Summary
İntradermal mikrodiyaliz, sağlık ve hastalıkta mikrovasküler fonksiyonu araştırmak için kullanılan minimal invaziv bir tekniktir. Bu teknikte kutanöz dolaşımda vazodilatasyon ve vazokonstriksiyon mekanizmalarını araştırmak için hem doz-yanıt hem de lokal ısıtma protokolleri kullanılabilir.
Abstract
Kutanöz damar sistemi, insanlarda mikrovasküler fonksiyonu değerlendirmek için kullanılabilen erişilebilir bir dokudur. İntradermal mikrodiyaliz, kutanöz dolaşımda vasküler düz kas ve endotel fonksiyonunun mekanizmalarını araştırmak için kullanılan minimal invaziv bir tekniktir. Bu teknik, kardiyovasküler hastalık gelişme riskinin bir göstergesi olan azalmış nitrik oksit aracılı vazodilatasyon ile indekslenen mikrovasküler endotel disfonksiyonunun patofizyolojisinin farmakolojik diseksiyonuna izin verir. Bu teknikte, cildin dermal tabakasına bir mikrodiyaliz probu yerleştirilir ve kırmızı kan hücresi akışını ölçmek için probun üzerine lazer Doppler flowmetri probu ile lokal bir ısıtma ünitesi yerleştirilir. Lokal cilt sıcaklığı doğrudan ısı uygulaması ile klemplenir veya uyarılır ve vazodilatasyon veya vazokonstriksiyonu indüklemek veya ilgilenilen mekanizmaları (ko-faktörler, antioksidanlar, vb.) sorgulamak için hücre içi sinyal yollarını uyarmak veya inhibe etmek için prob aracılığıyla farmakolojik ajanlar perfüze edilir. Kutanöz vasküler iletkenlik ölçülür ve hastalık durumlarında endotel disfonksiyonunun mekanizmaları tanımlanabilir.
Introduction
Kardiyovasküler hastalık (KVH) Amerika Birleşik Devletleri'nde önde gelen ölüm nedenidir1. Hipertansiyon (HTN) inme, koroner kalp hastalığı ve kalp yetmezliği için bağımsız bir risk faktörüdür ve Amerika Birleşik Devletleri nüfusunun ~% 50'sinden fazlasını etkilediği tahmin edilmektedir2. HTN, bağımsız bir KVH (primer HTN) olarak veya polikistik böbrek hastalığı ve/veya endokrin bozukluklar (sekonder HTN) gibi başka bir durumun sonucu olarak gelişebilir. HTN'nin etiyolojilerinin genişliği, HTN ile gözlenen altta yatan mekanizmalar ve son organ hasarının araştırılmasını zorlaştırmaktadır. HTN ile ilişkili son organ hasarının patofizyolojisine yönelik çeşitli ve yeni araştırma yaklaşımlarına ihtiyaç vardır.
KVH'nin en erken patolojik belirtilerinden biri, bozulmuş nitrik oksit (NO) aracılı vazodilatasyonile karakterize edilen endotel disfonksiyonudur 3,4,5. Akış aracılı dilatasyon, KVH ile ilişkili endotel disfonksiyonunu ölçmek için kullanılan yaygın bir yaklaşımdır, ancak mikrovasküler yataklardaki endotel disfonksiyonu, büyük kondüit arterlerden hem bağımsız hem de öncü olabilir 6,7,8. Ayrıca, dirençli arteriyoller, kanal arterlerinden daha doğrudan lokal doku tarafından etki eder ve oksijen açısından zengin kanın verilmesi üzerinde daha hızlı kontrole sahiptir. Mikrovasküler fonksiyon, advers kardiyovasküler olaysız sağkalımı öngörmektedir 9,10,11. Kutanöz mikrovasküler sistem, fizyolojik ve farmakolojik vazokonstriktif veya vazodilatör uyaranlara verilen yanıtları incelemek için kullanılabilen erişilebilir bir vasküler yataktır. İntradermal mikrodiyaliz minimal invaziv bir teknik olup, amacı hedefe yönelik farmakolojik diseksiyon ile kutanöz mikrovasküler sistemde hem vasküler düz kas hem de endotel fonksiyonunun mekanizmalarını araştırmaktır. Bu yöntem, farmakolojik diseksiyona izin vermeyen tıkayıcı reaktif hiperemi ve farmakolojik uygulamaya izin veren ancak etki mekanizmasında daha az kesin olan iyontoforez gibi diğer tekniklerle çelişir (başka bir yerde ayrıntılı olarak gözden geçirilmiştir12).
Bu tekniğin geliştirilmesinin ve kullanılmasının ardındaki mantık, başka bir yerde kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir13. Bu yaklaşım başlangıçta kemirgenlerde nörolojik araştırmalarda kullanılmak üzere geliştirildi ve daha sonra ilk olarak termoregülasyon açısından aktif vazodilatasyonun altında yatan mekanizmaları araştırmak için insanlara uygulandı. 1990'ların sonlarında, bu yöntem cildin lokal ısınması ile ilgili olarak hem nöral hem de endotelyal mekanizmaları incelemek için kullanıldı. O zamandan beri, teknik ciltteki bir dizi nörovasküler sinyal mekanizmasını araştırmak için kullanılmıştır.
