Summary
La microdialisi intradermica è una tecnica minimamente invasiva utilizzata per studiare la funzione microvascolare in salute e malattia. Sia i protocolli dose-risposta che quelli di riscaldamento locale possono essere utilizzati per questa tecnica per esplorare i meccanismi di vasodilatazione e vasocostrizione nella circolazione cutanea.
Abstract
La vascolarizzazione cutanea è un tessuto accessibile che può essere utilizzato per valutare la funzione microvascolare nell'uomo. La microdialisi intradermica è una tecnica mini-invasiva utilizzata per studiare i meccanismi della muscolatura liscia vascolare e della funzione endoteliale nel circolo cutaneo. Questa tecnica consente la dissezione farmacologica della fisiopatologia della disfunzione endoteliale microvascolare come indicizzata dalla diminuzione della vasodilatazione mediata dall'ossido nitrico, un indicatore del rischio di sviluppo di malattie cardiovascolari. In questa tecnica, una sonda per microdialisi viene posizionata nello strato dermico della pelle e un'unità di riscaldamento locale con una sonda di flusso laser Doppler viene posizionata sopra la sonda per misurare il flusso di globuli rossi. La temperatura cutanea locale viene bloccata o stimolata con l'applicazione diretta di calore e gli agenti farmacologici vengono perfusi attraverso la sonda per stimolare o inibire le vie di segnalazione intracellulari al fine di indurre vasodilatazione o vasocostrizione o per interrogare meccanismi di interesse (cofattori, antiossidanti, ecc.). Viene quantificata la conduttanza vascolare cutanea e possono essere delineati i meccanismi di disfunzione endoteliale negli stati patologici.
Introduction
Le malattie cardiovascolari (CVD) sono la principale causa di morte negli Stati Uniti1. L'ipertensione (HTN) è un fattore di rischio indipendente per ictus, malattia coronarica e insufficienza cardiaca e si stima che colpisca fino a ~ 50% della popolazione degli Stati Uniti2. L'HTN può svilupparsi come CVD indipendente (HTN primaria) o come risultato di un'altra condizione, come la malattia del rene policistico e/o disturbi endocrini (HTN secondario). L'ampiezza delle eziologie dell'HTN complica le indagini sui meccanismi sottostanti e sul danno d'organo terminale osservato con l'HTN. Sono necessari approcci di ricerca diversi e nuovi nella fisiopatologia del danno d'organo terminale associato all'HTN.
Uno dei primi segni patologici di CVD è la disfunzione endoteliale, caratterizzata da una compromissione della vasodilatazione mediata dall'ossido nitrico (NO) 3,4,5. La dilatazione flusso-mediata è un approccio comune utilizzato per quantificare la disfunzione endoteliale associata a CVD, ma la disfunzione endoteliale nei letti microvascolari può essere sia indipendente che precursore di quella delle grandi arterie del condotto 6,7,8. Inoltre, le arteriole di resistenza sono più direttamente influenzate dal tessuto locale rispetto alle arterie del condotto e hanno un controllo più immediato sulla consegna di sangue ricco di ossigeno. La funzione microvascolare è predittiva della sopravvivenza libera da eventi cardiovascolariavversi 9,10,11. La microvascolarizzazione cutanea è un letto vascolare accessibile che può essere utilizzato per esaminare le risposte a stimoli fisiologici e farmacologici vasocostrittori o vasodilatatori. La microdialisi intradermica è una tecnica mini-invasiva, il cui obiettivo è quello di indagare i meccanismi sia della muscolatura liscia vascolare che della funzione endoteliale nella microvascolarizzazione cutanea con dissezione farmacologica mirata. Questo metodo contrasta con altre tecniche, come l'iperemia reattiva post-occlusiva, che non consente la dissezione farmacologica, e la ionoforesi, che consente la veicolazione farmacologica ma è meno precisa nel suo meccanismo d'azione (esaminata in modo approfondito altrove12).
La logica alla base dello sviluppo e dell'uso di questa tecnica è ampiamente esaminata altrove13. Questo approccio è stato originariamente sviluppato per l'uso nella ricerca neurologica nei roditori e poi è stato applicato per la prima volta all'uomo per studiare i meccanismi alla base della vasodilatazione attiva da un punto di vista termoregolatorio. Alla fine degli anni '90, questo metodo è stato utilizzato per esaminare sia i meccanismi neurali che quelli endoteliali per quanto riguarda il riscaldamento locale della pelle. Da quel momento, la tecnica è stata utilizzata per studiare una serie di meccanismi di segnalazione neurovascolare nella pelle.
