Summary
A microdiálise intradérmica é uma técnica minimamente invasiva utilizada para investigar a função microvascular na saúde e na doença. Tanto os protocolos dose-resposta quanto os de aquecimento local podem ser utilizados para explorar mecanismos de vasodilatação e vasoconstrição na circulação cutânea.
Abstract
A vasculatura cutânea é um tecido acessível que pode ser utilizado para avaliar a função microvascular em humanos. A microdiálise intradérmica é uma técnica minimamente invasiva utilizada para investigar mecanismos da musculatura lisa vascular e função endotelial na circulação cutânea. Essa técnica permite a dissecção farmacológica da fisiopatologia da disfunção endotelial microvascular indexada pela diminuição da vasodilatação mediada pelo óxido nítrico, um indicador de risco para o desenvolvimento de doença cardiovascular. Nessa técnica, uma sonda de microdiálise é colocada na camada dérmica da pele, e uma unidade de aquecimento local com uma sonda de fluxometria Doppler a laser é colocada sobre a sonda para medir o fluxo de hemácias. A temperatura local da pele é pinçada ou estimulada com aplicação direta de calor, e agentes farmacológicos são perfundidos através da sonda para estimular ou inibir vias de sinalização intracelular a fim de induzir vasodilatação ou vasoconstrição ou interrogar mecanismos de interesse (cofatores, antioxidantes, etc.). A condutância vascular cutânea é quantificada, e mecanismos de disfunção endotelial em estados patológicos podem ser delineados.
Introduction
A doença cardiovascular (DCV) é a principal causa de morte nos Estados Unidos1. A hipertensão arterial sistêmica (HA) é um fator de risco independente para acidente vascular cerebral, doença coronariana e insuficiência cardíaca e estima-se que afete mais de ~50% da população dos Estados Unidos2. A HA pode se desenvolver como uma DCV independente (HA primária) ou como resultado de outra condição, como doença renal policística e/ou distúrbios endócrinos (HAS secundárias). A amplitude das etiologias da HA dificulta as investigações sobre os mecanismos subjacentes e danos aos órgãos-alvo observados com a HA. Diversas e novas abordagens de pesquisa sobre a fisiopatologia da lesão de órgão-alvo associada à HA são necessárias.
Um dos sinais patológicos mais precoces da DCV é a disfunção endotelial, caracterizada por vasodilatação mediada pelo óxido nítrico (NO) 3,4,5. A dilatação mediada por fluxo é uma abordagem comum usada para quantificar a disfunção endotelial associada à DCV, mas a disfunção endotelial em leitos microvasculares pode ser independente e precursora da das grandes artérias condutos6,7,8. Além disso, as arteríolas de resistência são mais diretamente atuadas pelo tecido local do que as artérias condutas e têm controle mais imediato sobre a entrega de sangue rico em oxigênio. A função microvascular é preditora de sobrevida livre de eventos cardiovasculares adversos 9,10,11. A microvasculatura cutânea é um leito vascular acessível que pode ser utilizado para examinar respostas fisiológicas e farmacológicas a estímulos vasoconstritores ou vasodilatadores. A microdiálise intradérmica é uma técnica minimamente invasiva, cujo objetivo é investigar os mecanismos da função da musculatura lisa vascular e endotelial na microvasculatura cutânea com dissecção farmacológica direcionada. Esse método contrasta com outras técnicas, como a hiperemia reativa pós-oclusiva, que não permite a dissecção farmacológica, e a iontoforese, que permite a administração farmacológica, mas é menos precisa em seu mecanismo de ação (revisada detalhadamente em outro artigo12).
A lógica por trás do desenvolvimento e uso dessa técnica é extensivamente revisada em outra publicação13. Esta abordagem foi originalmente desenvolvida para uso em pesquisa neurológica em roedores e, em seguida, foi primeiramente aplicada em humanos para investigar os mecanismos subjacentes à vasodilatação ativa de um ponto de vista termorregulatório. No final da década de 1990, esse método foi utilizado para examinar mecanismos neurais e endoteliais em relação ao aquecimento local da pele. Desde então, a técnica tem sido utilizada para investigar uma série de mecanismos de sinalização neurovascular na pele.
Usando essa técnica, nosso grupo e outros têm questionado os mecanismos de disfunção endotelial na microvasculatura de várias populações clínicas, incluindo, mas não se limitando a, dislipidemia, envelhecimento primário, diabetes, doença renal crônica, síndrome dos ovários policísticos, pré-eclâmpsia, transtorno depressivo maior 14,15,16,17,18,19 e hipertensão arterial 20,21,22,23,24. Por exemplo, um estudo anterior verificou que mulheres normotensas com história de pré-eclâmpsia, que apresentam risco aumentado para DCV, apresentaram redução da vasodilatação mediada pelo NO na circulação cutânea em comparação com mulheres com história de gravidez normotensa20. Em outro estudo, adultos com diagnóstico de hipertensão primária demonstraram aumento da sensibilidade à angiotensina II na microvasculatura em comparação com controles saudáveis21, e a farmacoterapia anti-hipertensiva crônica doadora de sulfidrila em pacientes com hipertensão primária demonstrou diminuir a pressão arterial e melhorar a vasodilatação mediada por sulfeto de hidrogênio e NO22. Wong e cols.23 encontraram vasodilatação prejudicada mediada por sensorios e NO em adultos pré-hipertensos, coincidindo com nosso achado de progressão da disfunção endotelial com o aumento dos estágios de HA, conforme categorizado pelas diretrizes de 2017 da American Heart Association e do American College of Cardiology24.
