вскрытия, и ионофорез, который позволяет проводить фармакологическую доставку, но менее точен по механизму действия (подробно рассмотрено в другом месте12).
Обоснование разработки и использования этого метода подробно рассмотрено в другом месте13. Этот подход был первоначально разработан для использования в неврологических исследованиях на грызунах, а затем впервые был применен к людям для изучения механизмов, лежащих в основе активной вазодилатации с точки зрения терморегуляции. В конце 1990-х годов этот метод использовался для изучения как нервных, так и эндотелиальных механизмов в отношении локального нагрева кожи. С тех пор этот метод используется для исследования ряда нейроваскулярных сигнальных механизмов в коже.
Используя этот метод, наша группа и другие исследовали механизмы эндотелиальной дисфункции в микроциркуляторном русле нескольких клинических популяций, включая, помимо прочего, дислипидемию, первичное старение, диабет, хроническую болезнь почек, синдром поликистозных яичников, преэклампсию, большое депрессивное расстройство 14,15,16,17,18,19 и артериальную гипертензию 20,21,22,23,24. Например, предыдущее исследование показало, что у нормотензивных женщин с преэклампсией в анамнезе, которые подвержены повышенному риску сердечно-сосудистых заболеваний, наблюдалось снижение NO-опосредованной вазодилатации в кожном кровообращении по сравнению с женщинами с нормотензивной беременностью в анамнезе. В другом исследовании у взрослых с диагнозом первичная АГ наблюдалась повышенная чувствительность к ангиотензину II в микроциркуляторном русле по сравнению со здоровыми контрольными группами21, а было показано, что хроническая антигипертензивная фармакотерапия у пациентов с первичной АГ снижает артериальное давление и улучшает как сероводородную, так и NO-опосредованную вазодилатацию22. Wong et al.23 обнаружили нарушение сенсорно-опосредованной и NO-опосредованной вазодилатации у взрослых с прегипертензией, что совпало с нашим выводом о прогрессировании эндотелиальной дисфункции с увеличением стадий АГ, как это классифицируется в рекомендациях Американской кардиологической ассоциации и Американского колледжа кардиологов2017 г. 24.
Метод внутрикожного микродиализа позволяет проводить строго контролируемые механистические исследования функции микрососудов в здоровых и болезненных состояниях. Поэтому целью данной статьи является описание техники внутрикожного микродиализа, применяемой нашей группой и другими. Мы подробно описываем процедуры фармакологической стимуляции эндотелия ацетилхолином () для изучения соотношения «доза-эффект» и физиологической стимуляции продукции эндогенного оксида азота с помощью протокола локального теплового стимула 39 °C или 42 °C. Мы представляем репрезентативные результаты для каждого подхода и обсуждаем клинические последствия выводов, полученных с помощью этого метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры утверждаются Институциональным наблюдательным советом Университета штата Пенсильвания перед набором участников.
1. Настройка оборудования
- Включите локальный нагревательный блок и лазерный доплеровский расходомер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сбором данных оба должны быть откалиброваны в соответствии с инструкциями производителя. Лазерный доплеровский расходомер должен быть подключен к оборудованию для сбора данных с частотой дискретизации 100 Гц (100 образцов/мин) и непрерывной записью в программном обеспечении для сбора данных. Несмотря на то, что можно использовать другое оборудование и программное обеспечение для сбора данных, для простоты остальные инструкции отражают возможности аппаратного обеспечения PowerLab и программного обеспечения LabChart. - Откройте файл программы LabChart.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо заранее подготовить справочный файл с требуемыми возможностями ввода данных и непрерывного сбора данных. Для каждого лазерного допплера и локального нагревателя должна быть одна панель, которая соответствует каждому участку микродиализа, а панели должны соответствовать соответствующим входам каналов в аппаратном блоке сбора данных.
2. Размещение микродиализных волокон
- Определите крупные, видимые кровеносные сосуды кожи в вентральной части предплечья и обозначьте их перманентным маркером (при необходимости используйте жгут для визуализации сосудов; идентификация сосудов в темнопигментированной коже может потребовать большей зависимости от пальпации).
- Проведите мазок с области, охватывающей отметины, и большую часть окружающей области с помощью тампонов с бетадином. Протрите бетадин спиртовыми тампонами. Накройте стерилизованный участок кожи стерильной простыней и приложите лед на ~5 минут, чтобы обезболить область.