Bu tekniği kullanarak, grubumuz ve diğerleri, dislipidemi, primer yaşlanma, diyabet, kronik böbrek hastalığı, polikistik over sendromu, preeklampsi, majör depresif bozukluk 14,15,16,17,18,19 ve hipertansiyon 20,21 dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli klinik popülasyonların mikrovaskülatüründe endotel disfonksiyon mekanizmalarını sorguladılar,22,23,24. Örneğin, daha önce yapılan bir çalışmada, preeklampsi öyküsü olan ve KVH riski yüksek olan normotansif kadınların, normotansif gebelik öyküsü olan kadınlara kıyasla kutanöz dolaşımda NO aracılı vazodilatasyonu azalttığı bulunmuştur20. Başka bir çalışmada, primer HTN teşhisi konan yetişkinler, sağlıklı kontrollere21 kıyasla mikrovaskülatürde artmış anjiyotensin II duyarlılığı gösterdi ve primer HTN hastalarında kronik sülfhidril veren antihipertansif farmakoterapinin kan basıncını düşürdüğü ve hem hidrojen sülfür hem de NO aracılı vazodilatasyonuiyileştirdiği gösterilmiştir 22. Wong ve ark.23, 2017 Amerikan Kalp Derneği ve Amerikan Kardiyoloji Koleji kılavuzları tarafından kategorize edildiği gibi, prehipertansif yetişkinlerde bozulmuş duyusal aracılı ve NO aracılı vazodilatasyon bulmuşlardır24.
İntradermal mikrodiyaliz tekniği, sağlık ve hastalık durumlarında mikrovasküler fonksiyona sıkı bir şekilde kontrol edilen mekanik araştırmalara izin verir. Bu nedenle, bu yazıda grubumuz ve diğerleri tarafından uygulanan intradermal mikrodiyaliz tekniğinin tanımlanması amaçlanmıştır. Doz-yanıt ilişkisini incelemek için endotelin asetilkolin (ACh) ile farmakolojik stimülasyonu ve 39 °C veya 42 °C lokal ısıtma uyaran protokolü ile endojen NO üretiminin fizyolojik stimülasyonu için prosedürleri detaylandırıyoruz. Her yaklaşım için temsili sonuçlar sunuyoruz ve bu teknikten elde edilen bulguların klinik sonuçlarını tartışıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler, katılımcı alımından önce Pennsylvania Eyalet Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanır.
1. Ekipman kurulumu
- Yerel ısıtma ünitesini ve lazer Doppler debimetreyi açın.
NOT: Her ikisi de veri toplanmadan önce üreticinin talimatlarına göre kalibre edilmelidir. Lazer Doppler debimetre, 100 Hz'de (100 örnek/dak) örnekleme ve bir veri toplama yazılımında sürekli kayıt ile veri toplama donanımına bağlanmalıdır. Diğer veri toplama donanımı ve yazılımı kullanılabilirken, basitlik için kalan talimatlar PowerLab donanımını ve LabChart yazılım özelliklerini yansıtır. - Bir LabChart yazılım dosyası açın.
NOT: Önceden istenilen veri girişi ve sürekli veri toplama özelliklerine sahip bir referans dosyası oluşturulmalıdır. Her bir mikrodiyaliz bölgesine karşılık gelen her lazer Doppler ve lokal ısıtıcı için bir panel bulunmalı ve paneller veri toplama donanım birimindeki uygun kanal girişlerine karşılık gelmelidir.
2. Mikrodiyaliz lifi yerleştirme
- Önkolun ventral yönündeki derinin büyük, görünür kan damarlarını tanımlayın ve bunları kalıcı bir işaretleyici ile belirtin (gerekirse damarları görselleştirmek için bir turnike kullanın; koyu pigmentli ciltteki damarları tanımlamak palpasyona daha fazla güvenmeyi gerektirebilir).
- Betadin çubukları kullanarak işaretleri ve çevredeki alanın cömert bir bölümünü kapsayan alanı temizleyin. Betadini alkollü bezlerle silin. Sterilize edilmiş cilt bölgesini steril bir örtü ile örtün ve bölgeyi uyuşturmak için ~ 5 dakika buz uygulayın.
- Buzu çıkarın ve eğimi yukarı bakacak şekilde 2-3 mm derinlikte (bireysel cilt kalınlığına bağlı olarak) cildin dermal tabakasına bir giriş iğnesi (23 G, 25 mm uzunluk) sokun. Dermal tabakada kalmaya dikkat ederek iğneyi ilerletin ve yerleştirme noktasından ciltten ~ 20 mm çıkın.
NOT: Deride uygun yerleştirme derinliğini doğrulamak için, iğnenin şekli görünür ve kolayca aşikar olmalıdır, ancak iğnenin rengi gizlenmelidir. Deney için birden fazla mikrodiyaliz probu gerekiyorsa, mikrodiyaliz probu yerleştirilmeden önce herhangi iki introdüser iğnesinin ≥2,5 cm aralıklarla yerleştirilmesi ve konumlandırılması gerekecektir. Problar aynı ana damar boyunca yerleştirilmemelidir. - İğneyi yerinde bırakarak, probu (Luer kilidi aracılığıyla ) laktasyonlu Ringer solüsyonu içeren bir şırıngaya bağlayın. Probun diğer ucunu, probun yarı geçirgen zarı, introdüser iğnesinin açıklığına yakın ancak yine de dışında olana kadar introdüser iğnesinden geçirin. Membranın bütünlüğünü doğrulamak için solüsyon membranın gözeneklerinden gözle görülür şekilde perfüze edilene kadar az miktarda Ringer solüsyonunu elyaftan yavaşça perfüze edin.
- Harvard Bioscience mikrodiyaliz probu ve tanıtıcı iğne kullanıyorsanız, 2.5.1-2.5.2 adımlarını izleyin.
- Prob fonksiyonunun onaylanması üzerine, membran tamamen introdüser iğnesi içindeki cildin dermal tabakasında yer alana kadar probu introdüser iğnesinden daha fazla besleyin.
- Bir parmak kullanarak, probu iğnenin proksimalindeki yerine sabitleyin ve iğneyi yerleştirmeden ters yönde çekin. Deney sırasında yarı geçirgen zarın yer değiştirmesini önlemek için lifin dış kısmını cilt üzerinde yerine bantlayın.
- Biyoanalitik Sistemler mikrodiyaliz probu ve introdüser iğnesi kullanıyorsanız, 2.6.1-2.6.2 adımlarını izleyin.
