Summary
Intradermal mikrodialys är en minimalinvasiv teknik som används för att undersöka mikrovaskulär funktion vid hälsa och sjukdom. Både dos-respons och lokala uppvärmningsprotokoll kan användas för denna teknik för att utforska mekanismer för vasodilatation och vasokonstriktion i den kutana cirkulationen.
Abstract
Den kutana vaskulaturen är en tillgänglig vävnad som kan användas för att bedöma mikrovaskulär funktion hos människor. Intradermal mikrodialys är en minimalinvasiv teknik som används för att undersöka mekanismer för vaskulär glatt muskulatur och endotelfunktion i den kutana cirkulationen. Denna teknik möjliggör farmakologisk dissektion av patofysiologin för mikrovaskulär endotelial dysfunktion som indexeras av minskad kväveoxidmedierad vasodilatation, en indikator på risk för utveckling av kardiovaskulär sjukdom. I denna teknik placeras en mikrodialyssond i hudens dermala lager och en lokal värmeenhet med en laserdopplerflödessond placeras över sonden för att mäta flödet av röda blodkroppar. Den lokala hudtemperaturen kläms fast eller stimuleras med direkt värmeapplicering, och farmakologiska medel perfunderas genom sonden för att stimulera eller hämma intracellulära signalvägar för att inducera vasodilatation eller vasokonstriktion eller för att undersöka mekanismer av intresse (co-faktorer, antioxidanter, etc.). Den kutana vaskulära konduktansen kvantifieras och mekanismer för endotelial dysfunktion i sjukdomstillstånd kan avgränsas.
Introduction
Kardiovaskulär sjukdom (CVD) är den vanligaste dödsorsaken i USA1. Hypertoni (HTN) är en oberoende riskfaktor för stroke, kranskärlssjukdom och hjärtsvikt och beräknas drabba upp till ~50 % av USA:s befolkning2. HTN kan utvecklas som en oberoende kardiovaskulär sjukdom (primär HTN) eller som ett resultat av ett annat tillstånd, t.ex. polycystisk njursjukdom och/eller endokrina störningar (sekundär HTN). Bredden av etiologier för HTN komplicerar undersökningar av de underliggande mekanismerna och skador på slutorganen som observerats med HTN. Det behövs mångsidiga och nya forskningsmetoder för patofysiologin hos de skador på slutorganen som är förknippade med HTN.
Ett av de tidigaste patologiska tecknen på CVD är endoteldysfunktion, som kännetecknas av nedsatt kväveoxid (NO)-medierad vasodilatation 3,4,5. Flödesmedierad dilatation är ett vanligt tillvägagångssätt som används för att kvantifiera endoteldysfunktionen i samband med CVD, men endoteldysfunktion i mikrovaskulära bäddar kan vara både oberoende av och föregångare till den hos stora ledningsartärer 6,7,8. Dessutom påverkas resistensarterioler mer direkt av lokal vävnad än ledningsartärer och har mer omedelbar kontroll över leveransen av syrerikt blod. Mikrovaskulär funktion är prediktiv för överlevnad utan kardiovaskulära händelser 9,10,11. Den kutana mikrovaskulaturen är en tillgänglig kärlbädd som kan användas för att undersöka svar på fysiologiska och farmakologiska vasokonstriktiva eller vasodilaterande stimuli. Intradermal mikrodialys är en minimalinvasiv teknik, vars mål är att undersöka mekanismerna för både vaskulär glatt muskulatur och endotelfunktion i den kutana mikrovaskulaturen med riktad farmakologisk dissektion. Denna metod står i kontrast till andra tekniker, såsom postocklusiv reaktiv hyperemi, som inte tillåter farmakologisk dissektion, och jontofores, som möjliggör farmakologisk tillförsel men är mindre exakt i sin verkningsmekanism (granskad noggrant på annat håll12).
Logiken bakom utvecklingen och användningen av denna teknik granskas utförligt på annat håll13. Detta tillvägagångssätt utvecklades ursprungligen för användning i neurologisk forskning på gnagare och tillämpades sedan först på människor för att undersöka mekanismerna bakom aktiv vasodilatation ur en termoregulatorisk synvinkel. I slutet av 1990-talet användes denna metod för att undersöka både neurala och endotelmekanismer med avseende på lokal uppvärmning av huden. Sedan dess har tekniken använts för att undersöka ett antal neurovaskulära signalmekanismer i huden.
Med hjälp av denna teknik har vår grupp och andra undersökt mekanismerna för endoteldysfunktion i mikrovaskulaturen hos flera kliniska populationer, inklusive, men inte begränsat till, dyslipidemi, primärt åldrande, diabetes, kronisk njursjukdom, polycystiskt ovariesyndrom, havandeskapsförgiftning, egentlig depression 14,15,16,17,18,19 och hypertoni 20,21,22,23,24. Till exempel fann en tidigare studie att normotensiva kvinnor med en historia av havandeskapsförgiftning, som löper en ökad risk för hjärt-kärlsjukdom, hade minskad NO-medierad vasodilatation i den kutana cirkulationen jämfört med kvinnor med en historia av normotensiv graviditet20. I en annan studie visade vuxna som diagnostiserats med primär HTN ökad angiotensin II-känslighet i mikrovaskulaturen jämfört med friska kontroller21, och kronisk sulfhydryldonerande blodtryckssänkande läkemedelsbehandling hos patienter med primär HTN har visat sig sänka blodtrycket och förbättra både vätesulfid- och NO-medierad vasodilatation22. Wong et al.23 fann försämrad sensoriskt medierad och NO-medierad vasodilatation hos prehypertensiva vuxna, vilket sammanföll med vårt fynd av en progression av endotelial dysfunktion med ökande HTN-stadier, som kategoriseras av 2017 American Heart Association och American College of Cardiology riktlinjer24.