- Снимите лед и введите иглу-проводник (23 G, длина 25 мм) скосом вверх в дермальный слой кожи на глубину 2-3 мм (в зависимости от толщины кожи). Продвигайте иглу, стараясь оставаться в дермальном слое, и выходите из кожи на расстоянии ~20 мм от места введения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить надлежащую глубину введения в кожу, форма иглы должна быть видна и легко прощупываться, но цвет иглы должен быть скрыт. Если для эксперимента требуется более одного микродиализного зонда, любые две иглы интродьюсера должны быть размещены на расстоянии ≥2,5 см друг от друга и позиционированы перед введением микродиализного зонда. Зонды не должны располагаться вдоль одного и того же крупного сосуда. - Оставив иглу на месте, подсоедините зонд (через замок Люэра) к шприцу, содержащему лактатный раствор Рингера. Пропустите противоположный конец зонда через иглу проводника до тех пор, пока полупроницаемая мембрана зонда не окажется рядом, но все еще за пределами отверстия иглы проводника. Медленно вводите небольшое количество раствора Рингера через волокно до тех пор, пока раствор не пройдет через поры мембраны, чтобы подтвердить целостность мембраны.
- При использовании микродиализного зонда Harvard Bioscience и иглы-проводника выполните шаги 2.5.1-2.5.2.
- После подтверждения функции зонда далее подавайте зонд через иглу интродьюсера до тех пор, пока мембрана полностью не будет содержаться в дермальном слое кожи внутри иглы интродьюсера.
- Пальцем закрепите зонд на месте проксимальнее иглы и извлеките иглу в направлении, противоположном введению. Заклейте внешнюю часть волокна скотчем на коже, чтобы предотвратить смещение полупроницаемой мембраны во время эксперимента.
- При использовании микродиализного зонда Bioanalytical Systems и иглы проводника выполните шаги 2.6.1-2.6.2.
- После подтверждения функции зонда возьмитесь одной рукой за ступицу иглы проводника и дистальную часть микродиализного зонда и одновременно извлеките иглу в направлении, противоположном направлению введения, переместив микродиализный зонд на место.
- Отрегулируйте зонд по мере необходимости, чтобы убедиться, что полупроницаемая мембрана полностью погружена в кожу. Заклейте внешнее волокно скотчем на коже, чтобы предотвратить смещение полупроницаемой мембраны во время эксперимента.
3. Гиперемия
- В ожидании спада гиперемической реакции на введение иглы (~60-90 мин) поместите одноразовый шприц в лоток шприцедержателя на микроинфузионных насосах. Перфузионный лактатный раствор Рингера, физиологический раствор или раствор носителя (раствор, в котором растворяют экспериментальное фармакологическое средство; 2 мкл/мин) во время фазы гиперемии.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как зонды для микродиализа не могут быть удалены в течение этой фазы ~60-90 минут, участник может изменить положение своего тела или пошевелить рукой, или замок Луэра зонда может быть снят со шприца и закреплен скотчем на руке участника, чтобы дать ему свободный диапазон движений, чтобы ненадолго встать. После оснащения локальными нагревателями и датчиками лазерной допплеровской флоуметрии (LDF) и после начала сбора данных датчики LDF не могут быть перемещены. - Когда покраснение кожи, которое является индикатором гиперемической реакции на травму иглой, стихнет, прикрепите локальный нагревательный блок к коже, покрывающей полупроницаемую мембрану, с помощью адгезивного диска зонда, убедившись, что центр нагревателя совпадает с траекторией микродиализного зонда.
- Поместите зонд LDF в отверстие в центре локального нагревателя так, чтобы лазер был перпендикулярен поверхности кожи. После того, как зонды LDF размещены и закреплены, нажмите кнопку «Пуск » в программном обеспечении для сбора данных, чтобы непрерывно записывать и отображать значения потока эритроцитов (поток эритроцитов; перфузионные единицы, PU). Если гиперемия полностью утихла, поток эритроцитов будет стабилен на уровне ~5-20 PU (пульсация сосудов ниже зонда LDF может отражаться небольшими возвышениями в PU, совпадающими с сердцебиениями).
- Наденьте автоматическую манжету для измерения артериального давления на руку субъекта, который не был оборудован инструментом.
- Установите локальные нагреватели на 33 °C, чтобы удерживать температуру кожи в термонейтральном диапазоне25, тем самым устраняя любые колебания влияния тепловых раздражителей. Чтобы добавить комментарий к непрерывной записи в программном обеспечении для обозначения событий в эксперименте, нажмите на текстовое поле в правом верхнем углу экрана, введите комментарий, выберите, какие каналы должны получать комментарий, и нажмите « Добавить».