A técnica de microdiálise intradérmica permite investigações mecanicistas rigorosamente controladas da função microvascular em estados de saúde e doença. Portanto, este trabalho tem como objetivo descrever a técnica de microdiálise intradérmica aplicada por nosso grupo e outros. Detalhamos os procedimentos de estimulação farmacológica do endotélio com acetilcolina (ACh) para examinar a relação dose-resposta e a estimulação fisiológica da produção endógena de NO com um protocolo de estímulo de aquecimento local de 39 °C ou 42 °C. Apresentamos resultados representativos para cada abordagem e discutimos as implicações clínicas dos achados decorrentes dessa técnica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos são aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade Estadual da Pensilvânia antes do recrutamento dos participantes.
1. Configuração do equipamento
- Ligue a unidade de aquecimento local e o medidor de vazão laser Doppler.
NOTA: Ambos devem ser calibrados antes da coleta de dados de acordo com as instruções do fabricante. O medidor de vazão laser Doppler deve ser conectado ao hardware de aquisição de dados com amostragem em 100 Hz (100 amostras/min) e registro contínuo em um software de aquisição de dados. Enquanto outros hardwares e softwares de aquisição de dados podem ser usados, para simplificar, as instruções restantes refletem os recursos de hardware e software do LabChart do PowerLab. - Abra um arquivo de software LabChart.
NOTA: Um arquivo de referência com a entrada de dados desejada e recursos de coleta contínua de dados deve ser feito com antecedência. Deve haver um painel para cada laser Doppler e aquecedor local que corresponda a cada local de microdiálise, e os painéis devem corresponder às entradas de canal apropriadas na unidade de hardware de aquisição de dados.
2. Colocação de fibras de microdiálise
- Identificar os grandes vasos sanguíneos visíveis da pele na face ventral do antebraço e indicá-los com um marcador permanente (utilizar um torniquete para visualizar os vasos, se necessário; identificar vasos na pele pigmentada escura pode exigir maior confiança na palpação).
- Esfregue a área que engloba as marcas e uma porção generosa da área circundante usando cotonetes betadina. Limpe a betadina com compressas com álcool. Cubra a área esterilizada da pele com um campo estéril e aplique gelo por ~5 min para anestesiar a área.
- Retire o gelo e insira uma agulha introdutora (23 G, 25 mm de comprimento), chanfrada virada para cima, na camada dérmica da pele a uma profundidade de 2-3 mm (dependendo da espessura individual da pele). Avançar a agulha, tomando o cuidado de permanecer na camada dérmica, e sair da pele a ~20 mm do ponto de inserção.
NOTA: Para confirmar a profundidade adequada de colocação na pele, a forma da agulha deve ser visível e facilmente palpável, mas a cor da agulha deve ser ocultada. Se mais de uma sonda de microdiálise for necessária para o experimento, quaisquer duas agulhas introdutoras precisarão ser colocadas ≥2,5 cm de distância e posicionadas antes da inserção da sonda de microdiálise. As sondas não devem ser colocadas ao longo do mesmo vaso principal. - Deixando a agulha no lugar, conecte a sonda (através da trava Luer) a uma seringa contendo solução de Ringer com lactato. Alimentar a extremidade oposta da sonda através da agulha introdutora até que a membrana semipermeável da sonda esteja próxima, mas ainda fora da abertura da agulha introdutora. Perfundir lentamente uma pequena quantidade de solução de Ringer através da fibra até que a solução seja visivelmente perfundida através dos poros da membrana para confirmar a integridade da membrana.
- Se estiver usando uma sonda de microdiálise da Harvard Bioscience e uma agulha introdutora, siga as etapas 2.5.1-2.5.2.
- Após a confirmação da função da sonda, alimente a sonda através da agulha introdutora até que a membrana esteja completamente contida na camada dérmica da pele dentro da agulha introdutora.
- Com o uso de um dedo, prenda a sonda no lugar proximal à agulha e retire a agulha na direção oposta à inserção. Colocar a porção externa da fibra na pele para evitar o deslocamento da membrana semipermeável durante o experimento.
- Se estiver usando uma sonda de microdiálise da Bioanalytical Systems e uma agulha introdutora, siga as etapas 2.6.1-2.6.2.
- Após a confirmação da função da sonda, segure o cubo da agulha introdutora e a porção distal da sonda de microdiálise em uma das mãos e, simultaneamente, retire a agulha oposta à direção de inserção, movendo a sonda de microdiálise para o lugar.
- Ajuste a sonda conforme necessário para garantir que a membrana semipermeável esteja completamente enterrada na pele. Colocar a fibra externa na pele para evitar o deslocamento da membrana semipermeável durante o experimento.
