Summary
מיקרודיאליזה תוך עורית היא טכניקה זעיר פולשנית המשמשת לחקר תפקוד כלי הדם בבריאות ובמחלות. ניתן להשתמש הן בפרוטוקולי תגובת מינון והן בפרוטוקולי חימום מקומיים עבור טכניקה זו כדי לחקור מנגנונים של הרחבת כלי דם והתכווצות כלי דם במחזור הדם העורי.
Abstract
כלי הדם העוריים הם רקמה נגישה שניתן להשתמש בה כדי להעריך תפקוד כלי דם בבני אדם. מיקרודיאליזה תוך-עורית היא טכניקה זעיר פולשנית המשמשת לחקר מנגנונים של שריר חלק בכלי הדם ותפקוד האנדותל במחזור הדם העורי. טכניקה זו מאפשרת דיסקציה פרמקולוגית של הפתופיזיולוגיה של תפקוד לקוי של אנדותל כלי הדם כפי שאינדקס על ידי ירידה בהרחבת כלי הדם בתיווך תחמוצת החנקן, אינדיקטור לסיכון להתפתחות מחלות לב וכלי דם. בטכניקה זו, בדיקת מיקרודיאליזה ממוקמת בשכבה העורית של העור, ויחידת חימום מקומית עם בדיקת זרימת דופלר לייזר ממוקמת מעל הבדיקה כדי למדוד את שטף תאי הדם האדומים. טמפרטורת העור המקומית מהודקת או מגורה באמצעות יישום חום ישיר, וחומרים פרמקולוגיים מחוררים דרך הגשושית כדי לעורר או לעכב מסלולי איתות תוך תאיים על מנת לגרום להרחבת כלי דם או להתכווצות כלי דם או לחקור מנגנונים מעניינים (קו-פקטורים, נוגדי חמצון וכו '). מוליכות כלי הדם העורית מכומתת, וניתן להגדיר מנגנונים של תפקוד לקוי של האנדותל במצבי מחלה.
Introduction
מחלות לב וכלי דם (CVD) הן סיבת המוות המובילה בארצות הברית1. יתר לחץ דם (HTN) הוא גורם סיכון עצמאי לשבץ, מחלות לב כליליות ואי ספיקת לב ומוערך כי הוא משפיע על למעלה מ ~ 50% מאוכלוסיית ארצות הברית2. HTN יכול להתפתח כ-CVD עצמאי (HTN ראשוני) או כתוצאה ממצב אחר, כגון מחלת כליות פוליציסטית ו/או הפרעות אנדוקריניות (HTN משני). רוחב האטיולוגיות של HTN מסבך את החקירות לגבי המנגנונים הבסיסיים והנזק לאיברי הקצה שנצפו עם HTN. יש צורך בגישות מחקר מגוונות וחדשניות לפתופיזיולוגיה של הנזק לאיברי הקצה הקשורים ל-HTN.
אחד הסימנים הפתולוגיים המוקדמים ביותר של CVD הוא תפקוד לקוי של האנדותל, המאופיין בהרחבת כלי דם בתיווך תחמוצת החנקן (NO) 3,4,5. התרחבות בתיווך זרימה היא גישה נפוצה המשמשת לכימות תפקוד לקוי של האנדותל הקשור ל- CVD, אך תפקוד לקוי של האנדותל במיטות מיקרו-וסקולריות יכול להיות גם בלתי תלוי וגם מקדים לזה של עורקי צינור גדולים 6,7,8. יתר על כן, עורקי התנגדות מופעלים באופן ישיר יותר על ידי רקמות מקומיות מאשר עורקי צינור ויש להם שליטה מיידית יותר על אספקת דם עשיר בחמצן. תפקוד כלי הדם מנבא הישרדות שלילית ללא אירועים קרדיווסקולריים 9,10,11. כלי הדם העוריים הם מצע כלי דם נגיש שניתן להשתמש בו כדי לבחון תגובות לגירויים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים או מרחיבי כלי דם. מיקרודיאליזה תוך עורית היא טכניקה זעיר פולשנית, שמטרתה לחקור את המנגנונים של שריר חלק כלי דם ותפקוד האנדותל במיקרו-וסקולטורה העורית עם דיסקציה פרמקולוגית ממוקדת. שיטה זו מנוגדת לטכניקות אחרות, כגון היפרמיה תגובתית פוסט-חסימתית, שאינה מאפשרת דיסקציה פרמקולוגית, ויונטופורזיס, המאפשרת מתן תרופתי אך פחות מדויקת במנגנון הפעולה שלה (נסקרה ביסודיות במקום אחר12).
הרציונל מאחורי הפיתוח והשימוש בטכניקה זו נסקר בהרחבה במקום אחר13. גישה זו פותחה במקור לשימוש במחקר נוירולוגי במכרסמים ולאחר מכן יושמה לראשונה על בני אדם כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס הרחבת כלי הדם הפעילה מנקודת מבט תרמו-רגולטורית. בסוף שנות ה-90 של המאה ה-20 נעשה שימוש בשיטה זו לבחינת מנגנונים עצביים ואנדותל בהקשר של חימום מקומי של העור. מאז, הטכניקה שימשה לחקר מספר מנגנוני איתות נוירו-וסקולריים בעור.