Utilizzando questa tecnica, il nostro gruppo e altri hanno interrogato i meccanismi della disfunzione endoteliale nella microvascolarizzazione di diverse popolazioni cliniche, tra cui, ma non solo, dislipidemia, invecchiamento primario, diabete, malattia renale cronica, sindrome dell'ovaio policistico, preeclampsia, disturbo depressivo maggiore 14,15,16,17,18,19 e ipertensione 20,21,22,23,24. Ad esempio, uno studio precedente ha rilevato che le donne normotese con una storia di preeclampsia, che sono a maggior rischio di CVD, avevano una riduzione della vasodilatazione NO-mediata nella circolazione cutanea rispetto alle donne con una storia di gravidanza normotesa20. In un altro studio, gli adulti con diagnosi di HTN primaria hanno dimostrato una maggiore sensibilità all'angiotensina II nella microvascolarizzazione rispetto ai controlli sani21 e la farmacoterapia antipertensiva cronica donatrice di sulfidrile nei pazienti HTN primari ha dimostrato di ridurre la pressione sanguigna e migliorare sia la vasodilatazione mediata da idrogeno solfuro che quella mediata da NO22. Wong et al.23 hanno riscontrato una compromissione della vasodilatazione mediata sensorialmente e NO-mediata negli adulti preipertesi, in coincidenza con la nostra scoperta di una progressione della disfunzione endoteliale con l'aumento degli stadi HTN, come classificato dalle linee guida 2017 dell'American Heart Association e dell'American College of Cardiology24.
La tecnica di microdialisi intradermica consente indagini meccanicistiche strettamente controllate sulla funzione microvascolare in condizioni di salute e malattia. Pertanto, questo articolo si propone di descrivere la tecnica di microdialisi intradermica applicata dal nostro gruppo e da altri. Descriviamo in dettaglio le procedure sia per la stimolazione farmacologica dell'endotelio con acetilcolina (ACh) per esaminare la relazione dose-risposta che per la stimolazione fisiologica della produzione endogena di NO con un protocollo di stimolo di riscaldamento locale a 39 °C o 42 °C. Presentiamo i risultati rappresentativi per ogni approccio e discutiamo le implicazioni cliniche dei risultati che sono emersi da questa tecnica.
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Protocol
Tutte le procedure sono approvate dall'Institutional Review Board della Pennsylvania State University prima del reclutamento dei partecipanti.
1. Configurazione dell'attrezzatura
- Accendere l'unità di riscaldamento locale e il misuratore di portata laser Doppler.
NOTA: Entrambi devono essere calibrati prima della raccolta dei dati secondo le istruzioni del produttore. Il misuratore di portata laser Doppler deve essere collegato all'hardware di acquisizione dati con campionamento a 100 Hz (100 campioni/min) e registrazione continua in un software di acquisizione dati. Sebbene sia possibile utilizzare altro hardware e software per l'acquisizione dei dati, per semplicità, le istruzioni rimanenti riflettono le funzionalità dell'hardware PowerLab e del software LabChart. - Aprire un file del software LabChart.
NOTA: È necessario creare in anticipo un file di riferimento con l'immissione dei dati desiderata e le capacità di raccolta continua dei dati. Dovrebbe esserci un pannello per ogni laser Doppler e riscaldatore locale che corrisponde a ciascun sito di microdialisi e i pannelli dovrebbero corrispondere agli ingressi del canale appropriati nell'unità hardware di acquisizione dati.
2. Posizionamento delle fibre per microdialisi
- Identifica i vasi sanguigni grandi e visibili della pelle nell'aspetto ventrale dell'avambraccio e indicali con un pennarello indelebile (utilizzare un laccio emostatico per visualizzare i vasi, se necessario; identificare i vasi nella pelle pigmentata scura può richiedere un maggiore affidamento sulla palpazione).
- Tamponare l'area che comprende i segni e una generosa porzione dell'area circostante utilizzando tamponi betadine. Pulisci il betadine con tamponi imbevuti di alcol. Coprire l'area sterilizzata della pelle con un telo sterile e applicare del ghiaccio per ~5 minuti per intorpidire l'area.
- Rimuovere il ghiaccio e inserire un ago introduttore (23 G, lunghezza 25 mm), con lo smusso rivolto verso l'alto, nello strato dermico della pelle a una profondità di 2-3 mm (a seconda dello spessore della pelle). Far avanzare l'ago, facendo attenzione a rimanere nello strato dermico, ed uscire dalla pelle ~20 mm dal punto di inserimento.