Den intradermala mikrodialystekniken möjliggör noggrant kontrollerade mekanistiska undersökningar av mikrovaskulär funktion i hälso- och sjukdomstillstånd. Därför syftar denna uppsats till att beskriva den intradermala mikrodialystekniken som tillämpas av vår grupp och andra. Vi beskriver procedurerna för både farmakologisk stimulering av endotelet med acetylkolin (ACh) för att undersöka dos-responsförhållandet och fysiologisk stimulering av endogen NO-produktion med antingen ett 39 °C eller 42 °C lokalt uppvärmningsstimulusprotokoll. Vi presenterar representativa resultat för varje metod och diskuterar de kliniska implikationerna av de fynd som har uppstått från denna teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer godkänns av Institutional Review Board vid Pennsylvania State University före rekrytering av deltagare.
1. Inställning av utrustning
- Slå på den lokala värmeenheten och laserdopplerflödesmätaren.
OBS: Båda bör kalibreras före datainsamling enligt tillverkarens instruktioner. Laserdopplerflödesmätaren ska anslutas till datainsamlingshårdvara med sampling vid 100 Hz (100 samples/min) och kontinuerlig registrering i en datainsamlingsprogramvara. Även om annan maskinvara och programvara för datainsamling kan användas, återspeglar de återstående instruktionerna för enkelhetens skull PowerLab-hårdvaran och LabChart-programvarans funktioner. - Öppna en LabChart-programvarufil.
OBS: En referens file med önskad datainmatning och kontinuerlig datainsamling bör göras i förväg. Det bör finnas en panel för varje laserdoppler och lokal värmare som motsvarar varje mikrodialysplats, och panelerna bör motsvara lämpliga kanalingångar i hårdvaruenheten för datainsamling.
2. Placering av mikrodialysfiber
- Identifiera de stora, synliga blodkärlen i huden i den ventrala aspekten av underarmen och indikera dem med en permanent markör (använd ett tryckförband för att visualisera kärlen om det behövs; identifiering av kärl i mörkt pigmenterad hud kan kräva större beroende av palpation).
- Svabba området som omfattar märkena och en generös del av det omgivande området med betadinvabb. Torka bort betadin med spritservetter. Täck det steriliserade hudområdet med ett sterilt draperi och applicera is i ~5 minuter för att bedöva området.
- Ta bort isen och stick in en införingsnål (23 G, 25 mm lång), med fasningen uppåt, i hudens hudskikt på ett djup av 2-3 mm (beroende på den individuella hudtjockleken). För fram nålen, var noga med att stanna kvar i hudskiktet och lämna huden ~20 mm från insättningspunkten.
OBS: För att bekräfta rätt placeringsdjup i huden bör nålens form vara synlig och lätt att palpera, men nålens färg bör döljas. Om mer än en mikrodialyssond krävs för experimentet måste två införingsnålar placeras ≥2,5 cm från varandra och placeras innan mikrodialyssonden sätts in. Sonder bör inte placeras längs samma större kärl. - Låt nålen sitta kvar och anslut sonden (via Luer-låset) till en spruta som innehåller lakterad Ringer-lösning. Mata den motsatta änden av sonden genom införingsnålen tills sondens semipermeabla membran är nära men fortfarande utanför införingsnålens öppning. Perfundera långsamt en liten mängd av Ringers lösning genom fibern tills lösningen är synligt perfunderad genom membranets porer för att bekräfta membranets integritet.
- Om du använder en Harvard Bioscience-mikrodialyssond och introducernål, följ steg 2.5.1-2.5.2.
- När sondens funktion har bekräftats, mata sonden ytterligare genom införingsnålen tills membranet är helt inneslutet i hudens dermala lager i införingsnålen.
- Använd ett finger, fäst sonden på plats proximalt mot nålen och dra ut nålen i motsatt riktning från insättningen. Tejpa den yttre delen av fibern på plats på huden för att förhindra förskjutning av det semipermeabla membranet under experimentet.
- Om du använder en bioanalytisk systemmikrodialyssond och introducernål, följ steg 2.6.1-2.6.2.
- När sondens funktion har bekräftats, ta tag i navet på införingsnålen och den distala delen av mikrodialysproben i ena handen och dra samtidigt ut nålen i motsatt riktning mot införingsriktningen och flytta mikrodialyssonden på plats.
- Justera sonden efter behov för att säkerställa att det semipermeabla membranet är helt begravt i huden. Tejpa fast den yttre fibern på huden för att förhindra förskjutning av det semipermeabla membranet under experimentet.