באמצעות טכניקה זו, הקבוצה שלנו ואחרים חקרו את המנגנונים של תפקוד לקוי של האנדותל בכלי הדם הזעירים של מספר אוכלוסיות קליניות, כולל, אך לא רק, דיסליפידמיה, הזדקנות ראשונית, סוכרת, מחלת כליות כרונית, תסמונת השחלות הפוליציסטיות, רעלת הריון, הפרעת דיכאון מג'ורי 14,15,16,17,18,19 ויתר לחץ דם 20,21,22,23,24. לדוגמה, מחקר קודם מצא כי נשים נורמוטנסיות עם היסטוריה של רעלת הריון, אשר נמצאות בסיכון מוגבר ל- CVD, הפחיתו את הרחבת כלי הדם ללא תיווך במחזור הדם העורי בהשוואה לנשים עם היסטוריה של הריון נורמוטנסי20. במחקר אחר, מבוגרים שאובחנו עם HTN ראשוני הדגימו רגישות מוגברת לאנגיוטנסין II במיקרו-וסקולטורה בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה21, ופרמקותרפיה אנטי-יתר לחץ דם כרונית התורמת סולפידריל בחולי HTN ראשוניים הוכחה כמפחיתה לחץ דם ומשפרת הן מימן גופרתי והן הרחבת כלי דם מתווכת NO22. Wong et al.23 מצאו התרחבות כלי דם פגומה בתיווך חושי וללא תיווך אצל מבוגרים טרום יתר לחץ דם, במקביל לממצא שלנו של התקדמות של תפקוד לקוי של האנדותל עם עלייה בשלבי HTN, כפי שסווג על ידי איגוד הלב האמריקאי 2017 והנחיות המכללה האמריקאית לקרדיולוגיה24.
טכניקת המיקרודיאליזה התוך-עורית מאפשרת חקירות מכניסטיות מבוקרות היטב של תפקוד כלי הדם במצבי בריאות ומחלות. לכן, מאמר זה נועד לתאר את טכניקת המיקרודיאליזה התוך-עורית כפי שהיא מיושמת על ידי הקבוצה שלנו ואחרים. אנו מפרטים את ההליכים הן לגירוי פרמקולוגי של האנדותל עם אצטילכולין (ACh) כדי לבחון את יחסי המינון-תגובה והן את הגירוי הפיזיולוגי של ייצור NO אנדוגני עם פרוטוקול גירוי חימום מקומי של 39 ° C או 42 ° C. אנו מציגים תוצאות מייצגות עבור כל גישה ודנים בהשלכות הקליניות של הממצאים שעלו מטכניקה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים מאושרים על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פנסילבניה לפני גיוס המשתתפים.
1. הגדרת ציוד
- הפעל את יחידת החימום המקומית ואת מד זרימת דופלר הלייזר.
הערה: יש לכייל את שניהם לפני איסוף הנתונים בהתאם להוראות היצרן. מד הזרימה של דופלר הלייזר צריך להיות מחובר לחומרת איסוף נתונים עם דגימה של 100 הרץ (100 דגימות לדקה) והקלטה רציפה בתוכנה לרכישת נתונים. בעוד שניתן להשתמש בחומרה ובתוכנה אחרות לרכישת נתונים, לשם הפשטות, ההוראות הנותרות משקפות את יכולות החומרה והתוכנה LabChart של PowerLab. - פתח קובץ תוכנה LabChart.
הערה: יש להכין מראש קובץ עזר עם קלט הנתונים הרצוי ויכולות איסוף נתונים רציפות. צריך להיות פאנל אחד לכל דופלר לייזר ומחמם מקומי המתאים לכל אתר מיקרודיאליזה, והפאנלים צריכים להתאים לכניסות הערוץ המתאימות ביחידת החומרה לרכישת נתונים.
2. מיקום סיבי מיקרודיאליזה
- זהה את כלי הדם הגדולים והגלויים של העור באספקט הגחוני של האמה, וציין אותם עם סמן קבוע (השתמש בחוסם עורקים כדי להמחיש את כלי הדם במידת הצורך; זיהוי כלי דם בעור פיגמנטי כהה עשוי לדרוש הסתמכות רבה יותר על מישוש).
- יש לספוג את האזור המקיף את הסימנים וחלק נדיב מהאזור שמסביב באמצעות מקלוני בטאדין. נגבו את הבטאדין עם מקלוני אלכוהול. כסו את האזור המעוקר של העור עם שטיפה סטרילית, ומרחו קרח למשך ~5 דקות כדי להרדים את האזור.
- הסר את הקרח, והכנס מחט החדרה (23 גרם, 25 מ"מ אורך), משופעת כלפי מעלה, לתוך שכבת העור של העור בעומק של 2-3 מ"מ (תלוי בעובי העור הבודד). מקדמים את המחט, נזהרים להישאר בשכבת העור, ויוצאים מהעור ~ 20 מ"מ מנקודת ההחדרה.
הערה: כדי לאשר את עומק המיקום הנכון בעור, צורת המחט צריכה להיות גלויה ומוחשית בקלות, אך יש להסתיר את צבע המחט. אם נדרשת יותר מגשושית מיקרודיאליזה אחת לצורך הניסוי, יהיה צורך למקם כל שתי מחטי כניסה במרחק של ≥2.5 ס"מ זו מזו ולמקם אותן לפני החדרת בדיקת המיקרודיאליזה. בדיקות לא צריך להיות ממוקם לאורך אותו כלי גדול. - משאירים את המחט במקומה, מחברים את הבדיקה (באמצעות מנעול Luer) למזרק המכיל תמיסת רינגר מניקה. הזינו את הקצה הנגדי של הגשושית דרך מחט ההחדרה עד שהקרום החדיר למחצה של הגשושית קרוב אך עדיין מחוץ לפתח מחט ההחדרה. לאט לאט לנקב כמות קטנה של תמיסה רינגר דרך הסיב עד התמיסה הוא מחורר באופן גלוי דרך הנקבוביות של הממברנה כדי לאשר את שלמות הממברנה.
- אם אתה משתמש בבדיקת מיקרודיאליזה של Harvard Bioscience ומחט היכרות, בצע את השלבים 2.5.1-2.5.2.
- עם אישור תפקוד הבדיקה, יש להזין את הגשושית דרך מחט המבוא עד שהקרום מוכל לחלוטין בשכבה העורית של העור בתוך מחט ההיכרות.
- באמצעות אצבע, לאבטח את הבדיקה במקומה פרוקסימלי למחט, ולמשוך את המחט בכיוון ההפוך מהחדרה. הדביקו את החלק החיצוני של הסיב במקומו על העור כדי למנוע תזוזה של הקרום החדיר למחצה במהלך הניסוי.