- Prob fonksiyonunun onaylanması üzerine, bir elinizle introdüser iğnesinin göbeğini ve mikrodiyaliz probunun distal kısmını tutun ve aynı anda mikrodiyaliz probunu yerine hareket ettirerek iğneyi yerleştirme yönünün tersine çekin.
- Yarı geçirgen zarın cilde tamamen gömüldüğünden emin olmak için probu gerektiği gibi ayarlayın. Deney sırasında yarı geçirgen zarın yer değiştirmesini önlemek için dış elyafı cilt üzerinde yerine bantlayın.
3. Hiperemi
- İğne batırılmasına verilen hiperemik yanıtın azalmasını beklerken (~60-90 dk), tek kullanımlık şırıngayı mikroinfüzyon pompalarındaki şırınga tutucu tepsisine yerleştirin. Perfuse, hiperemi fazı sırasında emzirilmiş Ringer çözeltisi, salin veya araç çözeltisi (deneysel farmakolojik ajanın çözüldüğü çözelti; 2 μL / dak).
NOT: Mikrodiyaliz probları bu ~ 60-90 dakikalık aşamada çıkarılamazken, katılımcı vücut pozisyonunu ayarlayabilir veya elini hareket ettirebilir veya probun Luer kilidi şırıngadan çıkarılabilir ve kısa bir süre ayakta durmaları için serbest hareket açıklığına izin vermek için katılımcının koluna bantla sabitlenebilir. Lokal ısıtıcılar ve lazer Doppler akış ölçer (LDF) probları ile donatıldıktan ve veri toplama başladıktan sonra, LDF probları hareket ettirilemez. - İğne travmasına verilen hiperemik yanıtın bir göstergesi olan cilt kızarıklığı azaldığında, lokal ısıtma ünitesini prob yapışkan diski aracılığıyla yarı geçirgen membranı kaplayan cilde takın ve ısıtıcının merkezinin mikrodiyaliz probunun yolu ile aynı hizada olmasını sağlayın.
- LDF probunu, lazer doğrudan cilt yüzeyine dik olacak şekilde lokal ısıtıcının ortasındaki açıklığa yerleştirin. LDF probları yerleştirildikten ve sabitlendikten sonra, kırmızı kan hücresi akı değerlerini (RBC akısı; perfüzyon üniteleri, PU'lar) sürekli olarak kaydetmek ve görüntülemek için veri toplama yazılımında başlat'a tıklayın. Hiperemi tamamen azalmışsa, RBC akısı ~ 5-20 PU'da stabil olacaktır (LDF probunun altındaki damarların nabız atışı, kalp atışlarıyla çakışan PU'daki hafif yükselmelerle yansıtılabilir).
- Aletsiz bir deneğin koluna otomatik bir tansiyon manşonu yerleştirin.
- Cilt sıcaklığını termonötr aralık25'e sıkıştırmak için yerel ısıtıcıları 33 °C'ye ayarlayın, böylece termal uyaranların etkisindeki değişiklikleri ortadan kaldırın. Deneydeki olayları belirtmek üzere veri toplama yazılımındaki sürekli kayda bir yorum eklemek için ekranın sağ üst köşesindeki metin kutusuna tıklayın, bir yorum yazın, yorumu hangi kanalların alması gerektiğini seçin ve ekle'ye tıklayın.
4. Asetilkolin doz-yanıt protokolü
- RBC akısı, 33 °C yerel ısıya yanıt olarak stabilize olduğunda, veri toplama yazılımı dosyasında bir yorum başlangıç taban çizgisi ile ayırt edilen temel veri toplamaya başlayın. Veri analizi için en az 5-10 dakikalık kararlı taban çizgisi gereklidir; Gerekirse, veri toplamanın bu noktası sırasında herhangi bir zamanda temeli yeniden başlatın ve bunu LabChart dosyasında işaretleyin. Taban çizgisinin son dakikasında, bir kan basıncı ölçümü toplayın ve değerleri LabChart dosyasındaki bir yoruma girin.
- 5-10 dakikalık temel veri toplamanın sonunda, temel kan basıncını ölçün ve kaydedin ve veri toplama yazılımına yorum sonu taban çizgisini girin.
- Mikroinfüzyon pompalarını kapatın ve laktasyonlu Ringer solüsyonu ile dolu şırıngaları en düşük ACh konsantrasyonu (10−10 M) ile doldurulmuş şırınga ile değiştirin.
- Yeni şırıngaları yerine sabitleyin ve mikroinfüzyon pompalarını tekrar açmadan önce sıvının probun ucundan perfüzyonunu onaylayın. Veri toplama yazılımı kaydına yorum başlangıcını −10 girin.
- Her ACh konsantrasyonu, 2 μL / dk'da 5-10 dakika perfüze edilecektir. Perfüzyonun son dakikasında, her konsantrasyon için kan basıncını ölçün ve kaydedin. Belirli bir konsantrasyon için perfüzyon süresi sona erdiğinde, şırıngayı bir sonraki en yüksek konsantrasyonla değiştirin (ör., 10-10 M ACh çözeltisi 10-9 M ACh çözeltisi ile değiştirilir), adım 4.2-4.4'te açıklandığı gibi.
- ACh'nin son konsantrasyonunu (10−1 M) perfüze ettikten hemen sonra, ACh şırıngasını Ringer solüsyonu içeren bir şırıngayla değiştirin ve yerel ısıtıcı sıcaklığını 43 °C'ye yükseltin. RBC akısı stabilize olduktan sonra, hem ısı kaynaklı hem de farmakolojik olarak indüklenen maksimum lokal vazodilatasyon üretmek için Ringer çözeltisini sodyum nitroprussid (28 mM) ile değiştirin. Bu maksimal vazodilatasyon aşamasında kan basıncını her ~ 3 dakikada bir ölçün ve kaydedin.