3. Hyperemi
- I väntan på att det hyperemiska svaret på nålinsättningen ska avta (~60-90 min) placerar du engångssprutan i spruthållarbrickan på mikroinfusionspumparna. Perfundamakterad Ringerlösning, koksaltlösning eller vehikellösning (den lösning i vilken det experimentella farmakologiska medlet är upplöst; 2 μL/min) under hyperemifasen.
OBS: Även om mikrodialyssonderna inte kan tas bort under denna ~60-90 minuters fas, kan deltagaren justera sin kroppsposition eller flytta handen, eller så kan sondens Luer-lås tas bort från sprutan och fästas med tejp på deltagarens arm så att de kan stå upp en kort stund. När LDF-sonderna väl har instrumenterats med lokala värmare och LDF-sonder (Dopplerflödesmätning) och när datainsamlingen har påbörjats kan de inte flyttas. - När hudrodnaden, som är en indikator på den hyperemiska reaktionen på nåltrauma, har avtagit, fäst den lokala värmeenheten på huden som täcker det semipermeabla membranet via sondens självhäftande skiva, och se till att mitten av värmaren är i linje med mikrodialyssondens väg.
- Placera LDF-sonden i öppningen i mitten av den lokala värmaren så att lasern är direkt vinkelrät mot hudens yta. När LDF-sonderna är placerade och säkrade, klicka på start på datainsamlingsprogramvaran för att kontinuerligt registrera och visa flödesvärdena för röda blodkroppar (RBC-flöde; perfusionsenheter, PU). Om hyperemin har avtagit helt kommer RBC-flödet att vara stabilt vid ~5-20 PU (pulsatiliteten hos kärlen under LDF-sonden kan reflekteras av små förhöjningar av PU som sammanfaller med hjärtslagen).
- Placera en automatisk blodtrycksmanschett på armen på en försöksperson som inte har instrumenterats.
- Ställ in de lokala värmarna på 33 °C för att klämma fast hudtemperaturen inom ett termoneutralt område25, vilket tar bort eventuella variationer i påverkan av termiska stimuli. Om du vill lägga till en kommentar till den kontinuerliga inspelningen i datainsamlingsprogrammet för att ange händelser i experimentet klickar du på textrutan i det övre högra hörnet av skärmen, skriver en kommentar, väljer vilka kanaler som ska få kommentaren och klickar på lägg till.
4. Dos-responsprotokoll för acetylkolin
- När RBC-flödet har stabiliserats som svar på den lokala värmen på 33 °C, börja insamlingen av baslinjedata, som i datainsamlingsprogramvarufilen särskiljs med en kommentar börja baslinjen. Minst 5-10 minuters stabil baslinje krävs för dataanalys; starta om baslinjen när som helst under den här punkten i datainsamlingen om det behövs och markera detta i LabChart-filen. Under den sista minuten av baslinjen samlar du in en blodtrycksmätning och anger värdena i en kommentar i LabChart-filen.
- I slutet av de 5-10 minuterna av baslinjedatainsamlingen, mät och registrera baslinjeblodtrycket och ange kommentarens slutbaslinje i datainsamlingsprogramvaran.
- Stäng av mikroinfusionspumparna och byt ut sprutorna fulla med lakterad Ringer-lösning mot sprutan fylld med den lägsta koncentrationen av ACh (10−10 M).
- Fäst de nya sprutorna på plats och bekräfta perfusionen av vätskan genom sondens ände innan du slår på mikroinfusionspumparna igen. Mata in kommentaren begin −10 i inspelningen av datainsamlingsprogrammet.
- Varje koncentration av ACh kommer att perfunderas i 5-10 minuter vid 2 μL/min. Under den sista perfusionsminuten, för varje koncentration, mät och registrera blodtrycket. När perfusionstiden för en given koncentration har löpt ut, byt ut sprutan mot den näst högsta koncentrationen (t.ex. 10−10 M ACh-lösning byts ut mot 10−9 M ACh-lösning ), enligt beskrivningen i steg 4.2-4.4.
- Omedelbart efter genomspolning av den slutliga koncentrationen av ACh (10−1 M), byt ut ACh-sprutan mot en som innehåller Ringers lösning och öka den lokala värmarens temperatur till 43 °C. När RBC-flussmedlet har stabiliserats, byt ut Ringers lösning mot natriumnitroprussid (28 mM) för att producera både en värmeinducerad och farmakologiskt inducerad maximal lokal vasodilatation. Mät och registrera blodtrycket var ~3:e minut under denna maximala vasodilatationsfas.
- När en maximal RBC-flusplatå har inträffat (~5 min stabil PU), avsluta experimentet. Välj stopp i det nedre högra hörnet av datainsamlingsprogrammet för att avsluta den kontinuerliga datainsamlingen.
5. Lokalt uppvärmningsprotokoll
- När RBC-flödet har stabiliserats efter hyperemi, börja baslinjedatainsamlingen och ange detta i datainsamlingsprogramvaran file med en kommentar. Under den sista minuten av baslinjen, samla in en blodtrycksmätning och ange värdena i en kommentar i datainsamlingsprogramvaran file.