3. Hiperemia
- Enquanto aguarda que a resposta hiperêmica à inserção da agulha diminua (~60-90 min), coloque a seringa de uso único na bandeja do suporte da seringa nas bombas de microinfusão. Perfundir solução de Ringer com lactato, soro fisiológico ou solução veículo (a solução na qual o agente farmacológico experimental é dissolvido; 2 μL/min) durante a fase de hiperemia.
NOTA: Enquanto as sondas de microdiálise não podem ser removidas durante esta fase de ~60-90 min, o participante pode ajustar sua posição corporal ou mover sua mão, ou a trava Luer da sonda pode ser removida da seringa e presa com fita adesiva ao braço do participante para permitir que ele fique em pé por um breve período. Uma vez instrumentadas com aquecedores locais e sondas de Doppler fluxometria a laser (LDF) e uma vez iniciada a coleta de dados, as sondas LDF não podem ser movidas. - Quando a vermelhidão da pele, que é um indicador da resposta hiperêmica ao trauma da agulha, tiver diminuído, conecte a unidade de aquecimento local à pele que cobre a membrana semipermeável através do disco adesivo da sonda, garantindo que o centro do aquecedor se alinhe com o caminho da sonda de microdiálise.
- Coloque a sonda LDF na abertura no centro do aquecedor local para que o laser fique diretamente perpendicular à superfície da pele. Uma vez que as sondas de LDF são colocadas e seguras, clique em iniciar no software de aquisição de dados para registrar e exibir continuamente os valores de fluxo de hemácias (fluxo de hemácias; unidades de perfusão, UP). Se a hiperemia tiver diminuído completamente, o fluxo de hemácias será estável em ~5-20 UP (a pulsatilidade dos vasos abaixo da sonda LDF pode ser refletida por pequenas elevações na UP que coincidem com os batimentos cardíacos).
- Coloque um manguito automático de pressão arterial no braço de um sujeito que não tenha sido instrumentado.
- Ajuste os aquecedores locais a 33 °C para fixar a temperatura da pele dentro de uma faixa termoneutra25, eliminando assim quaisquer variações na influência dos estímulos térmicos. Para adicionar um comentário à gravação contínua no software de aquisição de dados para indicar eventos no experimento, clique na caixa de texto no canto superior direito da tela, digite um comentário, selecione quais canais devem receber o comentário e clique em adicionar.
4. Protocolo dose-resposta à acetilcolina
- Uma vez que o fluxo de hemácias tenha se estabilizado em resposta ao calor local de 33 °C, inicie a coleta de dados basais, distinguida no arquivo de software de aquisição de dados por um comentário iniciar a linha de base. Pelo menos um mínimo de 5-10 min de linha de base estável é necessário para a análise dos dados; reinicie a linha de base a qualquer momento durante este ponto da coleta de dados, se necessário, e marque isso no arquivo LabChart. No último minuto da linha de base, colete uma medida de pressão arterial e insira os valores em um comentário no arquivo LabChart.
- Ao final dos 5-10 min de coleta de dados basais, meça e registre a pressão arterial basal e insira a linha de base final do comentário no software de aquisição de dados.
- Desligue as bombas de microinfusão e troque as seringas cheias de solução de Ringer com lactato pela seringa preenchida com a menor concentração de ACh (10−10 M).
- Fixe as novas seringas no lugar e confirme a perfusão do fluido através da extremidade da sonda antes de ligar novamente as bombas de microinfusão. Digite o comentário start −10 na gravação do software de aquisição de dados.
- Cada concentração de ACh será perfundida por 5-10 min a 2 μL/min. No minuto final de perfusão, para cada concentração, medir e registrar a pressão arterial. Uma vez terminado o tempo de perfusão para uma determinada concentração, substitua a seringa pela próxima concentração mais alta (por exemplo, a solução de ACh de 10−10 M é trocada por uma solução de ACh de 10−9 M), conforme descrito nas etapas 4.2-4.4.
- Imediatamente após a perfusão da concentração final de ACh (10−1 M), substitua a seringa de ACh por uma contendo solução de Ringer e aumente a temperatura do aquecedor local para 43 °C. Uma vez estabilizado o fluxo de hemácias, substitua a solução de Ringer por nitroprussiato de sódio (28 mM) para produzir vasodilatação local máxima induzida pelo calor e induzida farmacologicamente. Medir e registrar a pressão arterial a cada ~3 min durante esta fase de vasodilatação máxima.
- Uma vez que um platô máximo de fluxo de hemácias tenha ocorrido (~5 min de PU estável), finalize o experimento. Selecione parar no canto inferior direito do software de aquisição de dados para encerrar a coleta contínua de dados.
5. Protocolo de aquecimento local
- Uma vez estabilizado o fluxo eritrocitário após a hiperemia, inicie a coleta de dados basais e indique isso no arquivo do software de aquisição de dados com um comentário. No último minuto da linha de base, colete uma medida da pressão arterial e insira os valores em um comentário no arquivo do software de aquisição de dados.