- Maksimum RBC akı platosu oluştuğunda (~5 dakika kararlı PU), deneyi sonlandırın. Sürekli veri toplamayı sonlandırmak için veri toplama yazılımının sağ alt köşesindeki durdur'u seçin.
5. Yerel ısıtma protokolü
- Hiperemiyi takiben RBC akısı stabilize olduğunda, temel veri toplamaya başlayın ve bunu veri toplama yazılım dosyasında bir yorumla belirtin. Taban çizgisinin son dakikasında, bir kan basıncı ölçümü toplayın ve değerleri bir yorumda veri toplama yazılımı dosyasına girin.
- Protokolün ihtiyaçlarına bağlı olarak yerel ısıtıcıları 39 °C veya 42 °C'ye yükseltin (tartışma bölümünde açıklanmıştır).
- RBC akısı, lokal ısı uygulamasına (~ 40-60 dakika ısıtma) yanıt olarak plato haline geldiğinde, N G-nitro-l-arginin metil esteri (L-NAME; Ringer çözeltisinde çözülmüş 15 mM; 2 μL / dak; bir NO sentaz inhibitörü) mikrodiyaliz probu(lar)ından geçirin.
- RBC akısı, L-NAME'ye (~15-25 dakikalık perfüzyon) yanıt olarak plato haline geldiğinde, yerel ısıtıcıları 43 °C'ye yükseltin.
- RBC akısı 43 ° C'ye yanıt olarak plato haline geldiğinde (~20-45 dakikalık ısıtmadan sonra ~ 2-5 dakikalık bir plato meydana gelir), mikrodiyaliz probu(lar)ı aracılığıyla sodyum nitroprussid (Ringer çözeltisinde çözünmüş 28 mM) perfüze edin.
- Maksimum RBC akı platosu oluştuğunda (~5 dakika kararlı PU), deneyi sonlandırın. Veri toplamayı sonlandırmak için veri toplama yazılımının sağ alt köşesindeki durdur'u seçin.
6. Mikrodiyaliz problarının çıkarılması
- Deneyin sona ermesinin ardından, mikrodiyaliz problarını kesmek için bir çift cerrahi makas kullanın. LDF problarını ısıtıcılardan dikkatlice çıkarın ve ısıtıcıları ciltten çıkarın. Probları cilt üzerinde yerinde tutan bandı nazikçe çıkarın.
- Probun her iki tarafındaki hangi delinme bölgesinin en küçük kan pıhtısını oluşturduğunu görsel olarak belirleyin. Probun bölgeye yakın kısmını daha küçük pıhtı ile kesin ve probun ~1 inç'ini cildin dışında kesilmeden bırakın.
- Probun giriş ve çıkış bölgelerini çevreleyen derinin bir kısmını alkollü bir çubukla ve daha az pıhtılaşmış bölgede kalan probun ~1 uzunluğundaki kısmını temizleyin.
- Alkolün ciltte kurumasını bekleyin. Ardından, probun delinme bölgesinden daha büyük pıhtı ile uzanan kısmını, daha az pıhtılaşmış uçtaki ~1 in kısmının karşısına kavrayın. Probu yavaşça daha büyük kan pıhtısına doğru çekin.
- Probun çıkarılmasından kaynaklanan herhangi bir kanamanın üzerine steril gazlı bez yerleştirin ve basınç uygulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Asetilkolin doz-yanıt protokolü
Şekil 1A , ACh doz-yanıt protokolünü detaylandıran bir şemayı göstermektedir. Şekil 1B , zaman içinde bir denek için standartlaştırılmış ACh doz-yanıt protokolünden RBC akı değerlerinin (perfüzyon birimleri, PU; 30 s ortalamaları) temsili izlerini göstermektedir. Şekil 1C , bir ACh doz-yanıt protokolünün ham veri dosyasını göstermektedir. Ham veri dosyasında ek temel ölçümler tutuldu, ancak veri analizi için yalnızca ~ 10 dakikalık taban çizgisi kullanıldı.
Hiperemi çözünürlüğünü ve 5 dakika boyunca stabil bir RBC akısını takiben, 10 dakikalık temel veri toplama başlayabilir. Taban çizgisi, sapmaların herhangi bir nedeninin (örneğin, hareket artefaktları, prob ayarlamaları) analiz amacıyla veri toplama yazılımı yorumları olarak kaydedilmesi gereken nispeten kararlı bir yatay RBC akı çizgisi olarak tasvir edilir. Doz-yanıt protokolü başlangıç dönemini takip eder ve şırıngalar her dozda 10−10 M'den 10−1 M ACh'ye değiştirilmelidir. Her dozun 5-10 dakikalık perfüzyonuna başlamadan önce, farmakolojik ajanın lif uzunluğu boyunca tamamen perfüze olduğundan emin olunmalıdır. Veri toplama yazılımında, perfüzyon nedeniyle RBC akışında başlangıçta bir artış olacaktır, ancak bu konsantrasyon için 5 dakikalık veri toplama başlamadığı için bu analizlere dahil edilmemiştir. Her doz için perfüzyon başladıktan sonra, RBC akışında zirveye kadar sürekli bir artış olacak ve ardından sabit bir düşüş olacaktır. Farmakolojik ajanlara verilen bu eğrisel yanıt, protokol boyunca tekrarlanacaktır, ancak RBC akısı, artan ACh konsantrasyonları ile nispeten daha büyük olacaktır. Daha düşük ACh konsantrasyonlarında, eğrisel yanıt o kadar belirgin olmayabilir. Optimal olmayan RBC akısı örnekleri şunları içerir: 1) RBC akısının artmadığı ve plato halinde kaldığı eğrisel olmayan bir yanıt veya 2) RBC akısı üzerinde minimum etkiye sahip artan ACh konsantrasyonları, RBC akısının her ACh konsantrasyonu ile nispeten artmadığı durumlarda. Bu, araştırma sorusuna ve test edilen klinik kohorta bağlıdır.