- Öka de lokala värmarna till antingen 39 °C eller 42 °C, beroende på protokollets behov (förklaras i diskussionsavsnittet).
- När RBC-flödet har nått en platå som svar på lokal värmetillförsel (~40-60 min uppvärmning), perfundera N G-nitro-l-argininmetylester (L-NAME; 15 mM löst i Ringers lösning; 2 μL/min; en NO-syntashämmare) genom mikrodialyssonden/-sonden.
- När RBC-flödet har nått en platå som svar på L-NAME (~15-25 minuters perfusion), öka de lokala värmarna till 43 °C.
- När RBC-flödet har nått en platå som svar på 43 °C (en platå på ~2-5 minuter inträffar efter ~20-45 minuters uppvärmning), perfundera natriumnitroprussid (28 mM löst i Ringers lösning) genom mikrodialyssonden/mikrodialyssonden.
- När en maximal RBC-flusplatå har inträffat (~5 min stabil PU), avsluta experimentet. Välj stopp i det nedre högra hörnet av datainsamlingsprogrammet för att avsluta datainsamlingen.
6. Ta bort mikrodialyssonderna
- Efter att experimentet avslutats använder du en kirurgisk sax för att klippa av mikrodialyssonderna. Ta försiktigt bort LDF-sonderna från värmarna och ta bort värmarna från huden. Ta försiktigt bort tejpen som håller sonderna på plats på huden.
- Identifiera visuellt vilket punkteringsställe på vardera sidan av sonden som har bildat den minsta blodproppen. Skär av den del av sonden nära platsen med den mindre koageln, lämna ~1 tum av sonden utanför huden oskuren.
- Rengör den del av huden som omger sondens in- och utgångsställen med en alkoholservett, såväl som ~1 i längd av sonden som finns kvar på det mindre koagulerade stället.
- Låt alkoholen torka på huden. Ta sedan tag i den del av sonden som sträcker sig från punkteringsstället med den större koageln, mittemot ~1 i delen på den mindre koagulerade änden. Dra långsamt sonden mot den större blodproppen.
- Placera steril gasbinda över eventuell blödning som uppstår när sonden tas bort och tryck på.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dos-responsprotokoll för acetylkolin
Figur 1A visar ett schema som beskriver ACh-dos-responsprotokollet. Figur 1B illustrerar representativa tracings av RBC-flödesvärdena (perfusionsenheter, PU; 30 s medelvärden) från det standardiserade ACh-dos-responsprotokollet för en patient över tid. Figur 1C illustrerar en rådatafil för ett ACh-dos-responsprotokoll. Ytterligare baslinjemätningar bibehölls i rådatafilen, men endast ~10 min baslinje användes för dataanalysen.
Efter hyperemiupplösning och ett stabilt RBC-flöde i 5 minuter kan 10 minuters insamling av baslinjedata börja. Baslinjen avbildas som en relativt stabil horisontell RBC-flödeslinje, där alla orsaker till avvikelser (t.ex. rörelseartefakter, sondjusteringar) bör loggas som kommentarer till datainsamlingsprogramvara för analysändamål. Dos-responsprotokollet följer baslinjeperioden och sprutorna måste bytas för varje dos, från 10−10 M till 10−1 M ACh. Innan man påbörjar 5-10 minuters perfusion av varje dos måste man se till att det farmakologiska medlet har perfunderats helt genom fiberns längd. I datainsamlingsprogrammet kommer det att ske en initial ökning av RBC-flödet på grund av perfusionen, men detta ingår inte i analyserna, eftersom den 5 minuter långa datainsamlingen för den koncentrationen inte har påbörjats. När perfusionen för varje dos har påbörjats kommer det att ske en kontinuerlig ökning av RBC-flödet till en topp, följt av en stadig nedgång. Detta krökta svar på farmakologiska medel kommer att replikeras genom hela protokollet, men RBC-flödet kommer att vara relativt större med ökande koncentrationer av ACh. Med lägre koncentrationer av ACh kan det hända att den krökta responsen inte är lika framträdande. Exempel på icke-optimalt RBC-flöde inkluderar följande: 1) en icke-krökt respons, där RBC-flödet inte ökar och förblir platå, eller 2) ökande ACh-koncentrationer som har en minimal inverkan på RBC-flödet, där RBC-flödet inte ökar relativt med varje koncentration av ACh. Detta beror på forskningsfrågan och den kliniska kohorten som testas.
Efter den slutliga koncentrationen av ACh perfunderas laktat Ringers och de lokala värmarna ökas till 43 °C. Under denna fas måste en platå erhållas innan natriumnitroprussid perfunderas. Detta kan ta upp till ~45 min, beroende på tidigare perfunderade medel. Denna fas ingår inte i analyserna. När platån har uppnåtts i 5 minuter perfunderas natriumnitroprussid för att ge maximal lokal vasodilatation. Denna maximala lokala vasodilatation avbildas som en ökning av RBC-flödet, där en platå erhålls efter ~20 minuters perfusion, eller genom att RBC-flödet når en topp och minskar omedelbart efter. När en platå eller en minskning av RBC-flödet har uppnåtts för natriumnitroprussid är protokollet komplett. Ett vanligt exempel på icke-optimalt RBC-flöde är att det högsta värdet av RBC-flöde erhålls i en annan fas av protokollet (t.ex. under dos-responsprotokollet) snarare än under den maximala lokala vasodilatationen.