NOTA: Per confermare la corretta profondità di posizionamento nella pelle, la forma dell'ago deve essere visibile e facilmente palpabile, ma il colore dell'ago deve essere nascosto. Se per l'esperimento è necessaria più di una sonda per microdialisi, è necessario posizionare due aghi introduttori a ≥2,5 cm di distanza l'uno dall'altro e posizionarli prima dell'inserimento della sonda per microdialisi. Le sonde non devono essere posizionate lungo lo stesso recipiente principale. - Lasciando l'ago in posizione, collegare la sonda (tramite il Luer lock) a una siringa contenente la soluzione di Ringer lattato. Far passare l'estremità opposta della sonda attraverso l'ago introduttore fino a quando la membrana semipermeabile della sonda non è vicina ma ancora al di fuori dell'apertura dell'ago introduttore. Perfondere lentamente una piccola quantità di soluzione di Ringer attraverso la fibra fino a quando la soluzione non è visibilmente perfusa attraverso i pori della membrana per confermare l'integrità della membrana.
- Se si utilizza una sonda per microdialisi e un ago introduttore di Harvard Bioscience, seguire i passaggi 2.5.1-2.5.2.
- Dopo aver confermato la funzione della sonda, alimentare ulteriormente la sonda attraverso l'ago introduttore fino a quando la membrana non è completamente contenuta nello strato dermico della pelle all'interno dell'ago introduttore.
- Usando un dito, fissare la sonda in posizione prossimale all'ago ed estrarre l'ago nella direzione opposta all'inserimento. Fissare la parte esterna della fibra sulla pelle per evitare lo spostamento della membrana semipermeabile durante l'esperimento.
- Se si utilizza una sonda per microdialisi Bioanalytical Systems e un ago introduttore, seguire i passaggi 2.6.1-2.6.2.
- Alla conferma della funzione della sonda, afferrare il mozzo dell'ago introduttore e la porzione distale della sonda per microdialisi in una mano e contemporaneamente estrarre l'ago nella direzione opposta alla direzione di inserimento, spostando la sonda per microdialisi in posizione.
- Regolare la sonda secondo necessità per assicurarsi che la membrana semipermeabile sia completamente sepolta nella pelle. Fissare la fibra esterna sulla pelle con del nastro adesivo per evitare lo spostamento della membrana semipermeabile durante l'esperimento.
3. Iperemia
- In attesa che la risposta iperemica all'inserimento dell'ago diminuisca (~60-90 min), posizionare la siringa monouso nel vassoio portasiringhe delle pompe per microinfusione. Perfuse la soluzione latta di Ringer, la soluzione salina o la soluzione veicolo (la soluzione in cui è disciolto l'agente farmacologico sperimentale; 2 μL/min) durante la fase di iperemia.
NOTA: Mentre le sonde per microdialisi non possono essere rimosse durante questa fase di ~60-90 minuti, il partecipante può regolare la posizione del corpo o muovere la mano, oppure il blocco Luer della sonda può essere rimosso dalla siringa e fissato con nastro adesivo al braccio del partecipante per consentire loro di stare in piedi brevemente. Una volta strumentate con riscaldatori locali e sonde di flusso laser Doppler (LDF) e una volta iniziata la raccolta dei dati, le sonde LDF non possono essere spostate. - Quando l'arrossamento della pelle, che è un indicatore della risposta iperemica al trauma dell'ago, si è attenuato, collegare l'unità di riscaldamento locale alla pelle che copre la membrana semipermeabile tramite il disco adesivo della sonda, assicurandosi che il centro del riscaldatore sia allineato con il percorso della sonda per microdialisi.
- Posizionare la sonda LDF nell'apertura al centro del riscaldatore locale in modo che il laser sia direttamente perpendicolare alla superficie della pelle. Una volta posizionate e fissate le sonde LDF, fare clic su start sul software di acquisizione dati per registrare e visualizzare continuamente i valori di flusso dei globuli rossi (flusso di globuli rossi; unità di perfusione, PU). Se l'iperemia si è completamente attenuata, il flusso dei globuli rossi sarà stabile a ~5-20 PU (la pulsatilità dei vasi al di sotto della sonda LDF può essere riflessa da lievi aumenti nell'UD che coincidono con i battiti cardiaci).
- Posizionare un bracciale automatico per la pressione sanguigna sul braccio di un soggetto che non è stato strumentato.
- Impostare i riscaldatori locali a 33 °C per bloccare la temperatura della pelle entro un intervallo termoneutro25, eliminando così qualsiasi variazione nell'influenza degli stimoli termici. Per aggiungere un commento alla registrazione continua nel software di acquisizione dati per indicare gli eventi dell'esperimento, fare clic sulla casella di testo nell'angolo in alto a destra dello schermo, digitare un commento, selezionare i canali che devono ricevere il commento e fare clic su Aggiungi.