ACh'nin son konsantrasyonunu takiben, laktasyonlu Ringer'ler perfüze edilir ve yerel ısıtıcılar 43 °C'ye çıkarılır. Bu aşamada, sodyum nitroprussid perfüze edilmeden önce bir plato elde edilmelidir. Bu, perfüze edilen önceki ajanlara bağlı olarak ~ 45 dakika kadar sürebilir. Bu aşama analizlere dahil edilmemiştir. Plato 5 dakika boyunca elde edildikten sonra, maksimum lokal vazodilatasyon üretmek için sodyum nitroprussid perfüze edilir. Bu maksimal lokal vazodilatasyon, ~ 20 dakikalık perfüzyondan sonra bir plato elde edildiği RBC akısında bir artış veya RBC akısının zirveye ulaşması ve hemen ardından azalması olarak tasvir edilir. Sodyum nitroprussid için RBC akışında bir plato veya düşüş elde edildiğinde, protokol tamamlanır. Optimal olmayan RBC akısının yaygın bir örneği, maksimum lokal vazodilatasyon sırasında değil, protokolün farklı bir aşamasında (örneğin, doz-yanıt protokolü sırasında) elde edilen RBC akısının en yüksek değeridir.
Asetilkolin doz-yanıt protokolü: Nitrik Oksit sentaz inhibisyonu
NO'nun ACh'ye yanıt olarak kutanöz kan akışına katkısını ölçmek için, bir NO sentaz inhibitörü olan N G-nitro-l-arginin metil ester (L-NAME), ek bir lif yoluyla ACh ile kombinasyon halinde perfüze edilir. Şekil 2A, L-NAME ile ACh doz-yanıt protokolünü detaylandıran bir şemayı göstermektedir. Şekil 2B, L-NAME ile zaman içinde bir denek için standartlaştırılmış ACh doz-yanıt protokolünden RBC akısının (30 s ortalamaları) temsili izlerini göstermektedir. Şekil 2C, L-NAME ile bir ACh doz-yanıt protokolünün ham veri dosyasını göstermektedir. Ham veri dosyasında ek temel ölçümler tutuldu, ancak veri analizi için yalnızca ~ 10 dakikalık taban çizgisi kullanıldı.
Hiperemi çözünürlüğünü, 5 dakika boyunca stabil bir RBC akışını ve ilgilenilen enzimatik yolu (örneğin, NO sentaz) tamamen bloke etmek ve / veya yeterli konsantrasyonlarda ko-faktör sağlamak için yeterli süreyi takiben, 10 dakikalık temel veri toplama başlayabilir (nispeten kararlı bir yatay çizgi olarak gösterilir). Doz-yanıt protokolü taban çizgisini takip eder ve şırıngalar, NO sentaz inhibitörü ile 1010 M'den 101 M ACh'ye başlayan her dozda değiştirilmelidir (ör., 15 mM L-NAME). Bir NO sentaz inhibitörünün varlığında, eğrisel yanıt, daha yüksek ACh konsantrasyonlarına kadar iyi bir şekilde kopyalanmaz. NO sentaz inhibisyonu olmayan bir bölgeye kıyasla nispeten daha düşük bir RBC akısı gözlenecektir. Optimal olmayan RBC akısının yaygın bir örneği, NO sentaz inhibisyonu olmayan koşullara kıyasla NO sentaz inhibisyonudur ve bu da daha yüksek bir RBC akısı ile sonuçlanır. Bu, protokolün başarısız olduğunu gösterir.
ACh'nin son konsantrasyonunun perfüzyonunu takiben, laktasyonlu Ringer'ler perfüze edilir ve yerel ısıtıcılar 43 ° C'ye çıkarılır. Bu aşamada, sodyum nitroprussid perfüze edilmeden önce bir plato elde edilmelidir. Bu aşama analizlere dahil edilmemiştir. Plato 5 dakika boyunca elde edildikten sonra, sodyum nitroprussid perfüze edilir ve maksimum lokal vazodilatasyon üretilir. Maksimal lokal vazodilatasyon sırasında, önceki NO sentaz inhibisyonuna bağlı olarak RBC akısında üstel bir artış olacaktır. ~ 20 dakikalık perfüzyondan sonra bir plato elde edilecek veya RBC akısı mutlak zirvesine ulaşacak ve hemen ardından düşecektir. Sodyum nitroprussid için RBC akışında bir plato veya düşüş elde edildiğinde, protokol tamamlanır. Optimal olmayan RBC akısının yaygın bir örneği, maksimum lokal vazodilatasyon sırasında değil, protokolün farklı bir aşamasında (örneğin, doz-yanıt protokolü sırasında) en yüksek RBC akı değerinin elde edilmesidir.
Yerel ısıtma protokolü
Şekil 3A , yerel ısıtma protokolünü detaylandıran bir şemayı göstermektedir. Şekil 3B , zaman içinde bir denek için standartlaştırılmış yerel ısıtma protokolü için RBC akısının (30 s ortalamaları) temsili izlerini göstermektedir. Şekil 3C , yerel bir ısıtma protokolünün ham veri dosyasını göstermektedir. Hiperemi çözünürlüğünü ve 5 dakika boyunca stabil bir RBC akışını takiben, 10 dakikalık temel veri toplama başlayabilir (nispeten kararlı bir yatay çizgi olarak gösterilir). Yerel ısıtıcılar 39 °C veya 42 °C'ye ayarlanır ve RBC akışında bir ilk tepe ve nadir tepki meydana gelir. NO'nun lokal bir ısı uyaranına yanıt olarak kutanöz kan akışına katkısını ölçmek için, RBC akısında stabil bir plato elde edildikten sonra L-NAME perfüze edilir. L-NAME'e yanıt olarak yeni bir platoya ulaşana kadar RBC akışında hızlı bir düşüş olacaktır. 5 dakikalık stabil RBC akı değerlerinden sonra, laktasyonlu Ringer'ler perfüze edilir ve yerel ısıtıcılar 43 °C'ye yükseltilir. Isıtma, RBC akısında ek bir tepe ve nadir tepki üretecektir. Bu aşamada, sodyum nitroprussid perfüze edilmeden önce bir plato elde edildiğinden emin olunmalıdır. Bu aşama analizlere dahil edilmemiştir. Lokal maksimal vazodilatasyonu indüklemek için, sodyum nitroprussid perfüze edilir ve RBC akısında hızlı bir artış meydana gelir. Sodyum nitropruside yanıt olarak RBC akışında bir plato veya düşüş gözlendiğinde, protokol tamamlanır.