Dos-responsprotokoll för acetylkolin: Hämning av kväveoxidsyntas
För att kvantifiera bidraget av NO till kutant blodflöde som svar på ACh, perfunderas N G-nitro-l-argininmetylester (L-NAME), en NO-syntashämmare, i kombination med ACh genom en extra fiber. Figur 2A visar ett schema som beskriver ACh-dos-responsprotokollet med L-NAME. Figur 2B illustrerar representativa tracings av RBC-flödet (30 s medelvärden) från det standardiserade ACh-dos-responsprotokollet för en patient över tid med L-NAME. Figur 2C illustrerar en rådatafil för ett ACh-dos-responsprotokoll med L-NAME. Ytterligare baslinjemätningar bibehölls i rådatafilen, men endast ~10 min baslinje användes för dataanalysen.
Efter att hyperemin har upphört, ett stabilt flöde av röda blodkroppar i 5 minuter och tillräckligt med tid för att helt blockera den enzymatiska signalvägen av intresse (t.ex. NO-syntas) och/eller leverera adekvata koncentrationer av co-faktorer, kan 10 minuters insamling av baslinjedata påbörjas (avbildad som en relativt stabil horisontell linje). Dos-responsprotokollet följer baslinjen och sprutorna måste bytas med varje dos från 1010 M till 101 M ACh med NO-syntashämmaren (t.ex. 15 mM L-NAMN). I närvaro av en NO-syntashämmare replikeras inte det krökta svaret väl förrän högre koncentrationer av ACh. Ett relativt lägre RBC-flöde, jämfört med en plats utan syntashämning, kommer att observeras. Ett vanligt exempel på icke-optimalt RBC-flöde är NO-syntashämning, jämfört med förhållanden utan NO-syntashämning, vilket resulterar i ett högre RBC-flöde. Detta indikerar att protokollet har misslyckats.
Efter perfusion av den slutliga koncentrationen av ACh perfunderas laktat Ringers och de lokala värmarna ökas till 43 °C. Under denna fas bör en platå erhållas innan natriumnitroprussid perfunderas. Denna fas ingår inte i analyserna. När platån har uppnåtts i 5 minuter perfunderas natriumnitroprussid, vilket ger maximal lokal vasodilatation. Under maximal lokal vasodilatation kommer det att ske en exponentiell ökning av RBC-flödet på grund av den tidigare NO-syntashämningen. En platå kommer att erhållas efter ~20 minuters perfusion, eller så kommer RBC-flödet att nå sin absoluta topp och avta omedelbart efter. När en platå eller en minskning av RBC-flödet har uppnåtts för natriumnitroprussid är protokollet komplett. Ett vanligt exempel på icke-optimalt RBC-flöde är att erhålla det högsta RBC-flödesvärdet i en annan fas av protokollet (t.ex. under dos-responsprotokollet) snarare än under den maximala lokala vasodilatationen.
Lokalt uppvärmningsprotokoll
Figur 3A visar ett schema som beskriver det lokala uppvärmningsprotokollet. Figur 3B illustrerar representativa tracings av RBC-flödet (30 s medelvärden) för det standardiserade lokala uppvärmningsprotokollet för ett ämne över tid. Figur 3C illustrerar en rådatafil för ett lokalt uppvärmningsprotokoll. Efter hyperemiupplösning och ett stabilt RBC-flöde i 5 minuter kan 10 minuters datainsamling vid baslinjen påbörjas (avbildas som en relativt stabil horisontell linje). De lokala värmarna är inställda på antingen 39 °C eller 42 °C, och en initial topp- och nadirrespons kommer att inträffa i RBC-flödet. För att kvantifiera NO:s bidrag till det kutana blodflödet som svar på en lokal värmestimulus, perfunderas L-NAME efter att en stabil platå i RBC-flödet har uppnåtts. Det kommer att ske en snabb nedgång i RBC-flödet tills det når en ny platå som svar på L-NAME. Efter 5 minuter med stabila RBC-flödesvärden perfunderas laktat Ringers och de lokala värmarna ökas till 43 °C. Uppvärmningen kommer att ge en ytterligare topp- och nadirrespons i RBC-flödet. Under denna fas måste man se till att en platå har uppnåtts innan natriumnitroprussid perfunderas. Denna fas ingår inte i analyserna. För att inducera lokal maximal vasodilatation perfunderas natriumnitroprussid och en snabb ökning av RBC-flödet kommer att inträffa. När en platå eller en nedgång i RBC-flödet har observerats som svar på natriumnitroprussid är protokollet komplett.