4. Протокол ацетилхолина «доза-эффект»
- После того, как поток эритроцитов стабилизируется в ответ на локальное нагревание 33 °C, начинается сбор исходных данных, которые в файле программного обеспечения для сбора данных обозначаются комментарием begin baseline. Для анализа данных требуется не менее 5-10 минут стабильной базы; При необходимости перезапустите базовый план в любой момент на этом этапе сбора данных и отметьте это в файле LabChart. На последней минуте базового уровня соберите данные об измерении артериального давления и введите значения в комментарий в файле LabChart.
- По истечении 5-10 минут сбора исходных данных измерьте и запишите исходное артериальное давление и введите комментарий к исходному исходному уровню в программное обеспечение для сбора данных.
- Выключите микроинфузионные насосы, а шприцы, наполненные лактатным раствором Рингера, замените на шприц, наполненный наименьшей концентрацией АЧ (10−10 М).
- Закрепите новые шприцы на месте и подтвердите перфузию жидкости через конец зонда, прежде чем снова включать микроинфузионные насосы. Введите комментарий begin −10 в запись программного обеспечения для сбора данных.
- Каждая концентрация АХа будет перфузионироваться в течение 5-10 мин при 2 мкл/мин. На последней минуте перфузии для каждой концентрации измерьте и запишите артериальное давление. По истечении времени перфузии для данной концентрации замените шприц следующей по величине концентрацией (например, 10−10 М раствор АХг заменяют на 10−9 М раствор), как описано в шагах 4.2-4.4.
- Сразу после перфузии конечная концентрация АЧ (10−1 М) заменить шприц АЧ шприцем, содержащим раствор Рингера, и повысить температуру локального нагревателя до 43 °С. После того, как поток эритроцитов стабилизируется, замените раствор Рингера нитропруссидом натрия (28 мМ), чтобы получить как тепловую, так и фармакологически индуцированную максимальную локальную вазодилатизацию. Измеряйте и записывайте артериальное давление каждые ~3 минуты в течение этой фазы максимального расширения сосудов.
- Как только наступит максимальное плато потока эритроцитов (~5 мин стабильного PU), эксперимент завершите. Нажмите кнопку «Стоп » в правом нижнем углу программного обеспечения для сбора данных, чтобы завершить непрерывный сбор данных.
5. Протокол локального отопления
- Как только поток эритроцитов стабилизируется после гиперемии, начните сбор исходных данных и укажите это в файле программного обеспечения для сбора данных с комментарием. На последней минуте базового уровня соберите данные измерения артериального давления и введите значения в комментарии в файл программного обеспечения для сбора данных.
- Увеличьте температуру локальных нагревателей до 39 °C или 42 °C, в зависимости от потребностей протокола (описано в разделе обсуждения).
- После того, как поток эритроцитов выйдет на плато в ответ на локальное применение тепла (~40-60 мин нагрева), перфузируйте N G-нитро-l-аргинин метиловый эфир (L-NAME; 15 мМ, растворенный в растворе Рингера; 2 мкл/мин; ингибитор NO-синтазы) через зонд (зонды) для микродиализа.
- После того, как поток эритроцитов выйдет на плато в ответ на L-NAME (~15-25 мин перфузии), увеличьте локальные нагреватели до 43 °C.
- После того, как поток эритроцитов выйдет на плато в ответ на 43 °C (плато ~2-5 мин наступает после ~20-45 мин нагревания), перфузируют нитропруссид натрия (28 мМ, растворенный в растворе Рингера) через зонд (зонды) для микродиализа.
- Как только наступит максимальное плато потока эритроцитов (~5 мин стабильного PU), эксперимент завершите. Нажмите кнопку «Остановить » в правом нижнем углу программного обеспечения для сбора данных, чтобы завершить сбор данных.
6. Снятие микродиализных зондов
- После окончания эксперимента используйте хирургические ножницы, чтобы разрезать микродиализные зонды. Осторожно снимите зонды LDF с нагревателей и снимите нагреватели с кожи. Аккуратно снимите ленту, удерживающую зонды на месте, на коже.
- Визуально определите, в каком месте прокола по обе стороны от зонда образовался наименьший сгусток крови. Отрежьте часть зонда рядом с участком с меньшим сгустком, оставив ~1 дюйм зонда за пределами кожи неразрезанным.
- Очистите участок кожи, окружающий места входа и выхода зонда, спиртовым тампоном, а также зонд длиной ~1, оставленный на менее свернутом участке.
- Дайте спирту высохнуть на коже. Затем возьмитесь за часть зонда, идущую от места прокола с большим сгустком, напротив участка ~1 дюйм на менее свернутом конце. Медленно потяните зонд к большему сгустку крови.