- Aumente os aquecedores locais para 39 °C ou 42 °C, dependendo das necessidades do protocolo (explicado na seção de discussão).
- Uma vez que o fluxo de hemácias tenha estabilizado em resposta à aplicação de calor local (~40-60 min de aquecimento), perfundir N G-nitro-l-arginina metil éster (L-NAME; 15 mM dissolvido em solução de Ringer; 2 μL/min; um inibidor da sintase NO) através da(s) sonda(s) de microdiálise.
- Uma vez que o fluxo de hemácias tenha se estabilizado em resposta ao L-NAME (~15-25 min de perfusão), aumente os aquecedores locais para 43 °C.
- Uma vez que o fluxo de hemácias tenha se estabilizado em resposta a 43 °C (um platô de ~2-5 min ocorre após ~20-45 min de aquecimento), perfundir nitroprussiato de sódio (28 mM dissolvido em solução de Ringer) através da(s) sonda(s) de microdiálise.
- Uma vez que um platô máximo de fluxo de hemácias tenha ocorrido (~5 min de PU estável), finalize o experimento. Selecione parar no canto inferior direito do software de aquisição de dados para encerrar a coleta de dados.
6. Remoção das sondas de microdiálise
- Após o término do experimento, use uma tesoura cirúrgica para cortar as sondas de microdiálise. Remova cuidadosamente as sondas de LDF dos aquecedores e remova os aquecedores da pele. Remova suavemente a fita que mantém as sondas no lugar sobre a pele.
- Identifique visualmente qual local de punção em cada lado da sonda formou o menor coágulo sanguíneo. Corte a porção da sonda perto do local com o coágulo menor, deixando ~1 dentro da sonda fora da pele sem cortes.
- Limpe a parte da pele ao redor dos locais de entrada e saída da sonda com um cotonete de álcool, bem como o ~1 de comprimento da sonda deixado no local menos coagulado.
- Deixe o álcool secar na pele. Em seguida, segure a porção da sonda que se estende do local da punção com o coágulo maior, oposto ao ~1 na porção na extremidade menos coagulada. Puxe lentamente a sonda em direção ao coágulo sanguíneo maior.
- Coloque gaze estéril sobre qualquer sangramento resultante da remoção da sonda e aplique pressão.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protocolo dose-resposta à acetilcolina
A Figura 1A mostra um esquema detalhando o protocolo dose-resposta da ACh. A Figura 1B ilustra os traçados representativos dos valores de fluxo de hemácias (unidades de perfusão, UP; médias de 30 s) do protocolo padronizado de dose-resposta de ACh para um indivíduo ao longo do tempo. A Figura 1C ilustra um arquivo de dados brutos de um protocolo de dose-resposta da ACh. Medidas adicionais basais foram mantidas no arquivo de dados brutos, mas apenas ~10 min da linha de base foram utilizados para a análise dos dados.
Após a resolução da hiperemia e um fluxo estável de hemácias por 5 min, a coleta de dados basais de 10 min pode começar. A linha de base é descrita como uma linha de fluxo de hemácias horizontal relativamente estável, onde qualquer causa para desvios (por exemplo, artefatos de movimento, ajustes de sonda) deve ser registrada como comentários de software de aquisição de dados para fins de análise. O protocolo dose-resposta segue o período basal, e as seringas devem ser trocadas a cada dose, de 10−10 M a 10−1 M ACh. Antes de iniciar a perfusão de 5-10 min de cada dose, deve-se garantir que o agente farmacológico tenha perfundido completamente através do comprimento da fibra. No software de aquisição de dados, haverá um aumento inicial do fluxo de hemácias devido à perfusão, mas isso não é incluído nas análises, pois a coleta de dados de 5 min para essa concentração ainda não começou. Uma vez iniciada a perfusão para cada dose, haverá um aumento contínuo no fluxo de hemácias até um pico, seguido por um declínio constante. Essa resposta curvilínea aos agentes farmacológicos será replicada ao longo do protocolo, mas o fluxo de hemácias será relativamente maior com o aumento das concentrações de ACh. Com concentrações mais baixas de ACh, a resposta curvilínea pode não ser tão proeminente. Exemplos de fluxo não ótimo de hemácias incluem o seguinte: 1) uma resposta não curvilínea, onde o fluxo de hemácias não aumenta e permanece platô, ou 2) concentrações crescentes de ACh tendo um impacto mínimo sobre o fluxo de hemácias, onde o fluxo de hemácias não aumenta relativamente com cada concentração de ACh. Isso depende da pergunta de pesquisa e da coorte clínica que está sendo testada.
Após a concentração final de ACh, o Ringer com lactato é perfundido e os aquecedores locais são aumentados para 43 °C. Durante esta fase, um platô deve ser obtido antes que o nitroprussiato de sódio seja perfundido. Isso pode levar até ~45 min, dependendo dos agentes anteriores perfundidos. Esta fase não está incluída nas análises. Uma vez obtido o platô por 5 min, o nitroprussiato de sódio é perfundido para produzir vasodilatação local máxima. Essa vasodilatação local máxima é descrita como um aumento no fluxo de hemácias, onde um platô é obtido após ~20 min de perfusão, ou pelo fluxo de hemácias atingindo um pico e declinando imediatamente após. Uma vez obtido um platô ou um declínio no fluxo de hemácias para o nitroprussiato de sódio, o protocolo está completo. Um exemplo comum de fluxo não ótimo de hemácias é o maior valor de fluxo de hemácias sendo obtido em uma fase diferente do protocolo (por exemplo, durante o protocolo dose-resposta) em vez de durante a vasodilatação local máxima.