- אם אתה משתמש בבדיקת מיקרודיאליזה של מערכות ביואנליטיות ומחט היכרות, בצע את השלבים 2.6.1-2.6.2.
- עם אישור תפקוד הבדיקה, אחזו ברכזת של מחט המבוא ובחלק הדיסטלי של בדיקת המיקרודיאליזה ביד אחת, ובו זמנית משכו את המחט הפוכה לכיוון ההחדרה, תוך העברת בדיקת המיקרודיאליזה למקומה.
- התאימו את הבדיקה לפי הצורך כדי להבטיח שהקרום החדיר למחצה קבור בעור לחלוטין. הדביקו את הסיב החיצוני במקומו על העור כדי למנוע תזוזה של הקרום החדיר למחצה במהלך הניסוי.
3. היפרמיה
- בזמן ההמתנה לשכיכת התגובה ההיפרמית להחדרת המחט (~ 60-90 דקות), הניחו את המזרק החד-פעמי במגש מחזיק המזרק על משאבות העירוי. תמיסת רינגר מניקה, תמיסת מלח או תמיסת רכב (התמיסה שבה מומס החומר הפרמקולוגי הניסיוני; 2 מיקרוליטר/דקה) בשלב ההיפרמיה.
הערה: בעוד שלא ניתן להסיר את בדיקות המיקרודיאליזה במהלך שלב ~ 60-90 דקות זה, המשתתף יכול להתאים את תנוחת גופו או להזיז את ידו, או שניתן להסיר את נעילת Luer של הגשושית מהמזרק ולהצמיד אותה באמצעות סרט לזרוע המשתתף כדי לאפשר לו טווח תנועה חופשי לעמוד לזמן קצר. לאחר התקנת תנורי חימום מקומיים וגשושיות זרימת דופלר לייזר (LDF) ולאחר שאיסוף הנתונים החל, לא ניתן להזיז את גשושיות LDF. - כאשר האדמומיות בעור, המהווה אינדיקטור לתגובה ההיפרמית לטראומה במחט, שככה, חברו את יחידת החימום המקומית לעור המכסה את הקרום החדיר למחצה באמצעות דיסק הדבק של הבדיקה, וודאו שמרכז תנור החימום מתיישר עם נתיב בדיקת המיקרודיאליזה.
- הניחו את בדיקת LDF לתוך הפתח במרכז תנור החימום המקומי כך שהלייזר יהיה מאונך ישירות לפני השטח של העור. לאחר הצבת בדיקות LDF ומאובטחות, לחץ על התחל בתוכנת רכישת הנתונים כדי להקליט ולהציג ברציפות את ערכי שטף תאי הדם האדומים (שטף RBC; יחידות זילוח, PUs). אם היפרמיה שככה לחלוטין, שטף RBC יהיה יציב ב~ 5-20 PU (הפעימות של כלי הדם מתחת לבדיקת LDF עשויה לבוא לידי ביטוי על ידי גבהים קלים ב- PU החופפים לפעימות הלב).
- הניחו שרוול לחץ דם אוטומטי על זרועו של נבדק שלא עבר מכשיר.
- כוונו את תנורי החימום המקומיים לטמפרטורה של 33°C כדי להדק את טמפרטורת העור בטווח תרמו-ניטרלי25, ובכך להסיר שינויים בהשפעת הגירויים התרמיים. כדי להוסיף הערה להקלטה הרציפה בתוכנת איסוף הנתונים לציון אירועים בניסוי, לחץ על תיבת הטקסט בפינה השמאלית העליונה של המסך, הקלד הערה, בחר אילו ערוצים יקבלו את התגובה ולחץ על הוסף.
4. פרוטוקול תגובת מינון אצטילכולין
- לאחר ששטף RBC התייצב בתגובה לחום המקומי של 33 מעלות צלזיוס, התחל באיסוף נתונים בסיסיים, המובחנים בקובץ התוכנה לרכישת נתונים על ידי הערה להתחיל תוכנית בסיסית. לפחות 5-10 דקות של קו בסיס יציב נדרש לניתוח נתונים; הפעל מחדש את התוכנית הבסיסית בכל עת במהלך שלב זה באיסוף הנתונים, במידת הצורך, וסמן זאת בקובץ LabChart. בדקה האחרונה של תוכנית הבסיס, אסוף מדידת לחץ דם והזן את הערכים בהערה בקובץ LabChart.
- בתום 5-10 דקות של איסוף נתונים בסיסיים, מדוד ורשום את לחץ הדם הבסיסי, והזן את נקודת הבסיס של סוף ההערה בתוכנת איסוף הנתונים.
- כבו את משאבות העירוי, והחליפו את המזרקים המלאים בתמיסת רינגר מניקה במזרק המלא בריכוז הנמוך ביותר של ACh (10-10 מ').
- אבטחו את המזרקים החדשים במקומם, ואשרו את הזלוף של הנוזל עד סוף הבדיקה לפני שתפעילו שוב את משאבות העירוי. הזן את התגובה להתחיל −10 לתוך הקלטת תוכנת רכישת נתונים.
- כל ריכוז של ACh יהיה מחורר במשך 5-10 דקות ב 2 μL / דקה. בדקה האחרונה של הזילוח, עבור כל ריכוז, למדוד ולרשום את לחץ הדם. לאחר שזמן הזילוח של ריכוז נתון הסתיים, החלף את המזרק בריכוז הגבוה הבא (למשל, תמיסת 10-10 M ACh מוחלפת בתמיסת 10-9 M ACh), כמתואר בשלבים 4.2-4.4.
- מיד לאחר ניקוב הריכוז הסופי של ACh (10-1 M), החליפו את מזרק ACh במזרק המכיל תמיסת רינגר, והעלו את טמפרטורת המחמם המקומי ל-43°C. לאחר ששטף RBC התייצב, החלף את תמיסת רינגר בנתרן ניטרופרוסיד (28 מילימול) כדי לייצר הן הרחבת כלי דם מקומית מקסימלית הנגרמת על ידי חום והן על ידי פרמקולוגית. מדוד ורשום את לחץ הדם כל ~ 3 דקות במהלך שלב זה של הרחבת כלי דם מקסימלית.