- Наложите стерильную марлю на любое кровотечение, возникшее в результате извлечения зонда, и надавите на него.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ацетилхолин протокол «доза-ответ»
На рисунке 1А изображена схема, подробно описывающая протокол АЧ «доза-реакция». На рисунке 1B показана репрезентативная трассировка значений потока эритроцитов (единиц перфузии, PU; среднее значение 30 с) из стандартизированного протокола ACh «доза-ответ» для одного субъекта с течением времени. На рисунке 1С показан файл необработанных данных протокола ACh «доза-реакция». Дополнительные базовые измерения были сохранены в файле необработанных данных, но для анализа данных было использовано только ~10 минут базового уровня.
После разрешения гиперемии и стабильного потока эритроцитов в течение 5 мин можно начинать 10-минутный сбор исходных данных. Базовая линия изображается в виде относительно стабильной горизонтальной линии потока эритроцитов, где любая причина отклонений (например, артефакты движения, корректировки датчика) должна регистрироваться в качестве комментариев программного обеспечения для сбора данных для целей анализа. Протокол «доза-реакция» соответствует исходному периоду, и шприцы необходимо менять с каждой дозой, от 10−10 М до 10−1 М. Перед началом 5-10-минутной перфузии каждой дозы необходимо убедиться в том, что фармакологическое средство полностью перфузируется по всей длине волокна. В программном обеспечении для сбора данных будет наблюдаться первоначальное увеличение потока эритроцитов из-за перфузии, но это не включено в анализ, так как 5-минутный сбор данных для этой концентрации еще не начался. После начала перфузии для каждой дозы будет наблюдаться непрерывное увеличение потока эритроцитов до пика, за которым последует устойчивое снижение. Эта криволинейная реакция на фармакологические препараты будет воспроизводиться на протяжении всего протокола, но поток эритроцитов будет относительно больше с увеличением концентрации. При более низких концентрациях АХа криволинейная реакция может быть не столь выраженной. Примерами неоптимального потока эритроцитов являются следующие: 1) некриволинейная реакция, при которой поток эритроцитов не увеличивается и остается на плато, или 2) увеличение концентрации эритроцитов, оказывающее минимальное влияние на поток эритроцитов, когда поток эритроцитов относительно не увеличивается с каждой концентрацией. Это зависит от исследовательского вопроса и тестируемой клинической когорты.
После окончательной концентрации АХа лактат Рингера перфузируют, а местные нагреватели повышают до 43 °С. Во время этой фазы должно быть достигнуто плато до перфузии нитропруссида натрия. Это может занять до ~45 минут, в зависимости от предыдущего перфузионного агента. Эта фаза не включена в анализы. После достижения плато в течение 5 мин проводят перфузию нитропруссида натрия для получения максимальной локальной вазодилатации. Эта максимальная локальная вазодилатация изображается как повышение потока эритроцитов, когда плато достигается после ~20 мин перфузии, или когда поток эритроцитов достигает пика и сразу после этого снижается. После того, как для нитропруссида натрия достигнуто плато или снижение потока эритроцитов, протокол завершен. Распространенным примером неоптимального потока эритроцитов является получение наибольшего значения потока эритроцитов на другой фазе протокола (например, во время протокола доза-реакция), а не во время максимальной локальной вазодилатации.
Протокол ацетилхолина «доза-ответ»: ингибирование синтазы оксида азота
Для количественной оценки вклада NO в кожный кровоток в ответ на АХГ перфузируют N-G-нитро-l-аргинин-метиловый эфир (L-NAME), ингибитор NO-синтазы, в комбинации с АХГ через дополнительное волокно. На рисунке 2А показана схема, подробно описывающая протокол-реакция «доза-реакция» с L-NAME. На рисунке 2B показана репрезентативная трассировка потока эритроцитов (в среднем за 30 с) из стандартизированного протокола АЧ «доза-реакция» для одного субъекта с течением времени с L-NAME. На рисунке 2C показан файл необработанных данных протокола «доза-реакция» ACh с L-NAME. Дополнительные базовые измерения были сохранены в файле необработанных данных, но для анализа данных было использовано только ~10 минут базового уровня.