Protocolo dose-resposta à acetilcolina: inibição da óxido nítrico sintase
Para quantificar a contribuição do NO para o fluxo sanguíneo cutâneo em resposta à ACh, o N G-nitro-l-arginina metil éster (L-NAME), um inibidor da NO sintase, é perfundido em combinação com ACh através de uma fibra adicional. A Figura 2A mostra um esquema detalhando o protocolo dose-resposta da ACh com L-NAME. A Figura 2B ilustra traçados representativos do fluxo de hemácias (médias de 30 s) do protocolo padronizado de dose-resposta de ACh para um indivíduo ao longo do tempo com L-NAME. A Figura 2C ilustra um arquivo de dados brutos de um protocolo dose-resposta ACh com L-NAME. Medidas adicionais basais foram mantidas no arquivo de dados brutos, mas apenas ~10 min da linha de base foram utilizados para a análise dos dados.
Após a resolução da hiperemia, um fluxo de hemácias estável por 5 minutos e tempo adequado para bloquear completamente a via enzimática de interesse (por exemplo, NO sintase) e/ou fornecer concentrações adequadas de cofatores, os 10 minutos de coleta de dados basais podem começar (representados como uma linha horizontal relativamente estável). O protocolo dose-resposta segue a linha de base, e as seringas devem ser trocadas a cada dose começando de 1010 M a 10 M ACh com o inibidor da NO sintase (por exemplo, 15 mM L-NAME). Na presença de um inibidor da NO sintase, a resposta curvilínea não é bem replicada até concentrações mais elevadas de ACh. Um fluxo de hemácias relativamente menor, em comparação com um local sem inibição da NO sintase, será observado. Um exemplo comum de fluxo não ótimo de hemácias é a inibição da NO sintase, em comparação com as condições sem inibição da NO sintase, resultando em um maior fluxo de hemácias. Isso indica que o protocolo falhou.
Após a perfusão da concentração final de ACh, o Ringer com lactato é perfundido e os aquecedores locais são aumentados para 43 °C. Durante essa fase, um platô deve ser obtido antes que o nitroprussiato de sódio seja perfundido. Esta fase não está incluída nas análises. Uma vez obtido o platô por 5 min, perfunde-se nitroprussiato de sódio, produzindo vasodilatação local máxima. Durante a vasodilatação local máxima, haverá um aumento exponencial do fluxo de hemácias devido à inibição prévia da sintase do NO. Um platô será obtido após ~20 min de perfusão, ou o fluxo de hemácias atingirá seu pico absoluto e declinará imediatamente após. Uma vez obtido um platô ou um declínio no fluxo de hemácias para o nitroprussiato de sódio, o protocolo está completo. Um exemplo comum de fluxo não ótimo de hemácias é a obtenção do maior valor de fluxo de hemácias em uma fase diferente do protocolo (por exemplo, durante o protocolo dose-resposta) em vez de durante a vasodilatação local máxima.
Protocolo de aquecimento local
A Figura 3A mostra um esquema detalhando o protocolo de aquecimento local. A Figura 3B ilustra traçados representativos do fluxo de hemácias (médias de 30 s) para o protocolo padronizado de aquecimento local para um indivíduo ao longo do tempo. A Figura 3C ilustra um arquivo de dados brutos de um protocolo de aquecimento local. Após a resolução da hiperemia e um fluxo estável de hemácias por 5 minutos, os 10 minutos de coleta de dados basais podem começar (representados como uma linha horizontal relativamente estável). Os aquecedores locais são ajustados para 39 °C ou 42 °C, e um pico inicial e uma resposta nadir ocorrerão no fluxo de hemácias. Para quantificar a contribuição do NO para o fluxo sanguíneo cutâneo em resposta a um estímulo térmico local, o L-NAME é perfundido após um platô estável no fluxo de hemácias ter sido alcançado. Haverá um rápido declínio no fluxo de hemácias até que ele atinja um novo platô em resposta ao L-NAME. Após 5 min de valores estáveis de fluxo de hemácias, o Ringer com lactato é perfundido e os aquecedores locais são aumentados para 43 °C. O aquecimento produzirá um pico adicional e uma resposta nadir no fluxo de hemácias. Durante esta fase, deve-se garantir que um platô tenha sido obtido antes que o nitroprussiato de sódio seja perfundido. Esta fase não está incluída nas análises. Para induzir vasodilatação máxima local, o nitroprussiato de sódio é perfundido e um rápido aumento do fluxo de hemácias ocorrerá. Uma vez observado um platô ou um declínio no fluxo de hemácias em resposta ao nitroprussiato de sódio, o protocolo está completo.