4. Protocollo dose-risposta dell'acetilcolina
- Una volta che il flusso di globuli rossi si è stabilizzato in risposta al calore locale di 33 °C, iniziare la raccolta dei dati di base, distinti nel file del software di acquisizione dati da un commento di inizio linea di base. Per l'analisi dei dati è necessario almeno un minimo di 5-10 minuti di linea di base stabile; riavviare la linea di base in qualsiasi momento durante questo punto della raccolta dei dati, se necessario, e contrassegnarla nel file LabChart. Nell'ultimo minuto del basale, raccogliere una misurazione della pressione sanguigna e inserire i valori in un commento nel file LabChart.
- Alla fine dei 5-10 minuti di raccolta dei dati di base, misurare e registrare la pressione sanguigna basale e inserire la linea di base finale del commento nel software di acquisizione dati.
- Spegnere le pompe per microinfusione e sostituire le siringhe piene di soluzione di Ringer lattato con la siringa riempita con la concentrazione più bassa di ACh (10−10 M).
- Fissare le nuove siringhe in posizione e confermare la perfusione del fluido attraverso l'estremità della sonda prima di riaccendere le pompe per microinfusione. Inserire l'inizio del commento −10 nella registrazione del software di acquisizione dati.
- Ogni concentrazione di ACh sarà perfusa per 5-10 minuti a 2 μL/min. Nell'ultimo minuto di perfusione, per ogni concentrazione, misurare e registrare la pressione arteriosa. Una volta terminato il tempo di perfusione per una data concentrazione, sostituire la siringa con la successiva concentrazione più alta (ad esempio, la soluzione di 10−10 M ACh viene sostituita con una soluzione di 10−9 M ACh), come descritto nei passaggi 4.2-4.4.
- Immediatamente dopo aver perfuso la concentrazione finale di ACh (10−1 M), sostituire la siringa di ACh con una contenente la soluzione di Ringer e aumentare la temperatura del riscaldatore locale a 43 °C. Una volta che il flusso dei globuli rossi si è stabilizzato, sostituire la soluzione di Ringer con nitroprussiato di sodio (28 mM) per produrre una vasodilatazione locale massima indotta dal calore e farmacologicamente indotta. Misurare e registrare la pressione sanguigna ogni ~3 minuti durante questa fase di vasodilatazione massimale.
- Una volta che si è verificato un plateau di flusso massimo di globuli rossi (~5 min PU stabile), terminare l'esperimento. Selezionare Stop nell'angolo in basso a destra del software di acquisizione dati per terminare la raccolta continua dei dati.
5. Protocollo di riscaldamento locale
- Una volta che il flusso dei globuli rossi si è stabilizzato dopo l'iperemia, iniziare la raccolta dei dati di base e indicarlo nel file del software di acquisizione dati con un commento. Nell'ultimo minuto del basale, raccogliere una misurazione della pressione sanguigna e inserire i valori in un commento nel file del software di acquisizione dati.
- Aumentare i riscaldatori locali a 39 °C o 42 °C, a seconda delle esigenze del protocollo (spiegato nella sezione di discussione).
- Una volta che il flusso dei globuli rossi si è stabilizzato in risposta all'applicazione di calore locale (~40-60 min di riscaldamento), perfondere l'estere metilico di N G-nitro-l-arginina (L-NAME; 15 mM disciolti nella soluzione di Ringer; 2 μL/min; un inibitore della NO sintasi) attraverso le sonde di microdialisi.
- Una volta che il flusso di globuli rossi si è stabilizzato in risposta a L-NAME (~15-25 min di perfusione), aumentare i riscaldatori locali a 43 °C.
- Una volta che il flusso di globuli rossi si è stabilizzato in risposta a 43 °C (un plateau di ~2-5 minuti si verifica dopo ~20-45 minuti di riscaldamento), perfondere il nitroprussiato di sodio (28 mM disciolto nella soluzione di Ringer) attraverso la/e sonda/e di microdialisi.
- Una volta che si è verificato un plateau di flusso massimo di globuli rossi (~5 min PU stabile), terminare l'esperimento. Selezionare Stop nell'angolo in basso a destra del software di acquisizione dati per terminare la raccolta dei dati.
6. Rimozione delle sonde per microdialisi
- Al termine dell'esperimento, utilizzare un paio di forbici chirurgiche per tagliare le sonde di microdialisi. Rimuovere con cautela le sonde LDF dai riscaldatori e rimuovere i riscaldatori dalla pelle. Rimuovere delicatamente il nastro che tiene le sonde in posizione sulla pelle.