После разрешения гиперемии, стабильного потока эритроцитов в течение 5 мин и времени, достаточного для полной блокировки интересующего ферментативного пути (например, NO-синтазы) и/или доставки адекватных концентраций кофакторов, может начаться 10-минутный сбор исходных данных (изображается в виде относительно стабильной горизонтальной линии). Протокол «доза-реакция» соответствует исходному уровню, и шприцы необходимо менять с каждой дозой, начиная с 1010 М до 101 М АХГ с ингибитором NO-синтазы (например, 15 мМ L-NAME). В присутствии ингибитора NO-синтазы криволинейный ответ плохо реплицируется до более высоких концентраций. Будет наблюдаться относительно меньший поток эритроцитов по сравнению с сайтом без ингибирования NO-синтазы. Распространенным примером неоптимального потока эритроцитов является ингибирование NO-синтазы по сравнению с условиями без ингибирования NO-синтазы, что приводит к более высокому потоку эритроцитов. Это указывает на сбой протокола.
После перфузии конечной концентрации АХГ проводят перфузию лактата Рингера, а местные нагреватели повышают до 43 °С. Во время этой фазы должно быть достигнуто плато до перфузии нитропруссида натрия. Эта фаза не включена в анализы. После достижения плато в течение 5 мин проводится перфузия нитропруссида натрия, что приводит к максимальному местному расширению сосудов. Во время максимальной локальной вазодилатации будет наблюдаться экспоненциальный рост потока эритроцитов из-за предыдущего ингибирования NO-синтазы. Плато будет достигнуто после ~20 мин перфузии, либо поток эритроцитов достигнет своего абсолютного пика и сразу после этого пойдет на спад. После того, как для нитропруссида натрия достигнуто плато или снижение потока эритроцитов, протокол завершен. Распространенным примером неоптимального потока эритроцитов является получение наибольшего значения потока эритроцитов на другой фазе протокола (например, во время протокола доза-реакция), а не во время максимальной локальной вазодилатации.
Протокол локального отопления
На рисунке 3А изображена схема, подробно описывающая протокол локального нагрева. На рисунке 3B показана репрезентативная трассировка потока эритроцитов (среднее значение 30 с) для стандартизированного протокола локального нагрева для одного субъекта с течением времени. На рисунке 3C показан файл необработанных данных локального протокола отопления. После разрешения гиперемии и стабильного потока эритроцитов в течение 5 мин может начаться 10-минутный сбор исходных данных (изображается в виде относительно стабильной горизонтальной линии). Локальные нагреватели устанавливаются на 39 °C или 42 °C, и в потоке эритроцитов будет происходить начальный пик и надир. Для количественной оценки вклада NO в кожный кровоток в ответ на локальный тепловой стимул L-NAME перфузируют после достижения стабильного плато в потоке эритроцитов. Поток эритроцитов будет быстро снижаться до тех пор, пока он не достигнет нового плато в ответ на L-NAME. Через 5 мин стабильных значений потока эритроцитов лактатный Рингера перфузируется, а локальные нагреватели повышаются до 43 °С. Нагрев приведет к дополнительному пиковому и надирному отклику в потоке эритроцитов. Во время этой фазы необходимо убедиться, что до перфузии нитропруссида натрия было достигнуто плато. Эта фаза не включена в анализы. Для индуцирования локальной максимальной вазодилатации перфузируют нитропруссид натрия, и происходит быстрое увеличение потока эритроцитов. После того, как в ответ на нитропруссид натрия наблюдается плато или снижение потока эритроцитов, протокол завершен.