- לאחר שהתרחשה רמה מקסימלית של שטף RBC (~ 5 דקות PU יציב), סיים את הניסוי. בחר עצור בפינה השמאלית התחתונה של תוכנת רכישת הנתונים כדי לסיים את איסוף הנתונים הרציף.
5. פרוטוקול חימום מקומי
- לאחר ששטף RBC התייצב בעקבות היפרמיה, התחל את איסוף הנתונים הבסיסיים, וציין זאת בקובץ התוכנה לרכישת נתונים עם הערה. בדקה האחרונה של נקודת ההתחלה, אסוף מדידת לחץ דם והזן את הערכים בהערה בקובץ התוכנה לרכישת נתונים.
- הגדל את תנורי החימום המקומיים ל 39 ° C או 42 ° C, בהתאם לצרכי הפרוטוקול (מוסבר בסעיף הדיון).
- לאחר ששטף RBC התייצב בתגובה ליישום חום מקומי (~ 40-60 דקות חימום), מחורר N G-nitro-l-arginine methyl ester (L-NAME; 15 mM מומס בתמיסת רינגר; 2 μL/min; מעכב NO סינתאז) דרך בדיקת המיקרודיאליזה.
- לאחר שטף RBC יש מישור בתגובה L-NAME (~ 15-25 דקות של זילוח), להגדיל את תנורי חימום מקומיים ל 43 ° C.
- ברגע שטף RBC התייצב בתגובה ל 43 ° C (רמה ~ 2-5 דקות מתרחשת לאחר ~ 20-45 דקות של חימום), perfuse נתרן nitroprusside (28 mM מומס בתמיסה של רינגר) דרך בדיקת מיקרודיאליזה.
- לאחר שהתרחשה רמה מקסימלית של שטף RBC (~ 5 דקות PU יציב), סיים את הניסוי. בחר עצור בפינה השמאלית התחתונה של תוכנת רכישת הנתונים כדי לסיים את איסוף הנתונים.
6. הסרת בדיקות המיקרודיאליזה
- לאחר סיום הניסוי, השתמש בזוג מספריים כירורגיים כדי לחתוך את בדיקות המיקרודיאליזה. בזהירות להסיר את בדיקות LDF מן תנורי חימום, ולהסיר את תנורי חימום מן העור. הסר בעדינות את הסרט המחזיק את הגשושיות במקומן על העור.
- זהה חזותית איזה אתר נקב משני צדי הבדיקה יצר את קריש הדם הקטן ביותר. חתכו את החלק של הבדיקה ליד האתר עם הקריש הקטן יותר, והותירו ~ 1 בתוך הבדיקה מחוץ לעור ללא חתך.
- נקו את החלק של העור המקיף את אתרי הכניסה והיציאה של הגשושית עם מקלון אלכוהול, כמו גם את ~1 באורך הבדיקה שנותרה באתר הפחות קרוש.
- הניחו לאלכוהול להתייבש על העור. לאחר מכן, תפסו את החלק של הגשושית המשתרע מאתר הניקוב עם הקריש הגדול יותר, מול ~1 בחלק בקצה הפחות קרוש. משכו באיטיות את הבדיקה לכיוון קריש הדם הגדול יותר.
- הניחו גזה סטרילית על כל דימום הנובע מהסרת הבדיקה, והפעילו לחץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול תגובה למינון אצטילכולין
איור 1A מתאר סכמה המפרטת את פרוטוקול התגובה למינון ACh. איור 1B מדגים מעקבים מייצגים של ערכי שטף RBC (יחידות זילוח, PU; ממוצע של 30 שניות) מפרוטוקול תגובת מינון ACh המתוקנן עבור נבדק אחד לאורך זמן. איור 1C מדגים קובץ נתונים גולמי של פרוטוקול תגובת מינון ACh. מדידות בסיסיות נוספות נשמרו בקובץ הנתונים הגולמיים, אך רק ~10 דקות של קו בסיס נוצלו לניתוח הנתונים.
לאחר רזולוציית היפרמיה ושטף RBC יציב למשך 5 דקות, איסוף הנתונים הבסיסיים של 10 דקות עשוי להתחיל. קו הבסיס מתואר כקו שטף RBC אופקי יציב יחסית, שבו כל סיבה לסטיות (למשל, תוצרי תנועה, התאמות בדיקה) צריכה להירשם כהערות תוכנה לרכישת נתונים למטרות ניתוח. פרוטוקול תגובת המינון עוקב אחר תקופת הבסיס, ויש להחליף את המזרקים בכל מנה, מ- 10-10 M ל- 10-1 M ACh. לפני תחילת זילוח 5-10 דקות של כל מנה, יש לוודא כי סוכן פרמקולוגי יש מחורר מלא דרך אורך הסיב. בתוכנת איסוף הנתונים, תהיה עלייה ראשונית בשטף RBC עקב הזלוף, אך זה לא נכלל בניתוחים, מכיוון שאיסוף הנתונים של 5 דקות עבור ריכוז זה לא החל. ברגע שהזילוח עבור כל מנה החל, תהיה עלייה מתמשכת בשטף RBC לשיא, ואחריו ירידה מתמדת. תגובה עקלקלה זו לחומרים פרמקולוגיים תשוכפל לאורך כל הפרוטוקול, אך שטף RBC יהיה גדול יחסית עם ריכוזים הולכים וגדלים של ACh. עם ריכוזים נמוכים יותר של ACh, התגובה העקמולה עשויה להיות פחות בולטת. דוגמאות לשטף RBC לא אופטימלי כוללות: 1) תגובה לא עקלקלה, שבה שטף RBC אינו גדל ונשאר מישורי, או 2) עלייה בריכוזי ACh בעלת השפעה מינימלית על שטף RBC, כאשר שטף RBC אינו גדל באופן יחסי עם כל ריכוז של ACh. הדבר תלוי בשאלת המחקר ובקבוצה הקלינית הנבדקת.