- Identificare visivamente quale sito di puntura su entrambi i lati della sonda ha formato il coagulo di sangue più piccolo. Tagliare la porzione della sonda vicino al sito con il coagulo più piccolo, lasciando ~ 1 pollice della sonda al di fuori della pelle non tagliata.
- Pulire la porzione di pelle che circonda i siti di ingresso e di uscita della sonda con un tampone imbevuto di alcol, nonché la lunghezza di ~1 della sonda lasciata sul sito meno coagulato.
- Lasciare asciugare l'alcol sulla pelle. Quindi, afferrare la porzione della sonda che si estende dal sito di puntura con il coagulo maggiore, opposto alla porzione ~1 sull'estremità meno coagulata. Tirare lentamente la sonda verso il coagulo di sangue più grande.
- Posizionare una garza sterile su eventuali emorragie derivanti dalla rimozione della sonda e applicare pressione.
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Representative Results
Protocollo dose-risposta dell'acetilcolina
La Figura 1A illustra uno schema che descrive in dettaglio il protocollo dose-risposta dell'ACh. La Figura 1B illustra i tracciati rappresentativi dei valori di flusso dei globuli rossi (unità di perfusione, PU; medie di 30 s) dal protocollo standardizzato di ACh dose-risposta per un soggetto nel tempo. La Figura 1C illustra un file di dati grezzi di un protocollo dose-risposta con ACh. Ulteriori misurazioni di base sono state mantenute nel file di dati grezzi, ma solo ~ 10 minuti di linea di base sono stati utilizzati per l'analisi dei dati.
Dopo la risoluzione dell'iperemia e un flusso di globuli rossi stabile per 5 minuti, può iniziare la raccolta dei dati basali di 10 minuti. La linea di base è rappresentata come una linea di flusso orizzontale dei globuli rossi relativamente stabile, in cui qualsiasi causa di deviazione (ad esempio, artefatti di movimento, regolazioni della sonda) deve essere registrata come commenti del software di acquisizione dati a scopo di analisi. Il protocollo dose-risposta segue il periodo basale e le siringhe devono essere cambiate ad ogni dose, da 10−10 M a 10−1 M ACh. Prima di iniziare la perfusione di 5-10 minuti di ogni dose, è necessario assicurarsi che l'agente farmacologico abbia completamente perfuso per tutta la lunghezza della fibra. Nel software di acquisizione dati, ci sarà un aumento iniziale del flusso di globuli rossi a causa della perfusione, ma questo non è incluso nelle analisi, poiché la raccolta dei dati di 5 minuti per quella concentrazione non è iniziata. Una volta iniziata la perfusione per ogni dose, ci sarà un aumento continuo del flusso di globuli rossi fino a un picco, seguito da un calo costante. Questa risposta curvilinea agli agenti farmacologici sarà replicata in tutto il protocollo, ma il flusso di globuli rossi sarà relativamente maggiore con l'aumentare delle concentrazioni di ACh. Con concentrazioni più basse di ACh, la risposta curvilinea potrebbe non essere così prominente. Esempi di flusso di globuli rossi non ottimali includono quanto segue: 1) una risposta non curvilinea, in cui il flusso di globuli rossi non aumenta e rimane stabilizzato, o 2) concentrazioni crescenti di ACh che hanno un impatto minimo sul flusso di globuli rossi, in cui il flusso di globuli rossi non aumenta relativamente con ogni concentrazione di ACh. Ciò dipende dalla domanda di ricerca e dalla coorte clinica testata.
Dopo la concentrazione finale di ACh, la Ringer lattata viene perfusa e i riscaldatori locali vengono aumentati a 43 °C. Durante questa fase, è necessario ottenere un plateau prima che il nitroprussiato di sodio venga perfuso. Questa operazione può richiedere fino a ~45 minuti, a seconda degli agenti precedentemente perfusi. Questa fase non è inclusa nelle analisi. Una volta ottenuto il plateau per 5 minuti, il nitroprussiato di sodio viene perfuso per produrre la massima vasodilatazione locale. Questa vasodilatazione locale massima è rappresentata come un aumento del flusso di globuli rossi, in cui si ottiene un plateau dopo ~ 20 minuti di perfusione, o dal flusso di globuli rossi che raggiunge un picco e diminuisce subito dopo. Una volta ottenuto un plateau o una diminuzione del flusso di globuli rossi per il nitroprussiato di sodio, il protocollo è completo. Un esempio comune di flusso di globuli rossi non ottimale è il valore più alto del flusso di globuli rossi ottenuto in una fase diversa del protocollo (ad esempio, durante il protocollo dose-risposta) piuttosto che durante la vasodilatazione locale massima.