Şekil 1: Asetilkolin (ACh) doz-yanıt protokolü. (A) Bir ACh doz-yanıt protokolünün şeması. (B) Bir ACh doz-yanıt protokolünün temsili izlemesi (30 s ortalamaları). (C) Bir ACh doz-yanıt protokolünün ham verileri. Stabilizasyondan önceki dalgalanmaları göstermek için ham veri dosyasında ek temel ölçümler tutulur, ancak veri analizi için yalnızca ~10 dakikalık kararlı dinlenme verileri kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nitrik Oksit (NO) sentaz inhibisyonu ile ACh doz-yanıt protokolü. (A) NO sentaz inhibisyonu olan bir ACh doz-yanıt protokolünün şeması. (B) NO sentaz inhibisyonu ile bir ACh doz-yanıt protokolünün temsili izlenmesi. (C) NO sentaz inhibisyonu olan bir ACh doz-yanıt protokolünün ham verileri. Stabilizasyondan önceki dalgalanmaları göstermek için ham veri dosyasında ek temel ölçümler tutulur, ancak veri analizi için yalnızca ~10 dakikalık kararlı dinlenme verileri kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yerel ısıtma protokolü. (A) Yerel ısıtma protokolünün şeması. (B) Yerel bir ısıtma protokolünün temsili takibi. (C) Yerel bir ısıtma protokolünün ham verileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İntradermal mikrodiyaliz tekniği, insan vasküler araştırmalarında çok yönlü bir araçtır. Müfettişler, uygulamalarını daha da çeşitlendirmek için protokolü değiştirebilir. Örneğin, bir ACh doz-yanıt protokolünü tanımlıyoruz, ancak tek başına vazodilatasyondan ziyade vazokonstriksiyon veya vazomotor ton mekanizmalarına ilişkin diğer araştırmalar, norepinefrin veya sodyum nitroprussid doz-yanıt yaklaşımlarınıkullanmıştır 26,27,28,29,30,31. Mentol veya metaklor klorür gibi diğer vazodilatasyon aracıları da doz-yanıt protokolündekullanılmıştır 31,32. Vasküler fonksiyonun farmakolojik bir değerlendirmesi olarak doz-yanıt protokolü, termal uyaranlara sempatik yanıttaki varyasyonları ortadan kaldırdığı için, lokal ısıtma protokolüne kıyasla spesifik sinyal mekanizmalarını izole etmek için daha hedefli, mekanik bir tekniktir. Bununla birlikte, lokal ısıtma, hem nörojenik hem de endotel bağımlı mekanizmalar yoluyla vazodilatasyonu indüklemek için fizyolojik bir uyaran kullanan uygun maliyetli bir yaklaşımdır. 39 °C veya 42 °C yerel ısıtma protokolü arasında seçim yaparken ilgili mekanizmayı dikkate almak da önemlidir. 39 °C protokolünün NO aracılı vazodilatasyonu daha iyi izole ettiği öne sürülürken, 42 °C protokolü hem NO aracılı vazodilatasyonun hem de endotel kaynaklı hiperpolarize edici faktör aracılı vazodilatasyonunaraştırılmasına izin verir 33,34. Ek olarak, 42 °C'lik yerel ısıtmaya yanıt olarak CVC artışı daha sağlam olma eğilimindedir (yani, daha yüksek bir %CVCmax34'e ulaşır). Bununla birlikte, belirli bir sinyal yolunu sorgulamak için yeni bir ajan kullanırken, kofaktörlerin etkinliğini (yani tamamen bloke edici) ve / veya doymuş konsantrasyonlarını değerlendirmek için titiz yöntemler kullanılmalıdır.
Endotel fonksiyonu genellikle akış aracılı dilatasyon tekniği kullanılarak ölçülür, ancak mikrovasküler yataklarda endotel disfonksiyonu, özellikle HTN 6,7,8 gibi patolojilerde, büyük kanal arterlerinde endotel disfonksiyonundan önce veya bağımsız olarak ortaya çıkabilir. Ayrıca, akım aracılı dilatasyon tekniği, endotel disfonksiyonunun patofizyolojisinin sistemik etkilerden izole olarak farmakolojik diseksiyonuna izin vermez. İyontoforez veya tıkayıcı sonrası reaktif hiperemi gibi mikrovasküler endotel fonksiyonunu araştırmak için kullanılan diğer yöntemler, farmakolojik müdahale ile endotel fonksiyon mekanizmalarını tam olarak hedefleyememektedir12. Bu nedenle, intradermal mikrodiyaliz, vasküler fonksiyon mekanizmalarına yönelik hedefli araştırmalara benzersiz bir şekilde izin verir ve kullanımı, akış aracılı dilatasyon sonuçlarıyla birlikte, sistemik vasküler fonksiyonun daha bütünsel bir resmini sağlayabilir.