Figura 1: Protocolo dose-resposta de acetilcolina (ACh). (A) Esquema de um protocolo dose-resposta de ACh. (B) Traçado representativo (médias de 30 s) de um protocolo dose-resposta à ACh. (C) Dados brutos de um protocolo dose-resposta de ACh. Medidas basais adicionais são mantidas no arquivo de dados brutos para demonstrar as flutuações antes da estabilização, mas apenas ~10 min de dados estáveis de repouso foram utilizados para a análise dos dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Protocolo dose-resposta de ACh com inibição da óxido nítrico (NO) sintase. (A) Esquema de um protocolo dose-resposta de ACh com inibição da NO sintase. (B) Traçado representativo de um protocolo dose-resposta de ACh com inibição da NO sintase. (C) Dados brutos de um protocolo dose-resposta de ACh com inibição da NO sintase. Medidas basais adicionais são mantidas no arquivo de dados brutos para demonstrar as flutuações antes da estabilização, mas apenas ~10 min de dados estáveis de repouso foram utilizados para a análise dos dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Protocolo de aquecimento local. (A) Esquema de um protocolo de aquecimento local. (B) Rastreamento representativo de um protocolo de aquecimento local. (C) Dados brutos de um protocolo de aquecimento local. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A técnica de microdiálise intradérmica é uma ferramenta versátil na pesquisa vascular humana. Os pesquisadores podem alterar o protocolo para diversificar ainda mais suas aplicações. Por exemplo, descrevemos um protocolo dose-resposta de ACh, mas outras investigações sobre os mecanismos de vasoconstrição ou tônus vasomotor, em vez de vasodilatação isolada, têm utilizado abordagens dose-resposta de noradrenalina ou nitroprussiato de sódio 26,27,28,29,30,31. Outros mediadores da vasodilatação, como mentol ou cloreto de metacloro, também têm sido empregados no protocolo dose-resposta31,32. O protocolo dose-resposta como avaliação farmacológica da função vascular é uma técnica mecanística mais direcionada para isolar mecanismos específicos de sinalização em comparação com o protocolo de aquecimento local, pois remove variações na resposta simpática a estímulos térmicos. No entanto, o aquecimento local é uma abordagem custo-efetiva que utiliza um estímulo fisiológico para induzir vasodilatação via mecanismos neurogênicos e dependentes do endotélio. Também é importante considerar o mecanismo de interesse ao escolher entre um protocolo de aquecimento local de 39 °C ou 42 °C. O protocolo de 39 °C tem sido sugerido para isolar melhor a vasodilatação mediada pelo NO, enquanto o protocolo de 42 °C permite a investigação tanto da vasodilatação mediada pelo NO quanto da vasodilatação mediada pelo fator hiperpolarizante derivado do endotélio33,34. Além disso, o aumento do CVC em resposta ao aquecimento local de 42 °C tende a ser mais robusto (ou seja, atingindo um %CVCmáximo34 maior). No entanto, ao utilizar um novo agente para interrogar uma via de sinalização específica, métodos rigorosos devem ser empregados para avaliar a eficácia (isto é, bloqueio total) e/ou concentrações saturadas dos cofatores.
A função endotelial é frequentemente medida pela técnica de dilatação mediada por fluxo, mas a disfunção endotelial em leitos microvasculares pode ocorrer antes ou independentemente da disfunção endotelial em grandes artérias condutoras, especialmente em patologias como a HAS6,7,8. Além disso, a técnica de dilatação mediada por fluxo não permite a dissecção farmacológica da fisiopatologia da disfunção endotelial isoladamente dos efeitos sistêmicos. Outros métodos para investigar a função endotelial microvascular, como a iontoforese ou a hiperemia reativa pós-oclusiva, são incapazes de visar com precisão os mecanismos da função endotelial com intervençãofarmacológica12. Portanto, a microdiálise intradérmica permite exclusivamente investigações direcionadas sobre os mecanismos da função vascular, e seu uso, juntamente com resultados de dilatação mediados por fluxo, pode fornecer uma imagem mais holística da função vascular sistêmica.
Qualquer que seja a abordagem de microdiálise intradérmica utilizada, alguns cuidados devem ser tomados para garantir a validade e a reprodutibilidade das respostas. Embora as especificidades do protocolo experimental possam ser ajustadas para responder a perguntas específicas de pesquisa, a colocação precisa da sonda de microdiálise é absolutamente crítica. Deve-se tomar cuidado para inserir a sonda na derme e evitar os vasos sanguíneos maiores visíveis ou palpáveis da pele. A punção desses vasos resultará em valores anormalmente baixos de unidade de perfusão; neste caso, a dopplerfluxometria a laser medirá a formação de um hematoma em vez do fluxo de hemácias através de um vaso intacto. Depois disso, o próximo passo mais crítico desse protocolo é a resolução da resposta hiperêmica à punção da agulha. Se a resposta hiperêmica não for permitida a regressão total, as unidades de perfusão registradas ao longo das porções basais e iniciais do protocolo serão maiores do que os valores reais de repouso. Se tiver sido permitido um tempo de recuperação suficiente, mas as unidades de perfusão permanecerem anormalmente altas, pode ser necessária uma recalibração das sondas antes de iniciar a fase de coleta de dados basais.