Protocollo dose-risposta dell'acetilcolina: inibizione dell'ossido nitrico sintasi
Per quantificare il contributo dell'NO al flusso sanguigno cutaneo in risposta all'ACh, l'estere metilico di N G-nitro-l-arginina (L-NAME), un inibitore dell'NO sintasi, viene perfuso in combinazione con l'ACh attraverso una fibra aggiuntiva. La Figura 2A illustra uno schema che descrive in dettaglio il protocollo dose-risposta dell'ACh con L-NAME. La Figura 2B illustra i tracciati rappresentativi del flusso di globuli rossi (medie di 30 s) dal protocollo dose-risposta standardizzato ACh per un soggetto nel tempo con L-NAME. La Figura 2C illustra un file di dati grezzi di un protocollo dose-risposta ACh con L-NAME. Ulteriori misurazioni di base sono state mantenute nel file di dati grezzi, ma solo ~ 10 minuti di linea di base sono stati utilizzati per l'analisi dei dati.
Dopo la risoluzione dell'iperemia, un flusso di globuli rossi stabile per 5 minuti e un tempo adeguato per bloccare completamente la via enzimatica di interesse (ad esempio, NO sintasi) e/o fornire concentrazioni adeguate di cofattori, possono iniziare i 10 minuti di raccolta dei dati basali (raffigurati come una linea orizzontale relativamente stabile). Il protocollo dose-risposta segue il basale e le siringhe devono essere cambiate ad ogni dose a partire da 1010 M a 101 M ACh con l'inibitore della NO sintasi (ad esempio, 15 mM L-NAME). In presenza di un inibitore della NO sintasi, la risposta curvilinea non è ben replicata fino a concentrazioni più elevate di ACh. Si osserverà un flusso di globuli rossi relativamente più basso, rispetto a un sito senza inibizione della NO sintasi. Un esempio comune di flusso di globuli rossi non ottimale è l'inibizione della NO sintasi, rispetto alle condizioni senza inibizione della NO sintasi, con conseguente aumento del flusso di globuli rossi. Ciò indica che il protocollo non è riuscito.
Dopo la perfusione della concentrazione finale di ACh, la Ringer lattata viene perfusa e i riscaldatori locali vengono aumentati a 43 °C. Durante questa fase, è necessario ottenere un plateau prima che il nitroprussiato di sodio venga perfuso. Questa fase non è inclusa nelle analisi. Una volta ottenuto il plateau per 5 minuti, il nitroprussiato di sodio viene perfuso, producendo la massima vasodilatazione locale. Durante la vasodilatazione locale massimale, ci sarà un aumento esponenziale del flusso di globuli rossi a causa della precedente inibizione della NO sintasi. Un plateau si otterrà dopo ~20 minuti di perfusione, oppure il flusso di globuli rossi raggiungerà il suo picco assoluto e diminuirà subito dopo. Una volta ottenuto un plateau o una diminuzione del flusso di globuli rossi per il nitroprussiato di sodio, il protocollo è completo. Un esempio comune di flusso di globuli rossi non ottimale è l'ottenimento del valore di flusso di globuli rossi più alto in una fase diversa del protocollo (ad esempio, durante il protocollo dose-risposta) piuttosto che durante la vasodilatazione locale massima.
Protocollo di riscaldamento locale
La Figura 3A illustra uno schema che descrive in dettaglio il protocollo di riscaldamento locale. La Figura 3B illustra i tracciati rappresentativi del flusso di globuli rossi (medie di 30 s) per il protocollo di riscaldamento locale standardizzato per un soggetto nel tempo. La Figura 3C illustra un file di dati grezzi di un protocollo di riscaldamento locale. Dopo la risoluzione dell'iperemia e un flusso di globuli rossi stabile per 5 minuti, possono iniziare i 10 minuti di raccolta dei dati basali (raffigurati come una linea orizzontale relativamente stabile). I riscaldatori locali sono impostati a 39 °C o 42 °C e si verificherà una risposta iniziale di picco e nadir nel flusso di globuli rossi. Per quantificare il contributo di NO al flusso sanguigno cutaneo in risposta a uno stimolo termico locale, L-NAME viene perfuso dopo che è stato raggiunto un plateau stabile nel flusso dei globuli rossi. Ci sarà un rapido declino del flusso di globuli rossi fino a raggiungere un nuovo plateau in risposta a L-NAME. Dopo 5 minuti di valori stabili di flusso dei globuli rossi, la Ringer lattata viene perfusa e i riscaldatori locali vengono aumentati a 43 °C. Il riscaldamento produrrà un'ulteriore risposta di picco e nadir nel flusso dei globuli rossi. Durante questa fase, è necessario assicurarsi che sia stato ottenuto un plateau prima che il nitroprussiato di sodio venga perfuso. Questa fase non è inclusa nelle analisi. Per indurre la vasodilatazione massima locale, il nitroprussiato di sodio viene perfuso e si verificherà un rapido aumento del flusso di globuli rossi. Una volta osservato un plateau o un calo del flusso di globuli rossi in risposta al nitroprussiato di sodio, il protocollo è completo.