Рисунок 1: Протокол «доза-эффект» ацетилхолина (). (А) Схема протокола АЧ «доза-реакция». (B) Репрезентативная трассировка (в среднем 30 с) протокола-доза-реакция. (C) Необработанные данные протокола АХш «доза-реакция». Дополнительные базовые измерения сохраняются в файле исходных данных, чтобы продемонстрировать флуктуации до стабилизации, но для анализа данных было использовано только ~10 минут стабильных данных покоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Протокол ACh «доза-реакция» с ингибированием синтазы оксида азота (NO). (A) Схема протокола ACh «доза-реакция» с ингибированием NO-синтазы. (B) Репрезентативная трассировка протокола-реакция «доза-ответ» с ингибированием NO-синтазы. (C) Необработанные данные протокола АХг «доза-реакция» с ингибированием NO-синтазы. Дополнительные базовые измерения сохраняются в файле исходных данных, чтобы продемонстрировать флуктуации до стабилизации, но для анализа данных было использовано только ~10 минут стабильных данных покоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Протокол локального нагрева. (A) Схема протокола локального нагрева. (B) Репрезентативное отслеживание локального протокола отопления. (C) Исходные данные локального протокола отопления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Техника внутрикожного микродиализа является универсальным инструментом в исследовании сосудов человека. Исследователи могут изменить протокол, чтобы еще больше диверсифицировать его применение. Например, мы описываем протокол АХГ «доза-реакция», но в других исследованиях механизмов вазоконстрикции или вазомоторного тонуса, а не только вазодилатации, использовались подходы «доза-ответ» норадреналина или нитропруссида натрия 26,27,28,29,30,31. Другие медиаторы вазодилатации, такие как ментол или метахлорхлорид, также использовались в протоколе «доза-эффект»31,32. Протокол «доза-реакция» в качестве фармакологической оценки функции сосудов является более целенаправленным, механистическим методом выделения специфических сигнальных механизмов по сравнению с протоколом локального нагревания, поскольку он устраняет вариации симпатического ответа на тепловые раздражители. Тем не менее, локальное нагревание является экономически эффективным подходом, который использует физиологический стимул для индуцирования вазодилатации с помощью как нейрогенных, так и эндотелий-зависимых механизмов. Также важно учитывать интересующий механизм при выборе между протоколом локального нагрева 39 °C или 42 °C. Было предложено протокол 39 °C для лучшей изоляции NO-опосредованной вазодилатации, в то время как протокол 42 °C позволяет исследовать как NO-опосредованную вазодилатизацию, так и эндотелиальную гиперполяризующую фактор-опосредованную вазодилатацию33,34. Кроме того, увеличение CVC в ответ на локальный нагрев 42 °C имеет тенденцию быть более устойчивым (т. е. достигает более высокого % CVCmax34). Тем не менее, при использовании нового агента для опроса специфического сигнального пути необходимо использовать строгие методы для оценки эффективности (т.е. полной блокировки) и/или насыщения концентраций кофакторов.
Функцию эндотелия часто измеряют с помощью метода дилатации, опосредованной потоком, но эндотелиальная дисфункция в микрососудистом русле может возникать до или независимо от эндотелиальной дисфункции в крупных кондуитных артериях, особенно при таких патологиях, как АГ 6,7,8. Кроме того, метод дилатации, опосредованный потоком, не позволяет проводить фармакологическое препарирование патофизиологии эндотелиальной дисфункции в отрыве от системных эффектов. Другие методы исследования функции эндотелия микрососудов, такие как ионофорез или постокклюзионная реактивная гиперемия, не могут точно воздействовать на механизмы функции эндотелия с помощью фармакологического вмешательства12. Таким образом, внутрикожный микродиализ позволяет целенаправленно исследовать механизмы функции сосудов, а его использование, вместе с результатами дилатации, опосредованной потоком, может обеспечить более целостную картину системной функции сосудов.
Независимо от того, какой подход к внутрикожному микродиализу используется, необходимо принять определенные меры предосторожности для обеспечения достоверности и воспроизводимости ответов. Несмотря на то, что специфика протокола эксперимента может быть скорректирована в соответствии с конкретными исследовательскими вопросами, точное размещение микродиализного зонда имеет решающее значение. Необходимо соблюдать осторожность при введении зонда в дерму и избегать больших видимых или пальпируемых кровеносных сосудов кожи. Пункция этих сосудов приведет к аномально низким значениям единиц перфузии; В этом случае лазерная допплеровская флоуметрия будет измерять образование гематомы, а не поток эритроцитов через неповрежденный сосуд. После этого следующим наиболее важным этапом этого протокола является разрешение гиперемической реакции на пункцию иглой. Если гиперемическая реакция не может полностью утихнуть, зарегистрированные единицы перфузии на протяжении всей исходной и ранней частей протокола будут больше, чем истинные значения в состоянии покоя. Если было предоставлено достаточное время восстановления, но перфузионные установки остаются аномально высокими, может потребоваться повторная калибровка зондов до начала фазы сбора исходных данных.