Uma limitação da técnica de microdiálise intradérmica é que ela não pode isolar especificamente um tipo de tecido para avaliar as vias de sinalização vascular. Como os vasos da pele não podem ser dissecados e visualizados in vivo, não há como garantir que a porção semipermeável de uma sonda de microdiálise seja imediatamente adjacente ao tecido de interesse (por exemplo, o endotélio vascular). Portanto, os resultados obtidos com essa técnica são representativos da natureza integrativa da fisiologia humana e fornecem informações sobre a função coletiva do endotélio, músculo liso vascular e influências neurais sobre o fluxo sanguíneo local. No entanto, se for utilizado um protocolo de aquecimento local, permitir que o fluxo de hemácias atinja um platô no aumento inicial do calor para 39 °C ou 42 °C permite a resolução do reflexo axonal para o calor, o que permite uma resposta primariamente mediada pelo endotélio, como discutido em outro artigo35. Uma limitação adicional dessa técnica é o uso da dopplerfluxometria a laser como índice do fluxo sanguíneo cutâneo. A dopplerfluxometria a laser quantifica o fluxo de hemácias, o que não leva em conta as alterações no diâmetro do vaso (isto é, dilatação da microvasculatura), como seria necessário para quantificar o fluxo absoluto. Pode ser sensível a diferenças entre participantes ou entre condições36. Aplicações futuras da microdiálise intradérmica podem incorporar técnicas para quantificar o fluxo sanguíneo microvascular absoluto. Por exemplo, o recente desenvolvimento da tomografia de coerência óptica permite quantificar o diâmetro do vaso por meio de imagens tridimensionais da microvasculatura dapele13. A técnica de microdiálise intradérmica é contraindicada em pouquíssimos, mas importantes casos, que incluem, mas não se limitam a, participantes com doenças de pele, participantes com alergias relacionadas às substâncias aqui descritas, participantes com tripanofobia grave e participantes com tatuagens cobrindo toda a face ventral do antebraço (mas pequenas tatuagens nessa área não são excludentes).
A capacidade única da abordagem de microdiálise em auxiliar no isolamento e delineamento dos mecanismos fisiopatológicos subjacentes torna-a vantajosa para a investigação da etiologia variável da HA, entre outras DCV. Após otimização de protocolo, essa técnica permite avaliar a eficácia de novos tratamentos para DCV. Além disso, a microdiálise intradérmica fornece um método para avaliar os efeitos fora do alvo de farmacoterapias hipoteticamente não relacionadas, tornando-se uma ferramenta altamente valiosa para informar ensaios clínicos em maior escala. Em conjunto, essa técnica é um ativo inestimável na pesquisa microvascular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse e nada a divulgar.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
References
- Xu, J. Q., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Arias, E.
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93 (2023).
- Cohuet, G., Struijker-Boudier, H. Mechanisms of target organ damage caused by hypertension: Therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 111 (1), 81-98 (2006).
- Park, K. H., Park, W. J. Endothelial dysfunction: Clinical implications in cardiovascular disease and therapeutic approaches. Journal of Korean Medical Science. 30 (9), 1213-1225 (2015).
- Levy, B. I., Ambrosio, G., Pries, A. R., Struijker-Boudier, H. A. Microcirculation in hypertension: a new target for treatment. Circulation. 104 (6), 735-740 (2001).
- Sara, J. D., et al. Prevalence of coronary microvascular dysfunction among patients with chest pain and nonobstructive coronary artery disease. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Interventions. 8 (11), 1445-1453 (2015).
- Weis, M., Hartmann, A., Olbrich, H. G., Hör, G., Zeiher, A. M. Prognostic significance of coronary flow reserve on left ventricular ejection fraction in cardiac transplant recipients. Transplantation. 65 (1), 103-108 (1998).
- Rossi, M., et al. Investigation of skin vasoreactivity and blood flow oscillations in hypertensive patients: Effect of short-term antihypertensive treatment. Journal of Hypertension. 29 (8), 1569-1576 (2011).
- Pepine, C. J., et al. Coronary microvascular reactivity to adenosine predicts adverse outcome in women evaluated for suspected ischemia results from the National Heart, Lung and Blood Institute WISE (Women's Ischemia Syndrome Evaluation) study. Journal of the American College of Cardiology. 55 (25), 2825-2832 (2010).
- Matsuda, J., et al. Prevalence and clinical significance of discordant changes in fractional and coronary flow reserve after elective percutaneous coronary intervention. Journal of the American Heart Association. 5 (12), e004400 (2016).
- Gupta, A., et al. Integrated noninvasive physiological assessment of coronary circulatory function and impact on cardiovascular mortality in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 136 (24), 2325-2336 (2017).
- Roustit, M., Cracowski, J. L. Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 373-384 (2013).
- Low, D. A., Jones, H., Cable, N. T., Alexander, L. M., Kenney, W. L. Historical reviews of the assessment of human cardiovascular function: interrogation and understanding of the control of skin blood flow. European Journal of Applied Physiology. 120 (1), 1-16 (2020).