Figur 1: Dos-responsprotokoll för acetylkolin (ACh). A) Schematisk bild av ett ACh-dos-responsprotokoll. B) Representativ spårning (30 s medelvärden) av ett ACh-dos-responsprotokoll. C) Rådata för ett ACh-dos-responsprotokoll. Ytterligare baslinjemätningar bibehålls i rådatafilen för att visa fluktuationerna före stabilisering, men endast ~10 min stabila vilodata användes för dataanalysen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: ACh-dos-responsprotokoll med kväveoxidsyntashämning (NO). A) Schematisk bild av ett ACh-dos-responsprotokoll med NO-syntashämning. B) Representativ spårning av ett ACh-dos-responsprotokoll utan syntashämning. C) Rådata för ett ACh-dos-responsprotokoll utan syntashämning. Ytterligare baslinjemätningar bibehålls i rådatafilen för att visa fluktuationerna före stabilisering, men endast ~10 min stabila vilodata användes för dataanalysen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Lokalt uppvärmningsprotokoll. (A) Schematisk bild av ett lokalt uppvärmningsprotokoll. (B) Representativ spårning av ett lokalt uppvärmningsprotokoll. C) Rådata för ett lokalt uppvärmningsprotokoll. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den intradermala mikrodialystekniken är ett mångsidigt verktyg inom humankärlsforskning. Utredare kan ändra protokollet för att ytterligare diversifiera dess tillämpningar. Till exempel beskriver vi ett ACh-dos-responsprotokoll, men andra undersökningar av mekanismerna för vasokonstriktion eller vasomotorisk tonus, snarare än enbart vasodilatation, har använt noradrenalin eller natriumnitroprussid dos-responsmetoder 26,27,28,29,30,31. Andra vasodilatationsmedier, såsom mentol eller metaklorid, har också använts i dos-responsprotokollet31,32. Dos-responsprotokollet som en farmakologisk bedömning av vaskulär funktion är en mer målinriktad, mekanistisk teknik för att isolera specifika signalmekanismer jämfört med det lokala uppvärmningsprotokollet, eftersom det tar bort variationer i det sympatiska svaret på termiska stimuli. Lokal uppvärmning är dock ett kostnadseffektivt tillvägagångssätt som använder en fysiologisk stimulans för att inducera vasodilatation via både neurogena och endotelberoende mekanismer. Det är också viktigt att ta hänsyn till den aktuella mekanismen när man väljer mellan ett lokalt uppvärmningsprotokoll på 39 °C eller 42 °C. 39 °C-protokollet har föreslagits för att bättre isolera NO-medierad vasodilatation, medan 42 °C-protokollet möjliggör undersökning av både NO-medierad vasodilatation och endotel-härledd hyperpolariserande faktormedierad vasodilatation33,34. Dessutom tenderar ökningen av CVC som svar på lokal uppvärmning på 42 °C att vara mer robust (dvs. att nå en högre % CVCmax34). Men när man använder ett nytt medel för att undersöka en specifik signalväg måste rigorösa metoder användas för att utvärdera effektiviteten (dvs. helt blockera) och/eller mätta koncentrationerna av co-faktorerna.
Endotelfunktionen mäts ofta med hjälp av flödesmedierad dilatationsteknik, men endoteldysfunktion i mikrovaskulära bäddar kan uppstå före eller oberoende av endoteldysfunktion i stora ledningsartärer, särskilt i patologier som HTN 6,7,8. Dessutom tillåter den flödesmedierade dilatationstekniken inte farmakologisk dissektion av patofysiologin för endoteldysfunktion isolerat från systemiska effekter. Andra metoder för att undersöka mikrovaskulär endotelfunktion, såsom jontofores eller postocklusiv reaktiv hyperemi, kan inte exakt rikta in sig på endotelfunktionens mekanismer med farmakologisk intervention12. Därför möjliggör intradermal mikrodialys på ett unikt sätt riktade undersökningar av mekanismerna för vaskulär funktion, och dess användning, tillsammans med flödesmedierade dilatationsresultat, kan ge en mer holistisk bild av systemisk vaskulär funktion.
Oavsett vilken intradermal mikrodialysmetod som används måste vissa försiktighetsåtgärder vidtas för att säkerställa validiteten och reproducerbarheten av svaren. Även om detaljerna i det experimentella protokollet kan justeras för att svara på specifika forskningsfrågor, är den exakta placeringen av mikrodialysproben helt avgörande. Försiktighet måste iakttas för att föra in sonden i dermis och för att undvika större synliga eller palperbara blodkärl i huden. Punktering av dessa kärl kommer att resultera i onormalt låga perfusionsenhetsvärden; i det här fallet kommer laserdopplerflödesmetrin att mäta bildandet av ett hematom snarare än flödet av röda blodkroppar genom ett intakt kärl. Efter detta är det näst mest kritiska steget i detta protokoll upplösningen av det hyperemiska svaret på nålpunktionen. Om det hyperemiska svaret inte tillåts avta helt, kommer de registrerade perfusionsenheterna under hela baslinjen och de tidiga delarna av protokollet att vara större än de verkliga vilovärdena. Om tillräcklig återhämtningstid har tillåtits men perfusionsenheterna förblir onormalt höga, kan en omkalibrering av sonderna krävas innan insamlingsfasen för baslinjedata påbörjas.