בעקבות הריכוז הסופי של ACh, רינגר הנקה מחורר, ואת תנורי חימום מקומיים הם גדלו ל 43 ° C. במהלך שלב זה, יש להשיג רמה לפני נתרן nitroprusside הוא מחורר. פעולה זו עשויה להימשך עד ~45 דקות, תלוי בסוכנים הקודמים המחוררים. שלב זה אינו נכלל בניתוחים. לאחר שהרמה הושגה במשך 5 דקות, נתרן nitroprusside הוא perfused כדי לייצר vasodilation מקומי מקסימלי. התרחבות כלי דם מקומית מקסימלית זו מתוארת כעלייה בשטף RBC, כאשר רמה מתקבלת לאחר ~20 דקות של זילוח, או על ידי שטף RBC המגיע לשיא ויורד מיד לאחר מכן. לאחר שהושגה רמה או ירידה בשטף RBC עבור נתרן nitroprusside, הפרוטוקול הושלם. דוגמה נפוצה לשטף RBC לא אופטימלי היא הערך הגבוה ביותר של שטף RBC המתקבל בשלב אחר של הפרוטוקול (למשל, במהלך פרוטוקול מנה-תגובה) ולא במהלך הרחבת כלי הדם המקומית המקסימלית.
פרוטוקול תגובה למינון אצטילכולין: עיכוב תחמוצת החנקן סינתאז
כדי לכמת את התרומה של NO לזרימת הדם העורית בתגובה ל-ACh, N G-nitro-l-arginine methyl ester (L-NAME), מעכב NO synthase, מחורר בשילוב עם ACh באמצעות סיב נוסף. איור 2A מתאר סכמה המפרטת את פרוטוקול התגובה למינון ACh עם L-NAME. איור 2B מדגים מעקבים מייצגים של שטף RBC (ממוצע של 30 שניות) מפרוטוקול תגובת מינון ACh המתוקנן עבור נבדק אחד לאורך זמן עם L-NAME. איור 2C מדגים קובץ נתונים גולמיים של פרוטוקול תגובת מינון ACh עם L-NAME. מדידות בסיסיות נוספות נשמרו בקובץ הנתונים הגולמיים, אך רק ~10 דקות של קו בסיס נוצלו לניתוח הנתונים.
לאחר רזולוציית היפרמיה, שטף RBC יציב למשך 5 דקות, וזמן מספיק כדי לחסום באופן מלא את המסלול האנזימטי של העניין (למשל, NO סינתאז) ו / או לספק ריכוזים נאותים של גורמים משלימים, 10 דקות של איסוף נתונים בסיסיים עשויים להתחיל (מתואר כקו אופקי יציב יחסית). פרוטוקול המינון-תגובה עוקב אחר קו הבסיס, ויש לשנות את המזרקים עם כל מנה החל מ- 1010 M ל- 101 M ACh עם מעכב NO סינתאז (למשל, 15 mM L-NAME). בנוכחות מעכב NO סינתאז, התגובה העקלתונית אינה משוכפלת היטב עד לריכוזים גבוהים יותר של ACh. ייצפה שטף RBC נמוך יחסית, בהשוואה לאתר ללא עיכוב סינתאז. דוגמה נפוצה לשטף RBC לא אופטימלי היא עיכוב NO סינתאז, בהשוואה לתנאים ללא עיכוב NO סינתאז, וכתוצאה מכך שטף RBC גבוה יותר. הדבר מצביע על כך שהפרוטוקול נכשל.
בעקבות זילוח הריכוז הסופי של ACh, רינגר הנקה מחורר, ואת תנורי חימום מקומיים הם גדלו ל 43 ° C. במהלך שלב זה, רמה צריכה להתקבל לפני נתרן nitroprusside הוא מחורר. שלב זה אינו נכלל בניתוחים. לאחר שהרמה הושגה במשך 5 דקות, נתרן nitroprusside הוא מחורר, לייצר vasodilation מקומי מקסימלי. במהלך הרחבת כלי דם מקומית מקסימלית, תהיה עלייה אקספוננציאלית בשטף RBC עקב עיכוב NO סינתאז הקודם. רמה תתקבל לאחר ~20 דקות של זילוח, או שטף RBC יגיע לשיאו המוחלט וירד מיד לאחר מכן. לאחר שהושגה רמה או ירידה בשטף RBC עבור נתרן nitroprusside, הפרוטוקול הושלם. דוגמה נפוצה לשטף RBC לא אופטימלי היא השגת ערך שטף RBC הגבוה ביותר בשלב אחר של הפרוטוקול (למשל, במהלך פרוטוקול מנה-תגובה) ולא במהלך הרחבת כלי הדם המקומית המקסימלית.
פרוטוקול חימום מקומי
איור 3A מתאר סכמה המפרטת את פרוטוקול החימום המקומי. איור 3B מדגים עקבות מייצגים של שטף RBC (ממוצע של 30 שניות) עבור פרוטוקול חימום מקומי סטנדרטי עבור נושא אחד לאורך זמן. איור 3C מדגים קובץ נתונים גולמיים של פרוטוקול חימום מקומי. לאחר רזולוציית היפרמיה ושטף RBC יציב למשך 5 דקות, 10 דקות של איסוף נתונים בסיסיים עשויים להתחיל (מתואר כקו אופקי יציב יחסית). תנורי החימום המקומיים מכוונים ל -39 מעלות צלזיוס או 42 מעלות צלזיוס, ותגובת שיא ושפל ראשונית תתרחש בשטף RBC. כדי לכמת את תרומתו של NO לזרימת הדם העורית בתגובה לגירוי חום מקומי, L-NAME מחורר לאחר שהושגה רמה יציבה בשטף RBC. תהיה ירידה מהירה בשטף RBC עד שהוא יגיע לרמה חדשה בתגובה ל- L-NAME. לאחר 5 דקות של ערכי שטף RBC יציבים, רינגר הנקה מחורר, ואת תנורי חימום מקומיים הם גדלו ל 43 ° C. החימום ייצור תגובת שיא ושפל נוספת בשטף RBC. במהלך שלב זה, יש לוודא כי רמה הושגה לפני נתרן nitroprusside הוא מחורר. שלב זה אינו נכלל בניתוחים. כדי לגרום להרחבת כלי דם מקסימלית מקומית, נתרן nitroprusside הוא מחורר, ועלייה מהירה שטף RBC יתרחש. לאחר שנצפתה רמה או ירידה בשטף RBC בתגובה לנתרן ניטרופרוסייד, הפרוטוקול הושלם.