Ограничением метода внутрикожного микродиализа является то, что он не может специфически выделить тип ткани для оценки сосудистых сигнальных путей. Поскольку сосуды кожи не могут быть рассечены и визуализированы in vivo, невозможно гарантировать, что полупроницаемая часть микродиализного зонда находится непосредственно рядом с интересующей тканью (например, эндотелием сосудов). Таким образом, результаты, полученные с помощью этого метода, отражают интегративный характер физиологии человека и дают представление о коллективной функции эндотелия, гладкой мускулатуры сосудов и нервных влияний на местный кровоток. Тем не менее, при использовании протокола локального нагрева достижение потока эритроцитов плато при начальном увеличении тепла до 39 °C или 42 °C позволяет разрешить аксональный рефлекс на тепло, что затем обеспечивает преимущественно эндотелий-опосредованный ответ, как обсуждалось в другом месте35. Дополнительным ограничением данной методики является использование лазерной допплеровской флоуметрии в качестве показателя кожного кровотока. Лазерная допплеровская флоуметрия количественно определяет поток эритроцитов, который не учитывает изменения диаметра сосуда (т.е. расширение микроциркуляторного русла), как это было бы необходимо для количественной оценки абсолютного потока. Он может быть чувствителен к различиям между участниками или между состояниями36. Будущие применения внутрикожного микродиализа могут включать методы количественной оценки абсолютного микрососудистого кровотока. Например, недавняя разработка оптической когерентной томографии позволяет количественно определить диаметр сосуда с помощью трехмерной визуализации микроциркуляторного русла кожи13. Техника внутрикожного микродиализа противопоказана в очень немногих, но важных случаях, которые включают, помимо прочего, участников с кожными заболеваниями, участников с аллергией, связанной с описанными здесь веществами, участников с тяжелой трипанофобией и участников с татуировками, покрывающими всю вентральную часть предплечья (но небольшие татуировки в этой области не являются исключением).
Уникальная способность микродиализного подхода помочь выделить и очертить лежащие в его основе патофизиологические механизмы делает его полезным для изучения вариабельной этиологии АГ среди других ССЗ. После оптимизации протокола этот метод позволяет оценить эффективность новых методов лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, внутрикожный микродиализ обеспечивает метод оценки нецелевых эффектов гипотетически несвязанной фармакотерапии, что делает его очень ценным инструментом для информирования о крупномасштабных клинических исследованиях. В совокупности этот метод является неоценимым активом в микрососудистых исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов и нечего раскрывать.
Acknowledgments
Никакой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
References
- Xu, J. Q., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Arias, E.
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93 (2023).
- Cohuet, G., Struijker-Boudier, H. Mechanisms of target organ damage caused by hypertension: Therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 111 (1), 81-98 (2006).
- Park, K. H., Park, W. J. Endothelial dysfunction: Clinical implications in cardiovascular disease and therapeutic approaches. Journal of Korean Medical Science. 30 (9), 1213-1225 (2015).
- Levy, B. I., Ambrosio, G., Pries, A. R., Struijker-Boudier, H. A. Microcirculation in hypertension: a new target for treatment. Circulation. 104 (6), 735-740 (2001).
- Sara, J. D., et al. Prevalence of coronary microvascular dysfunction among patients with chest pain and nonobstructive coronary artery disease. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Interventions. 8 (11), 1445-1453 (2015).
- Weis, M., Hartmann, A., Olbrich, H. G., Hör, G., Zeiher, A. M. Prognostic significance of coronary flow reserve on left ventricular ejection fraction in cardiac transplant recipients. Transplantation. 65 (1), 103-108 (1998).
- Rossi, M., et al. Investigation of skin vasoreactivity and blood flow oscillations in hypertensive patients: Effect of short-term antihypertensive treatment. Journal of Hypertension. 29 (8), 1569-1576 (2011).
- Pepine, C. J., et al. Coronary microvascular reactivity to adenosine predicts adverse outcome in women evaluated for suspected ischemia results from the National Heart, Lung and Blood Institute WISE (Women's Ischemia Syndrome Evaluation) study. Journal of the American College of Cardiology. 55 (25), 2825-2832 (2010).
- Matsuda, J., et al. Prevalence and clinical significance of discordant changes in fractional and coronary flow reserve after elective percutaneous coronary intervention. Journal of the American Heart Association. 5 (12), e004400 (2016).
- Gupta, A., et al. Integrated noninvasive physiological assessment of coronary circulatory function and impact on cardiovascular mortality in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 136 (24), 2325-2336 (2017).
- Roustit, M., Cracowski, J. L. Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 373-384 (2013).
- Low, D. A., Jones, H., Cable, N. T., Alexander, L. M., Kenney, W. L. Historical reviews of the assessment of human cardiovascular function: interrogation and understanding of the control of skin blood flow. European Journal of Applied Physiology. 120 (1), 1-16 (2020).
- Kenney, W. L., Cannon, J. G., Alexander, L. M. Cutaneous microvascular dysfunction correlates with serum LDL and sLOX-1 receptor concentrations. Microvascular Research. 85, 112-117 (2013).
- Holowatz, L. A., Thompson, C. S., Minson, C. T., Kenney, W. L. Mechanisms of acetylcholine-mediated vasodilatation in young and aged human skin. Journal of Physiology. 563, 965-973 (2005).