En begränsning med den intrakutana mikrodialystekniken är att den inte specifikt kan isolera en vävnadstyp för att utvärdera vaskulära signalvägar. Eftersom hudens kärl inte kan dissekeras och visualiseras in vivo finns det inget sätt att säkerställa att den semipermeabla delen av en mikrodialysprob ligger i omedelbar anslutning till den vävnad som är av intresse (t.ex. det vaskulära endotelet). Därför är resultaten från denna teknik representativa för den mänskliga fysiologins integrativa natur och ger insikter i den kollektiva funktionen av endotel, vaskulär glatt muskulatur och neurala influenser på lokalt blodflöde. Men om man använder ett lokalt uppvärmningsprotokoll, tillåter man att RBC-flödet når en platå vid den initiala värmeökningen till 39 °C eller 42 °C för att axonreflexen ska kunna lösas upp mot värmen, vilket sedan möjliggör ett primärt endotelmedierat svar, vilket diskuteras på annat håll35. En ytterligare begränsning med denna teknik är användningen av laserdopplerflödesmetri som ett index för hudens blodflöde. Laserdopplerflödesmetri kvantifierar flödet av röda blodkroppar, vilket inte tar hänsyn till förändringarna i kärldiametern (dvs. utvidgning av mikrokärlen), vilket skulle vara nödvändigt för att kvantifiera det absoluta flödet. Den kan vara känslig för skillnader mellan deltagare eller mellan villkor36. Framtida tillämpningar av intradermal mikrodialys kan komma att innefatta tekniker för att kvantifiera det absoluta mikrovaskulära blodflödet. Till exempel möjliggör den senaste utvecklingen av optisk koherenstomografi kvantifiering av kärldiametern med hjälp av tredimensionell avbildning av hudens mikrokärl13. Den intradermala mikrodialystekniken är kontraindicerad i mycket få men viktiga fall, som inkluderar, men inte är begränsade till, deltagare med hudåkommor, deltagare med allergier relaterade till de ämnen som beskrivs här, deltagare med svår trypanofobi och deltagare med tatueringar som täcker hela den ventrala aspekten av underarmen (men små tatueringar i detta område är inte uteslutande).
Den unika förmågan hos mikrodialysmetoden att hjälpa till att isolera och avgränsa underliggande patofysiologiska mekanismer gör den fördelaktig för att undersöka den variabla etiologin för HTN, bland andra CVD:er. Efter protokolloptimering gör denna teknik det möjligt att utvärdera effekten av nya CVD-behandlingar. Dessutom tillhandahåller intrakutant mikrodialys en metod för att bedöma off-target-effekterna av hypotetiskt orelaterade läkemedelsbehandlingar, vilket gör det till ett mycket värdefullt verktyg för att informera om storskaliga kliniska prövningar. Sammantaget är denna teknik en ovärderlig tillgång inom mikrovaskulär forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter och inget att avslöja.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
References
- Xu, J. Q., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Arias, E.
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93 (2023).
- Cohuet, G., Struijker-Boudier, H. Mechanisms of target organ damage caused by hypertension: Therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 111 (1), 81-98 (2006).
- Park, K. H., Park, W. J. Endothelial dysfunction: Clinical implications in cardiovascular disease and therapeutic approaches. Journal of Korean Medical Science. 30 (9), 1213-1225 (2015).
- Levy, B. I., Ambrosio, G., Pries, A. R., Struijker-Boudier, H. A. Microcirculation in hypertension: a new target for treatment. Circulation. 104 (6), 735-740 (2001).
- Sara, J. D., et al. Prevalence of coronary microvascular dysfunction among patients with chest pain and nonobstructive coronary artery disease. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Interventions. 8 (11), 1445-1453 (2015).
- Weis, M., Hartmann, A., Olbrich, H. G., Hör, G., Zeiher, A. M. Prognostic significance of coronary flow reserve on left ventricular ejection fraction in cardiac transplant recipients. Transplantation. 65 (1), 103-108 (1998).
- Rossi, M., et al. Investigation of skin vasoreactivity and blood flow oscillations in hypertensive patients: Effect of short-term antihypertensive treatment. Journal of Hypertension. 29 (8), 1569-1576 (2011).
- Pepine, C. J., et al. Coronary microvascular reactivity to adenosine predicts adverse outcome in women evaluated for suspected ischemia results from the National Heart, Lung and Blood Institute WISE (Women's Ischemia Syndrome Evaluation) study. Journal of the American College of Cardiology. 55 (25), 2825-2832 (2010).
- Matsuda, J., et al. Prevalence and clinical significance of discordant changes in fractional and coronary flow reserve after elective percutaneous coronary intervention. Journal of the American Heart Association. 5 (12), e004400 (2016).
- Gupta, A., et al. Integrated noninvasive physiological assessment of coronary circulatory function and impact on cardiovascular mortality in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 136 (24), 2325-2336 (2017).
- Roustit, M., Cracowski, J. L. Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 373-384 (2013).
- Low, D. A., Jones, H., Cable, N. T., Alexander, L. M., Kenney, W. L. Historical reviews of the assessment of human cardiovascular function: interrogation and understanding of the control of skin blood flow. European Journal of Applied Physiology. 120 (1), 1-16 (2020).