איור 1: פרוטוקול תגובת מינון אצטילכולין (ACh). (A) סכמה של פרוטוקול תגובת מינון ACh. (B) מעקב מייצג (ממוצע של 30 שניות) של פרוטוקול תגובת מינון ACh. (C) נתונים גולמיים של פרוטוקול תגובת מינון ACh. מדידות בסיסיות נוספות נשמרות בקובץ הנתונים הגולמיים כדי להדגים את התנודות לפני הייצוב, אך רק ~10 דקות של נתוני מנוחה יציבים נוצלו לניתוח הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פרוטוקול תגובת מינון ACh עם עיכוב סינתאז של תחמוצת החנקן (NO). (A) סכמטי של פרוטוקול תגובת מינון ACh עם עיכוב NO סינתאז. (B) מעקב מייצג של פרוטוקול תגובת מינון ACh ללא עיכוב סינתאז. (C) נתונים גולמיים של פרוטוקול תגובת מינון ACh ללא עיכוב סינתאז. מדידות בסיסיות נוספות נשמרות בקובץ הנתונים הגולמיים כדי להדגים את התנודות לפני הייצוב, אך רק ~10 דקות של נתוני מנוחה יציבים נוצלו לניתוח הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פרוטוקול חימום מקומי. (A) סכמטי של פרוטוקול חימום מקומי. (ב) מעקב מייצג אחר פרוטוקול חימום מקומי. (C) נתונים גולמיים של פרוטוקול חימום מקומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקת המיקרודיאליזה התוך-עורית היא כלי רב-תכליתי בחקר כלי הדם בבני אדם. החוקרים עשויים לשנות את הפרוטוקול כדי לגוון עוד יותר את היישומים שלו. לדוגמה, אנו מתארים פרוטוקול תגובת מינון ACh, אך מחקרים אחרים על מנגנוני התכווצות כלי הדם או הטונוס הוואזו-מוטורי, ולא הרחבת כלי הדם בלבד, השתמשו בגישות של נוראפינפרין או נתרן ניטרופרוסיד למנה-תגובה 26,27,28,29,30,31. מתווכים אחרים של הרחבת כלי דם, כגון מנטול או מטאכלור כלורי, הועסקו גם הם בפרוטוקול מנה-תגובה31,32. פרוטוקול תגובת מינון כהערכה פרמקולוגית של תפקוד כלי הדם הוא טכניקה מכניסטית ממוקדת יותר לבידוד מנגנוני איתות ספציפיים בהשוואה לפרוטוקול החימום המקומי, שכן הוא מסיר שינויים בתגובה הסימפתטית לגירויים תרמיים. עם זאת, חימום מקומי הוא גישה חסכונית המשתמשת בגירוי פיזיולוגי כדי לגרום להרחבת כלי הדם באמצעות מנגנונים נוירוגניים ותלויי אנדותל. חשוב גם לקחת בחשבון את מנגנון העניין כאשר בוחרים בין פרוטוקול חימום מקומי של 39 מעלות צלזיוס או 42 מעלות צלזיוס. פרוטוקול 39 ° C הוצע לבודד טוב יותר התרחבות כלי דם ללא תיווך, בעוד פרוטוקול 42 ° C מאפשר חקירה של הרחבת כלי דם ללא תיווך והרחבת כלי דם בתיווך גורם היפרפולריזציההנגזר מאנדותל 33,34. בנוסף, הגידול CVC בתגובה לחימום מקומי של 42 מעלות צלזיוס נוטה להיות חזק יותר (כלומר, להגיע ל %CVC מקסימליגבוה יותר 34). עם זאת, כאשר משתמשים בסוכן חדש כדי לחקור מסלול איתות ספציפי, יש להשתמש בשיטות קפדניות כדי להעריך את היעילות (כלומר, חסימה מלאה) ו / או ריכוזים רוויים של גורמים משלימים.
תפקוד אנדותל נמדד לעתים קרובות באמצעות טכניקת התרחבות בתיווך זרימה, אך תפקוד לקוי של האנדותל במיטות כלי דם יכול להתרחש לפני או ללא תלות בתפקוד אנדותל בעורקים מוליכים גדולים, במיוחד בפתולוגיות כגון HTN 6,7,8. יתר על כן, טכניקת ההתרחבות בתיווך זרימה אינה מאפשרת דיסקציה פרמקולוגית של הפתופיזיולוגיה של תפקוד לקוי של האנדותל בבידוד מהשפעות מערכתיות. שיטות אחרות לחקר תפקוד אנדותל מיקרו-וסקולרי, כגון יונטופורזיס או היפרמיה תגובתית פוסט-חסימתית, אינן מסוגלות לכוון במדויק את מנגנוני תפקוד האנדותל באמצעות התערבות פרמקולוגית12. לכן, מיקרודיאליזה תוך-עורית מאפשרת באופן ייחודי חקירה ממוקדת של מנגנוני תפקוד כלי הדם, והשימוש בה, יחד עם תוצאות התרחבות בתיווך זרימה, עשויים לספק תמונה הוליסטית יותר של תפקוד כלי הדם המערכתי.