Figura 1: Protocollo dose-risposta dell'acetilcolina (ACh). (A) Schema di un protocollo dose-risposta dell'ACh. (B) Tracciamento rappresentativo (medie di 30 s) di un protocollo dose-risposta di ACh. (C) Dati grezzi di un protocollo dose-risposta ACh. Ulteriori misurazioni di base sono mantenute nel file di dati grezzi per dimostrare le fluttuazioni prima della stabilizzazione, ma solo ~ 10 minuti di dati a riposo stabili sono stati utilizzati per l'analisi dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Protocollo dose-risposta dell'ACh con inibizione dell'ossido nitrico (NO) sintasi. (A) Schema di un protocollo dose-risposta dell'ACh con inibizione dell'NO sintasi. (B) Tracciamento rappresentativo di un protocollo dose-risposta di ACh con inibizione della NO sintasi. (C) Dati grezzi di un protocollo dose-risposta ACh con inibizione della NO sintasi. Ulteriori misurazioni di base sono mantenute nel file di dati grezzi per dimostrare le fluttuazioni prima della stabilizzazione, ma solo ~ 10 minuti di dati a riposo stabili sono stati utilizzati per l'analisi dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Protocollo di riscaldamento locale. (A) Schema di un protocollo di riscaldamento locale. (B) Tracciamento rappresentativo di un protocollo di riscaldamento locale. (C) Dati grezzi di un protocollo di riscaldamento locale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La tecnica di microdialisi intradermica è uno strumento versatile nella ricerca vascolare umana. Gli investigatori possono modificare il protocollo per diversificarne ulteriormente le applicazioni. Ad esempio, descriviamo un protocollo dose-risposta ACh, ma altre indagini sui meccanismi di vasocostrizione o tono vasomotorio, piuttosto che sulla sola vasodilatazione, hanno utilizzato approcci dose-risposta alla noradrenalina o al nitroprussiato di sodio 26,27,28,29,30,31. Altri mediatori della vasodilatazione, come il mentolo o il cloruro di metacloro, sono stati impiegati anche nel protocollo dose-risposta31,32. Il protocollo dose-risposta come valutazione farmacologica della funzione vascolare è una tecnica più mirata e meccanicistica per isolare specifici meccanismi di segnalazione rispetto al protocollo di riscaldamento locale, in quanto rimuove le variazioni nella risposta simpatica agli stimoli termici. Tuttavia, il riscaldamento locale è un approccio economicamente vantaggioso che utilizza uno stimolo fisiologico per indurre la vasodilatazione attraverso meccanismi neurogeni e dipendenti dall'endotelio. È anche importante considerare il meccanismo di interesse quando si sceglie tra un protocollo di riscaldamento locale a 39 °C o 42 °C. Il protocollo a 39 °C è stato suggerito per isolare meglio la vasodilatazione mediata da NO, mentre il protocollo a 42 °C consente di studiare sia la vasodilatazione mediata da NO che la vasodilatazione mediata da fattori iperpolarizzanti di derivazione endoteliale33,34. Inoltre, l'aumento del CVC in risposta al riscaldamento locale di 42 °C tende ad essere più robusto (cioè, raggiungendo un % CVCmax34 più elevato). Tuttavia, quando si utilizza un nuovo agente per interrogare una specifica via di segnalazione, è necessario impiegare metodi rigorosi per valutare l'efficacia (cioè bloccare completamente) e/o saturare le concentrazioni dei cofattori.
La funzione endoteliale viene spesso misurata utilizzando la tecnica della dilatazione flusso-mediata, ma la disfunzione endoteliale nei letti microvascolari può verificarsi prima o indipendentemente dalla disfunzione endoteliale nelle grandi arterie del condotto, specialmente in patologie come HTN 6,7,8. Inoltre, la tecnica di dilatazione flusso-mediata non consente la dissezione farmacologica della fisiopatologia della disfunzione endoteliale isolata dagli effetti sistemici. Altri metodi per studiare la funzione endoteliale microvascolare, come la ionoforesi o l'iperemia reattiva post-occlusiva, non sono in grado di mirare con precisione ai meccanismi della funzione endoteliale con l'intervento farmacologico12. Pertanto, la microdialisi intradermica consente in modo univoco indagini mirate sui meccanismi della funzione vascolare e il suo utilizzo, insieme agli esiti di dilatazione mediati dal flusso, può fornire un quadro più olistico della funzione vascolare sistemica.