Hangi intradermal mikrodiyaliz yaklaşımı kullanılırsa kullanılsın, yanıtların geçerliliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için belirli önlemler alınmalıdır. Deneysel protokolün özellikleri belirli araştırma sorularını yanıtlamak için ayarlanabilirken, mikrodiyaliz probunun kesin yerleşimi kesinlikle kritiktir. Probu dermise sokmak ve cildin daha büyük, görünür veya palpe edilebilir kan damarlarından kaçınmak için özen gösterilmelidir. Bu damarların delinmesi anormal derecede düşük perfüzyon birim değerlerine neden olur; Bu durumda, lazer Doppler flowmetrisi, kırmızı kan hücrelerinin sağlam bir damardan akışından ziyade hematom oluşumunu ölçecektir. Bundan sonra, bu protokolün bir sonraki en kritik adımı, iğne delinmesine hiperemik yanıtın çözülmesidir. Hiperemik yanıtın tamamen azalmasına izin verilmezse, protokolün başlangıç ve erken kısımları boyunca kaydedilen perfüzyon birimleri gerçek dinlenme değerlerinden daha büyük olacaktır. Yeterli iyileşme süresine izin verilmişse ancak perfüzyon üniteleri anormal derecede yüksek kalıyorsa, temel veri toplama aşamasına başlamadan önce probların yeniden kalibrasyonu gerekebilir.
İntradermal mikrodiyaliz tekniğinin bir sınırlaması, vasküler sinyal yollarını değerlendirmek için bir doku tipini spesifik olarak izole edememesidir. Derinin damarları in vivo olarak diseke edilemediğinden ve görüntülenemediğinden, bir mikrodiyaliz probunun yarı geçirgen kısmının ilgilenilen dokuya (örneğin vasküler endotel) hemen bitişik olmasını sağlamanın bir yolu yoktur. Bu nedenle, bu teknikten elde edilen sonuçlar, insan fizyolojisinin bütünleştirici doğasını temsil eder ve endotelyal, vasküler düz kas ve lokal kan akışı üzerindeki sinirsel etkilerin kolektif işlevi hakkında fikir verir. Bununla birlikte, yerel bir ısıtma protokolü kullanılıyorsa, RBC akısının 39 ° C veya 42 ° C'ye kadar ısıdaki ilk artışta bir platoya ulaşmasına izin vermek, aksonal refleksin ısıya çözülmesine izin verir, bu da daha sonra başka bir yerde tartışıldığı gibi öncelikle endotel aracılı bir yanıta izin verir35. Bu tekniğin ek bir sınırlaması, cilt kan akışının bir indeksi olarak lazer Doppler akış ölçerin kullanılmasıdır. Lazer Doppler flowmetrisi, mutlak akışı ölçmek için gerekli olduğu gibi, damar çapındaki değişiklikleri (yani mikrovaskülatürün genişlemesi) hesaba katmayan kırmızı kan hücresi akışını ölçer. Katılımcılar arası veya koşullar arasındaki farklılıklara duyarlı olabilir36. İntradermal mikrodiyalizin gelecekteki uygulamaları, mutlak mikrovasküler kan akışını ölçmek için teknikler içerebilir. Örneğin, optik koherens tomografinin son gelişimi, cilt mikrovaskülatürünün üç boyutlu görüntülemesini kullanarak damar çapının ölçülmesine izin verir13. İntradermal mikrodiyaliz tekniği, cilt rahatsızlıkları olan katılımcıları, burada açıklanan maddelerle ilgili alerjisi olan katılımcıları, şiddetli tripanofobisi olan katılımcıları ve önkolun ventral yönünün tamamını kaplayan dövmeleri olan katılımcıları içeren ancak bunlarla sınırlı olmayan çok az ancak önemli durumlarda kontrendikedir (ancak bu bölgedeki küçük dövmeler dışlayıcı değildir).
Mikrodiyaliz yaklaşımının altta yatan patofizyolojik mekanizmaları izole etmeye ve tanımlamaya yardımcı olma konusundaki benzersiz yeteneği, diğer KVH'lerin yanı sıra HTN'nin değişken etiyolojisini araştırmak için onu avantajlı kılmaktadır. Protokol optimizasyonunu takiben, bu teknik yeni KVH tedavilerinin etkinliğinin değerlendirilmesine izin verir. Ayrıca, intradermal mikrodiyaliz, varsayımsal olarak ilgisiz farmakoterapilerin hedef dışı etkilerini değerlendirmek için bir yöntem sağlar ve bu da onu daha büyük ölçekli klinik araştırmaları bilgilendirmek için oldukça değerli bir araç haline getirir. Birlikte ele alındığında, bu teknik mikrovasküler araştırmalarda paha biçilmez bir varlıktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur ve ifşa edecek hiçbir şeyi yoktur.
Acknowledgments
Hiç kimse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
References
- Xu, J. Q., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Arias, E.
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93 (2023).
- Cohuet, G., Struijker-Boudier, H. Mechanisms of target organ damage caused by hypertension: Therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 111 (1), 81-98 (2006).
- Park, K. H., Park, W. J. Endothelial dysfunction: Clinical implications in cardiovascular disease and therapeutic approaches. Journal of Korean Medical Science. 30 (9), 1213-1225 (2015).
- Levy, B. I., Ambrosio, G., Pries, A. R., Struijker-Boudier, H. A. Microcirculation in hypertension: a new target for treatment. Circulation. 104 (6), 735-740 (2001).
- Sara, J. D., et al. Prevalence of coronary microvascular dysfunction among patients with chest pain and nonobstructive coronary artery disease. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Interventions. 8 (11), 1445-1453 (2015).
- Weis, M., Hartmann, A., Olbrich, H. G., Hör, G., Zeiher, A. M. Prognostic significance of coronary flow reserve on left ventricular ejection fraction in cardiac transplant recipients. Transplantation. 65 (1), 103-108 (1998).
- Rossi, M., et al. Investigation of skin vasoreactivity and blood flow oscillations in hypertensive patients: Effect of short-term antihypertensive treatment. Journal of Hypertension. 29 (8), 1569-1576 (2011).
- Pepine, C. J., et al. Coronary microvascular reactivity to adenosine predicts adverse outcome in women evaluated for suspected ischemia results from the National Heart, Lung and Blood Institute WISE (Women's Ischemia Syndrome Evaluation) study. Journal of the American College of Cardiology. 55 (25), 2825-2832 (2010).