לא משנה באיזו גישה של מיקרודיאליזה תוך-עורית ננקטים, יש לנקוט אמצעי זהירות מסוימים כדי להבטיח את תקפותן ושחזורן של התגובות. בעוד שניתן להתאים את הפרטים של פרוטוקול הניסוי כדי לענות על שאלות מחקר ספציפיות, המיקום המדויק של בדיקת המיקרודיאליזה הוא קריטי לחלוטין. יש להקפיד להחדיר את הבדיקה לדרמיס ולהימנע מכלי הדם הגדולים יותר הנראים לעין או המוחשיים של העור. ניקוב כלי דם אלה יגרום לערכי יחידות זילוח נמוכים באופן חריג; במקרה זה, מד זרימת דופלר בלייזר ימדוד את היווצרות המטומה ולא את זרימת תאי הדם האדומים דרך כלי שלם. לאחר מכן, השלב הבא הקריטי ביותר של פרוטוקול זה הוא הפתרון של התגובה hyperemic לנקב המחט. אם התגובה ההיפרמית אינה מורשית לשקוע במלואה, יחידות הזילוח המוקלטות לאורך קו הבסיס והחלקים המוקדמים של הפרוטוקול יהיו גדולות מערכי המנוחה האמיתיים. אם הותר זמן התאוששות מספיק אך יחידות הזילוח נותרו גבוהות באופן חריג, ייתכן שיהיה צורך בכיול מחדש של הגשושיות לפני תחילת שלב איסוף הנתונים הבסיסי.
מגבלה של טכניקת המיקרודיאליזה התוך-עורית היא שהיא אינה יכולה לבודד באופן ספציפי סוג רקמה כדי להעריך מסלולי איתות וסקולריים. מכיוון שלא ניתן לנתח ולדמיין את כלי הדם של העור in vivo, אין דרך להבטיח שהחלק החדיר למחצה של בדיקת מיקרודיאליזה יהיה צמוד מיד לרקמה המעניינת (למשל, אנדותל כלי הדם). לכן, התוצאות המתקבלות מטכניקה זו מייצגות את האופי האינטגרטיבי של הפיזיולוגיה האנושית ומספקות תובנות לגבי התפקוד הקולקטיבי של האנדותל, שריר חלק כלי דם והשפעות עצביות על זרימת הדם המקומית. עם זאת, אם משתמשים בפרוטוקול חימום מקומי, מתן אפשרות לשטף RBC להגיע לרמה בעלייה הראשונית בחום ל -39 ° C או 42 ° C מאפשר את הרזולוציה של הרפלקס האקסונלי לחום, אשר לאחר מכן מאפשר תגובה בעיקר בתיווך אנדותל, כפי שנדון במקום אחר35. מגבלה נוספת של טכניקה זו היא השימוש במד זרימה דופלר בלייזר כמדד לזרימת הדם בעור. מד זרימה דופלר לייזר מכמת את שטף תאי הדם האדומים, שאינו מסביר את השינויים בקוטר כלי הדם (כלומר, התרחבות כלי הדם), כפי שיידרש כדי לכמת את הזרימה המוחלטת. הוא עשוי להיות רגיש להבדלים בין משתתפים או בין תנאים36. יישומים עתידיים של מיקרודיאליזה תוך עורית עשויים לשלב טכניקות לכימות זרימת הדם המיקרו-וסקולרית המוחלטת. לדוגמה, הפיתוח האחרון של טומוגרפיה קוהרנטית אופטית מאפשר לכמת את קוטר כלי הדם באמצעות הדמיה תלת מימדית של microvasculature העור13. טכניקת מיקרודיאליזה תוך עורית היא התווית במקרים מעטים מאוד אך חשובים, הכוללים, אך אינם מוגבלים, משתתפים עם בעיות עור, משתתפים עם אלרגיות הקשורות לחומרים המתוארים כאן, משתתפים עם טריפנופוביה חמורה, ומשתתפים עם קעקועים המכסים את כל ההיבט הגחוני של האמה (אבל קעקועים קטנים באזור זה אינם הדרה).
היכולת הייחודית של גישת המיקרודיאליזה לסייע בבידוד ושרטוט מנגנונים פתופיזיולוגיים בסיסיים הופכת אותה ליתרון בחקירת האטיולוגיה המשתנה של HTN, בין שאר CVD. לאחר אופטימיזציה של פרוטוקולים, טכניקה זו מאפשרת להעריך את היעילות של טיפולים חדשניים במחלות לב וכלי דם. יתר על כן, מיקרודיאליזה תוך-עורית מספקת שיטה להערכת ההשפעות מחוץ למטרה של טיפולים תרופתיים היפותטיים שאינם קשורים, מה שהופך אותה לכלי בעל ערך רב ליידע ניסויים קליניים בקנה מידה גדול יותר. יחד, טכניקה זו היא נכס רב ערך במחקר כלי הדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים ואין מה לחשוף.
Acknowledgments
ללא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
References
- Xu, J. Q., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Arias, E.
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93 (2023).
- Cohuet, G., Struijker-Boudier, H. Mechanisms of target organ damage caused by hypertension: Therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 111 (1), 81-98 (2006).
- Park, K. H., Park, W. J. Endothelial dysfunction: Clinical implications in cardiovascular disease and therapeutic approaches. Journal of Korean Medical Science. 30 (9), 1213-1225 (2015).
- Levy, B. I., Ambrosio, G., Pries, A. R., Struijker-Boudier, H. A. Microcirculation in hypertension: a new target for treatment. Circulation. 104 (6), 735-740 (2001).
- Sara, J. D., et al. Prevalence of coronary microvascular dysfunction among patients with chest pain and nonobstructive coronary artery disease. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Interventions. 8 (11), 1445-1453 (2015).
- Weis, M., Hartmann, A., Olbrich, H. G., Hör, G., Zeiher, A. M. Prognostic significance of coronary flow reserve on left ventricular ejection fraction in cardiac transplant recipients. Transplantation. 65 (1), 103-108 (1998).
- Rossi, M., et al. Investigation of skin vasoreactivity and blood flow oscillations in hypertensive patients: Effect of short-term antihypertensive treatment. Journal of Hypertension. 29 (8), 1569-1576 (2011).