- Kenney, W. L., Cannon, J. G., Alexander, L. M. Cutaneous microvascular dysfunction correlates with serum LDL and sLOX-1 receptor concentrations. Microvascular Research. 85, 112-117 (2013).
- Holowatz, L. A., Thompson, C. S., Minson, C. T., Kenney, W. L. Mechanisms of acetylcholine-mediated vasodilatation in young and aged human skin. Journal of Physiology. 563, 965-973 (2005).
- Sokolnicki, L. A., Roberts, S. K., Wilkins, B. W., Basu, A., Charkoudian, N. Contribution of nitric oxide to cutaneous microvascular dilation in individuals with type 2 diabetes mellitus. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 292 (1), E314-E318 (2007).
- DuPont, J. J., Ramick, M. G., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species contribute to impaired cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 306 (12), F1499-F1506 (2014).
- Sprung, V. S., et al. Nitric oxide-mediated cutaneous microvascular function is impaired in polycystic ovary syndrome but can be improved by exercise training. Journal of Physiology. 591 (6), 1475-1487 (2013).
- Greaney, J. L., Saunders, E. F. H., Santhanam, L., Alexander, L. M. Oxidative stress contributes to microvascular endothelial dysfunction in men and women with major depressive disorder. Circulatory Research. 124 (4), 564-574 (2019).
- Stanhewicz, A. E., Jandu, S., Santhanam, L., Alexander, L. M. Increased angiotensin II sensitivity contributes to microvascular dysfunction in women who have had preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 382-389 (2017).
- Greaney, J. L., et al. Impaired hydrogen sulfide-mediated vasodilation contributes to microvascular endothelial dysfunction in hypertensive adults. Hypertension. 69 (5), 902-909 (2017).
- Dillon, G. A., Stanhewicz, A. E., Serviente, C., Greaney, J. L., Alexander, L. M. Hydrogen sulfide-dependent microvascular vasodilation is improved following chronic sulfhydryl-donating antihypertensive pharmacotherapy in adults with hypertension. Journal of Physiology. 321 (4), H728-H734 (2021).
- Wong, B. J., et al. Sensory nerve-mediated and nitric oxide-dependent cutaneous vasodilation in normotensive and prehypertensive non-Hispanic blacks and whites. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (2), H271-H281 (2020).
- Dillon, G. A., Greaney, J. L., Shank, S., Leuenberger, U. A., Alexander, L. M. AHA/ACC-defined stage 1 hypertensive adults do not display cutaneous microvascular endothelial dysfunction. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (3), H539-H546 (2020).
- Gagge, A. P., Stolwijk, J. A., Hardy, J. D. Comfort and thermal sensations and associated physiological responses at various ambient temperatures. Environmental Research. 1 (1), 1-20 (1967).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Lack of limb or sex differences in the cutaneous vascular responses to exogenous norepinephrine. Journal of Applied Physiology. 117 (12), 1417-1423 (2014).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Impaired increases in skin sympathetic nerve activity contribute to age-related decrements in reflex cutaneous vasoconstriction. Journal of Physiology. 593 (9), 2199-2211 (2015).
- Alba, B. K., Greaney, J. L., Ferguson, S. B., Alexander, L. M. Endothelial function is impaired in the cutaneous microcirculation of adults with psoriasis through reductions in nitric oxide-dependent vasodilation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (2), H343-H349 (2018).
- Greaney, J. L., Surachman, A., Saunders, E. F. H., Alexander, L. M., Almeida, D. M. Greater daily psychosocial stress exposure is associated with increased norepinephrine-induced vasoconstriction in young adults. Journal of the American Heart Association. 9 (9), e015697 (2020).
- Nakata, T., et al. Quantification of catecholamine neurotransmitters released from cutaneous vasoconstrictor nerve endings in men with cervical spinal cord injury. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (3), R345-R352 (2023).
- Tucker, M. A., et al. Postsynaptic cutaneous vasodilation and sweating: Influence of adiposity and hydration status. European Journal of Applied Physiology. 118 (8), 1703-1713 (2018).
- Craighead, D. H., Alexander, L. M. Menthol-induced cutaneous vasodilation is preserved in essential hypertensive men and women. American Journal of Hypertension. 30 (12), 1156-1162 (2017).
- Brunt, V. E., Minson, C. T. KCa channels and epoxyeicosatrienoic acids: Major contributors to thermal hyperaemia in human skin. Journal of Physiology. 590 (15), 3523-3534 (2012).
- Choi, P. J., Brunt, V. E., Fujii, N., Minson, C. T. New approach to measure cutaneous microvascular function: An improved test of NO-mediated vasodilation by thermal hyperemia. Journal of Applied Physiology. 117 (3), 277-283 (2014).
- Johnson, J. M., Kellogg, D. L. Jr Local thermal control of the human cutaneous circulation. Journal of Applied Physiology. 109 (4), 1229-1238 (2010).
- Jung, F., et al. Laser Doppler flux measurement for the assessment of cutaneous microcirculation-Critical remarks. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 55 (4), 411-416 (2013).