- Matsuda, J., et al. Prevalence and clinical significance of discordant changes in fractional and coronary flow reserve after elective percutaneous coronary intervention. Journal of the American Heart Association. 5 (12), e004400 (2016).
- Gupta, A., et al. Integrated noninvasive physiological assessment of coronary circulatory function and impact on cardiovascular mortality in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 136 (24), 2325-2336 (2017).
- Roustit, M., Cracowski, J. L. Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 373-384 (2013).
- Low, D. A., Jones, H., Cable, N. T., Alexander, L. M., Kenney, W. L. Historical reviews of the assessment of human cardiovascular function: interrogation and understanding of the control of skin blood flow. European Journal of Applied Physiology. 120 (1), 1-16 (2020).
- Kenney, W. L., Cannon, J. G., Alexander, L. M. Cutaneous microvascular dysfunction correlates with serum LDL and sLOX-1 receptor concentrations. Microvascular Research. 85, 112-117 (2013).
- Holowatz, L. A., Thompson, C. S., Minson, C. T., Kenney, W. L. Mechanisms of acetylcholine-mediated vasodilatation in young and aged human skin. Journal of Physiology. 563, 965-973 (2005).
- Sokolnicki, L. A., Roberts, S. K., Wilkins, B. W., Basu, A., Charkoudian, N. Contribution of nitric oxide to cutaneous microvascular dilation in individuals with type 2 diabetes mellitus. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 292 (1), E314-E318 (2007).
- DuPont, J. J., Ramick, M. G., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species contribute to impaired cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 306 (12), F1499-F1506 (2014).
- Sprung, V. S., et al. Nitric oxide-mediated cutaneous microvascular function is impaired in polycystic ovary syndrome but can be improved by exercise training. Journal of Physiology. 591 (6), 1475-1487 (2013).
- Greaney, J. L., Saunders, E. F. H., Santhanam, L., Alexander, L. M. Oxidative stress contributes to microvascular endothelial dysfunction in men and women with major depressive disorder. Circulatory Research. 124 (4), 564-574 (2019).
- Stanhewicz, A. E., Jandu, S., Santhanam, L., Alexander, L. M. Increased angiotensin II sensitivity contributes to microvascular dysfunction in women who have had preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 382-389 (2017).
- Greaney, J. L., et al. Impaired hydrogen sulfide-mediated vasodilation contributes to microvascular endothelial dysfunction in hypertensive adults. Hypertension. 69 (5), 902-909 (2017).
- Dillon, G. A., Stanhewicz, A. E., Serviente, C., Greaney, J. L., Alexander, L. M. Hydrogen sulfide-dependent microvascular vasodilation is improved following chronic sulfhydryl-donating antihypertensive pharmacotherapy in adults with hypertension. Journal of Physiology. 321 (4), H728-H734 (2021).
- Wong, B. J., et al. Sensory nerve-mediated and nitric oxide-dependent cutaneous vasodilation in normotensive and prehypertensive non-Hispanic blacks and whites. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (2), H271-H281 (2020).
- Dillon, G. A., Greaney, J. L., Shank, S., Leuenberger, U. A., Alexander, L. M. AHA/ACC-defined stage 1 hypertensive adults do not display cutaneous microvascular endothelial dysfunction. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (3), H539-H546 (2020).
- Gagge, A. P., Stolwijk, J. A., Hardy, J. D. Comfort and thermal sensations and associated physiological responses at various ambient temperatures. Environmental Research. 1 (1), 1-20 (1967).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Lack of limb or sex differences in the cutaneous vascular responses to exogenous norepinephrine. Journal of Applied Physiology. 117 (12), 1417-1423 (2014).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Impaired increases in skin sympathetic nerve activity contribute to age-related decrements in reflex cutaneous vasoconstriction. Journal of Physiology. 593 (9), 2199-2211 (2015).
- Alba, B. K., Greaney, J. L., Ferguson, S. B., Alexander, L. M. Endothelial function is impaired in the cutaneous microcirculation of adults with psoriasis through reductions in nitric oxide-dependent vasodilation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (2), H343-H349 (2018).
- Greaney, J. L., Surachman, A., Saunders, E. F. H., Alexander, L. M., Almeida, D. M. Greater daily psychosocial stress exposure is associated with increased norepinephrine-induced vasoconstriction in young adults. Journal of the American Heart Association. 9 (9), e015697 (2020).
- Nakata, T., et al. Quantification of catecholamine neurotransmitters released from cutaneous vasoconstrictor nerve endings in men with cervical spinal cord injury. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (3), R345-R352 (2023).
- Tucker, M. A., et al. Postsynaptic cutaneous vasodilation and sweating: Influence of adiposity and hydration status. European Journal of Applied Physiology. 118 (8), 1703-1713 (2018).
- Craighead, D. H., Alexander, L. M. Menthol-induced cutaneous vasodilation is preserved in essential hypertensive men and women. American Journal of Hypertension. 30 (12), 1156-1162 (2017).
- Brunt, V. E., Minson, C. T. KCa channels and epoxyeicosatrienoic acids: Major contributors to thermal hyperaemia in human skin. Journal of Physiology. 590 (15), 3523-3534 (2012).
- Choi, P. J., Brunt, V. E., Fujii, N., Minson, C. T. New approach to measure cutaneous microvascular function: An improved test of NO-mediated vasodilation by thermal hyperemia. Journal of Applied Physiology. 117 (3), 277-283 (2014).
- Johnson, J. M., Kellogg, D. L. Jr Local thermal control of the human cutaneous circulation. Journal of Applied Physiology. 109 (4), 1229-1238 (2010).
- Jung, F., et al. Laser Doppler flux measurement for the assessment of cutaneous microcirculation-Critical remarks. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 55 (4), 411-416 (2013).