- Sokolnicki, L. A., Roberts, S. K., Wilkins, B. W., Basu, A., Charkoudian, N. Contribution of nitric oxide to cutaneous microvascular dilation in individuals with type 2 diabetes mellitus. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 292 (1), E314-E318 (2007).
- DuPont, J. J., Ramick, M. G., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species contribute to impaired cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 306 (12), F1499-F1506 (2014).
- Sprung, V. S., et al. Nitric oxide-mediated cutaneous microvascular function is impaired in polycystic ovary syndrome but can be improved by exercise training. Journal of Physiology. 591 (6), 1475-1487 (2013).
- Greaney, J. L., Saunders, E. F. H., Santhanam, L., Alexander, L. M. Oxidative stress contributes to microvascular endothelial dysfunction in men and women with major depressive disorder. Circulatory Research. 124 (4), 564-574 (2019).
- Stanhewicz, A. E., Jandu, S., Santhanam, L., Alexander, L. M. Increased angiotensin II sensitivity contributes to microvascular dysfunction in women who have had preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 382-389 (2017).
- Greaney, J. L., et al. Impaired hydrogen sulfide-mediated vasodilation contributes to microvascular endothelial dysfunction in hypertensive adults. Hypertension. 69 (5), 902-909 (2017).
- Dillon, G. A., Stanhewicz, A. E., Serviente, C., Greaney, J. L., Alexander, L. M. Hydrogen sulfide-dependent microvascular vasodilation is improved following chronic sulfhydryl-donating antihypertensive pharmacotherapy in adults with hypertension. Journal of Physiology. 321 (4), H728-H734 (2021).
- Wong, B. J., et al. Sensory nerve-mediated and nitric oxide-dependent cutaneous vasodilation in normotensive and prehypertensive non-Hispanic blacks and whites. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (2), H271-H281 (2020).
- Dillon, G. A., Greaney, J. L., Shank, S., Leuenberger, U. A., Alexander, L. M. AHA/ACC-defined stage 1 hypertensive adults do not display cutaneous microvascular endothelial dysfunction. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (3), H539-H546 (2020).
- Gagge, A. P., Stolwijk, J. A., Hardy, J. D. Comfort and thermal sensations and associated physiological responses at various ambient temperatures. Environmental Research. 1 (1), 1-20 (1967).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Lack of limb or sex differences in the cutaneous vascular responses to exogenous norepinephrine. Journal of Applied Physiology. 117 (12), 1417-1423 (2014).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Impaired increases in skin sympathetic nerve activity contribute to age-related decrements in reflex cutaneous vasoconstriction. Journal of Physiology. 593 (9), 2199-2211 (2015).
- Alba, B. K., Greaney, J. L., Ferguson, S. B., Alexander, L. M. Endothelial function is impaired in the cutaneous microcirculation of adults with psoriasis through reductions in nitric oxide-dependent vasodilation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (2), H343-H349 (2018).
- Greaney, J. L., Surachman, A., Saunders, E. F. H., Alexander, L. M., Almeida, D. M. Greater daily psychosocial stress exposure is associated with increased norepinephrine-induced vasoconstriction in young adults. Journal of the American Heart Association. 9 (9), e015697 (2020).
- Nakata, T., et al. Quantification of catecholamine neurotransmitters released from cutaneous vasoconstrictor nerve endings in men with cervical spinal cord injury. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (3), R345-R352 (2023).
- Tucker, M. A., et al. Postsynaptic cutaneous vasodilation and sweating: Influence of adiposity and hydration status. European Journal of Applied Physiology. 118 (8), 1703-1713 (2018).
- Craighead, D. H., Alexander, L. M. Menthol-induced cutaneous vasodilation is preserved in essential hypertensive men and women. American Journal of Hypertension. 30 (12), 1156-1162 (2017).
- Brunt, V. E., Minson, C. T. KCa channels and epoxyeicosatrienoic acids: Major contributors to thermal hyperaemia in human skin. Journal of Physiology. 590 (15), 3523-3534 (2012).
- Choi, P. J., Brunt, V. E., Fujii, N., Minson, C. T. New approach to measure cutaneous microvascular function: An improved test of NO-mediated vasodilation by thermal hyperemia. Journal of Applied Physiology. 117 (3), 277-283 (2014).
- Johnson, J. M., Kellogg, D. L. Jr Local thermal control of the human cutaneous circulation. Journal of Applied Physiology. 109 (4), 1229-1238 (2010).
- Jung, F., et al. Laser Doppler flux measurement for the assessment of cutaneous microcirculation-Critical remarks. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 55 (4), 411-416 (2013).