- Kenney, W. L., Cannon, J. G., Alexander, L. M. Cutaneous microvascular dysfunction correlates with serum LDL and sLOX-1 receptor concentrations. Microvascular Research. 85, 112-117 (2013).
- Holowatz, L. A., Thompson, C. S., Minson, C. T., Kenney, W. L. Mechanisms of acetylcholine-mediated vasodilatation in young and aged human skin. Journal of Physiology. 563, 965-973 (2005).
- Sokolnicki, L. A., Roberts, S. K., Wilkins, B. W., Basu, A., Charkoudian, N. Contribution of nitric oxide to cutaneous microvascular dilation in individuals with type 2 diabetes mellitus. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 292 (1), E314-E318 (2007).
- DuPont, J. J., Ramick, M. G., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species contribute to impaired cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 306 (12), F1499-F1506 (2014).
- Sprung, V. S., et al. Nitric oxide-mediated cutaneous microvascular function is impaired in polycystic ovary syndrome but can be improved by exercise training. Journal of Physiology. 591 (6), 1475-1487 (2013).
- Greaney, J. L., Saunders, E. F. H., Santhanam, L., Alexander, L. M. Oxidative stress contributes to microvascular endothelial dysfunction in men and women with major depressive disorder. Circulatory Research. 124 (4), 564-574 (2019).
- Stanhewicz, A. E., Jandu, S., Santhanam, L., Alexander, L. M. Increased angiotensin II sensitivity contributes to microvascular dysfunction in women who have had preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 382-389 (2017).
- Greaney, J. L., et al. Impaired hydrogen sulfide-mediated vasodilation contributes to microvascular endothelial dysfunction in hypertensive adults. Hypertension. 69 (5), 902-909 (2017).
- Dillon, G. A., Stanhewicz, A. E., Serviente, C., Greaney, J. L., Alexander, L. M. Hydrogen sulfide-dependent microvascular vasodilation is improved following chronic sulfhydryl-donating antihypertensive pharmacotherapy in adults with hypertension. Journal of Physiology. 321 (4), H728-H734 (2021).
- Wong, B. J., et al. Sensory nerve-mediated and nitric oxide-dependent cutaneous vasodilation in normotensive and prehypertensive non-Hispanic blacks and whites. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (2), H271-H281 (2020).
- Dillon, G. A., Greaney, J. L., Shank, S., Leuenberger, U. A., Alexander, L. M. AHA/ACC-defined stage 1 hypertensive adults do not display cutaneous microvascular endothelial dysfunction. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (3), H539-H546 (2020).
- Gagge, A. P., Stolwijk, J. A., Hardy, J. D. Comfort and thermal sensations and associated physiological responses at various ambient temperatures. Environmental Research. 1 (1), 1-20 (1967).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Lack of limb or sex differences in the cutaneous vascular responses to exogenous norepinephrine. Journal of Applied Physiology. 117 (12), 1417-1423 (2014).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Impaired increases in skin sympathetic nerve activity contribute to age-related decrements in reflex cutaneous vasoconstriction. Journal of Physiology. 593 (9), 2199-2211 (2015).
- Alba, B. K., Greaney, J. L., Ferguson, S. B., Alexander, L. M. Endothelial function is impaired in the cutaneous microcirculation of adults with psoriasis through reductions in nitric oxide-dependent vasodilation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (2), H343-H349 (2018).
- Greaney, J. L., Surachman, A., Saunders, E. F. H., Alexander, L. M., Almeida, D. M. Greater daily psychosocial stress exposure is associated with increased norepinephrine-induced vasoconstriction in young adults. Journal of the American Heart Association. 9 (9), e015697 (2020).
- Nakata, T., et al. Quantification of catecholamine neurotransmitters released from cutaneous vasoconstrictor nerve endings in men with cervical spinal cord injury. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (3), R345-R352 (2023).
- Tucker, M. A., et al. Postsynaptic cutaneous vasodilation and sweating: Influence of adiposity and hydration status. European Journal of Applied Physiology. 118 (8), 1703-1713 (2018).
- Craighead, D. H., Alexander, L. M. Menthol-induced cutaneous vasodilation is preserved in essential hypertensive men and women. American Journal of Hypertension. 30 (12), 1156-1162 (2017).
- Brunt, V. E., Minson, C. T. KCa channels and epoxyeicosatrienoic acids: Major contributors to thermal hyperaemia in human skin. Journal of Physiology. 590 (15), 3523-3534 (2012).
- Choi, P. J., Brunt, V. E., Fujii, N., Minson, C. T. New approach to measure cutaneous microvascular function: An improved test of NO-mediated vasodilation by thermal hyperemia. Journal of Applied Physiology. 117 (3), 277-283 (2014).
- Johnson, J. M., Kellogg, D. L. Jr Local thermal control of the human cutaneous circulation. Journal of Applied Physiology. 109 (4), 1229-1238 (2010).
- Jung, F., et al. Laser Doppler flux measurement for the assessment of cutaneous microcirculation-Critical remarks. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 55 (4), 411-416 (2013).