- Pepine, C. J., et al. Coronary microvascular reactivity to adenosine predicts adverse outcome in women evaluated for suspected ischemia results from the National Heart, Lung and Blood Institute WISE (Women's Ischemia Syndrome Evaluation) study. Journal of the American College of Cardiology. 55 (25), 2825-2832 (2010).
- Matsuda, J., et al. Prevalence and clinical significance of discordant changes in fractional and coronary flow reserve after elective percutaneous coronary intervention. Journal of the American Heart Association. 5 (12), e004400 (2016).
- Gupta, A., et al. Integrated noninvasive physiological assessment of coronary circulatory function and impact on cardiovascular mortality in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 136 (24), 2325-2336 (2017).
- Roustit, M., Cracowski, J. L. Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 373-384 (2013).
- Low, D. A., Jones, H., Cable, N. T., Alexander, L. M., Kenney, W. L. Historical reviews of the assessment of human cardiovascular function: interrogation and understanding of the control of skin blood flow. European Journal of Applied Physiology. 120 (1), 1-16 (2020).
- Kenney, W. L., Cannon, J. G., Alexander, L. M. Cutaneous microvascular dysfunction correlates with serum LDL and sLOX-1 receptor concentrations. Microvascular Research. 85, 112-117 (2013).
- Holowatz, L. A., Thompson, C. S., Minson, C. T., Kenney, W. L. Mechanisms of acetylcholine-mediated vasodilatation in young and aged human skin. Journal of Physiology. 563, 965-973 (2005).
- Sokolnicki, L. A., Roberts, S. K., Wilkins, B. W., Basu, A., Charkoudian, N. Contribution of nitric oxide to cutaneous microvascular dilation in individuals with type 2 diabetes mellitus. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 292 (1), E314-E318 (2007).
- DuPont, J. J., Ramick, M. G., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species contribute to impaired cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 306 (12), F1499-F1506 (2014).
- Sprung, V. S., et al. Nitric oxide-mediated cutaneous microvascular function is impaired in polycystic ovary syndrome but can be improved by exercise training. Journal of Physiology. 591 (6), 1475-1487 (2013).
- Greaney, J. L., Saunders, E. F. H., Santhanam, L., Alexander, L. M. Oxidative stress contributes to microvascular endothelial dysfunction in men and women with major depressive disorder. Circulatory Research. 124 (4), 564-574 (2019).
- Stanhewicz, A. E., Jandu, S., Santhanam, L., Alexander, L. M. Increased angiotensin II sensitivity contributes to microvascular dysfunction in women who have had preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 382-389 (2017).
- Greaney, J. L., et al. Impaired hydrogen sulfide-mediated vasodilation contributes to microvascular endothelial dysfunction in hypertensive adults. Hypertension. 69 (5), 902-909 (2017).
- Dillon, G. A., Stanhewicz, A. E., Serviente, C., Greaney, J. L., Alexander, L. M. Hydrogen sulfide-dependent microvascular vasodilation is improved following chronic sulfhydryl-donating antihypertensive pharmacotherapy in adults with hypertension. Journal of Physiology. 321 (4), H728-H734 (2021).
- Wong, B. J., et al. Sensory nerve-mediated and nitric oxide-dependent cutaneous vasodilation in normotensive and prehypertensive non-Hispanic blacks and whites. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (2), H271-H281 (2020).
- Dillon, G. A., Greaney, J. L., Shank, S., Leuenberger, U. A., Alexander, L. M. AHA/ACC-defined stage 1 hypertensive adults do not display cutaneous microvascular endothelial dysfunction. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (3), H539-H546 (2020).
- Gagge, A. P., Stolwijk, J. A., Hardy, J. D. Comfort and thermal sensations and associated physiological responses at various ambient temperatures. Environmental Research. 1 (1), 1-20 (1967).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Lack of limb or sex differences in the cutaneous vascular responses to exogenous norepinephrine. Journal of Applied Physiology. 117 (12), 1417-1423 (2014).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Impaired increases in skin sympathetic nerve activity contribute to age-related decrements in reflex cutaneous vasoconstriction. Journal of Physiology. 593 (9), 2199-2211 (2015).
- Alba, B. K., Greaney, J. L., Ferguson, S. B., Alexander, L. M. Endothelial function is impaired in the cutaneous microcirculation of adults with psoriasis through reductions in nitric oxide-dependent vasodilation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (2), H343-H349 (2018).
- Greaney, J. L., Surachman, A., Saunders, E. F. H., Alexander, L. M., Almeida, D. M. Greater daily psychosocial stress exposure is associated with increased norepinephrine-induced vasoconstriction in young adults. Journal of the American Heart Association. 9 (9), e015697 (2020).
- Nakata, T., et al. Quantification of catecholamine neurotransmitters released from cutaneous vasoconstrictor nerve endings in men with cervical spinal cord injury. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (3), R345-R352 (2023).
- Tucker, M. A., et al. Postsynaptic cutaneous vasodilation and sweating: Influence of adiposity and hydration status. European Journal of Applied Physiology. 118 (8), 1703-1713 (2018).
- Craighead, D. H., Alexander, L. M. Menthol-induced cutaneous vasodilation is preserved in essential hypertensive men and women. American Journal of Hypertension. 30 (12), 1156-1162 (2017).
- Brunt, V. E., Minson, C. T. KCa channels and epoxyeicosatrienoic acids: Major contributors to thermal hyperaemia in human skin. Journal of Physiology. 590 (15), 3523-3534 (2012).
- Choi, P. J., Brunt, V. E., Fujii, N., Minson, C. T. New approach to measure cutaneous microvascular function: An improved test of NO-mediated vasodilation by thermal hyperemia. Journal of Applied Physiology. 117 (3), 277-283 (2014).
- Johnson, J. M., Kellogg, D. L. Jr Local thermal control of the human cutaneous circulation. Journal of Applied Physiology. 109 (4), 1229-1238 (2010).
- Jung, F., et al. Laser Doppler flux measurement for the assessment of cutaneous microcirculation-Critical remarks. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 55 (4), 411-416 (2013).