Qualunque sia l'approccio di microdialisi intradermica utilizzato, è necessario prendere alcune precauzioni per garantire la validità e la riproducibilità delle risposte. Mentre le specifiche del protocollo sperimentale possono essere adattate per rispondere a domande di ricerca specifiche, il posizionamento preciso della sonda di microdialisi è assolutamente fondamentale. Bisogna fare attenzione a inserire la sonda nel derma e ad evitare i vasi sanguigni visibili o palpabili più grandi della pelle. La perforazione di questi vasi risulterà in valori di unità di perfusione anormalmente bassi; in questo caso, la flussimetria laser Doppler misurerà la formazione di un ematoma piuttosto che il flusso di globuli rossi attraverso un vaso intatto. Successivamente, il prossimo passo più critico di questo protocollo è la risoluzione della risposta iperemica alla puntura dell'ago. Se la risposta iperemica non può attenuarsi completamente, le unità di perfusione registrate durante il basale e le prime porzioni del protocollo saranno maggiori dei valori reali a riposo. Se è stato concesso un tempo di recupero sufficiente ma le unità di perfusione rimangono anormalmente elevate, può essere necessaria una ricalibrazione delle sonde prima di iniziare la fase di raccolta dei dati di base.
Un limite della tecnica di microdialisi intradermica è che non può isolare in modo specifico un tipo di tessuto per valutare le vie di segnalazione vascolare. Poiché i vasi della pelle non possono essere sezionati e visualizzati in vivo, non c'è modo di garantire che la porzione semipermeabile di una sonda per microdialisi sia immediatamente adiacente al tessuto di interesse (ad esempio, l'endotelio vascolare). Pertanto, i risultati ottenuti da questa tecnica sono rappresentativi della natura integrativa della fisiologia umana e forniscono informazioni sulla funzione collettiva della muscolatura liscia endoteliale, vascolare e sulle influenze neurali sul flusso sanguigno locale. Tuttavia, se si utilizza un protocollo di riscaldamento locale, consentire al flusso di globuli rossi di raggiungere un plateau all'aumento iniziale del calore a 39 °C o 42 °C consente la risoluzione del riflesso assonale al calore, che quindi consente una risposta mediata principalmente dall'endotelio, come discusso altrove35. Un'ulteriore limitazione di questa tecnica è l'uso della flussimetria laser Doppler come indice del flusso sanguigno cutaneo. La flussimetria laser Doppler quantifica il flusso di globuli rossi, che non tiene conto delle variazioni del diametro del vaso (cioè la dilatazione della microvascolarizzazione), come sarebbe necessario per quantificare il flusso assoluto. Può essere sensibile alle differenze tra partecipanti o tra condizioni36. Le future applicazioni della microdialisi intradermica possono incorporare tecniche per quantificare il flusso sanguigno microvascolare assoluto. Ad esempio, il recente sviluppo della tomografia a coerenza ottica consente di quantificare il diametro del vaso utilizzando l'imaging tridimensionale della microvascolarizzazione cutanea13. La tecnica di microdialisi intradermica è controindicata in pochissimi ma importanti casi, che includono, ma non sono limitati a, partecipanti con malattie della pelle, partecipanti con allergie correlate alle sostanze qui descritte, partecipanti con tripanofobia grave e partecipanti con tatuaggi che coprono l'intero aspetto ventrale dell'avambraccio (ma piccoli tatuaggi in quest'area non sono escludenti).
La capacità unica dell'approccio di microdialisi di aiutare a isolare e delineare i meccanismi fisiopatologici sottostanti lo rende vantaggioso per studiare l'eziologia variabile dell'HTN, tra le altre CVD. A seguito dell'ottimizzazione del protocollo, questa tecnica consente di valutare l'efficacia di nuovi trattamenti per le malattie cardiovascolari. Inoltre, la microdialisi intradermica fornisce un metodo per valutare gli effetti fuori bersaglio di terapie farmacologiche ipoteticamente non correlate, rendendola uno strumento molto prezioso per informare studi clinici su larga scala. Nel complesso, questa tecnica è una risorsa inestimabile nella ricerca microvascolare.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse e nulla da rivelare.
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
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