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Biology

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और डिजिटल छवि विश्लेषण के आधार पर एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की मात्रात्मक पहचान के लिए मंच

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65643
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Shenzhen Key Laboratory of Reproductive Immunology for Peri-implantation, Shenzhen Zhongshan Institute for Reproduction and Genetics, Fertility Center, Shenzhen Zhongshan Urology Hospital, 2Shenzhen Jinxin Medical Technology Innovation Center, Co., Ltd.

Summary

यहां, एक डिजिटल इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण मंच विकसित किया गया था और आरोपण की खिड़की में आवर्तक गर्भपात वाले रोगियों के एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए मान्य किया गया था।

Abstract

आवर्तक गर्भपात (आरएम) वाले रोगियों के एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट का मूल्यांकन करने के लिए, एक डिजिटल इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण मंच विकसित किया गया था और मध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए मान्य किया गया था। मासिक धर्म चक्र के मध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान सभी एंडोमेट्रियम नमूने एकत्र किए गए थे। पैराफिन-एम्बेडेड एंडोमेट्रियल ऊतकों को 4 माइक्रोन मोटी स्लाइड में विभाजित किया गया था, और सीडी 56 + यूएनके कोशिकाओं, फॉक्सपी 3 + ट्रेग्स, सीडी 163 + एम 2 मैक्रोफेज, सीडी 1 ए + डीसी, और सीडी 8 + टी कोशिकाओं सहित एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) धुंधला हो गया था। पैनोरमिक स्लाइड्स को डिजिटल स्लाइड स्कैनर का उपयोग करके स्कैन किया गया था और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक वाणिज्यिक छवि विश्लेषण प्रणाली का उपयोग किया गया था। एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना कुल एंडोमेट्रियल कोशिकाओं में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके की गई थी। वाणिज्यिक छवि विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करना, एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक मूल्यांकन, जो पारंपरिक छवि विश्लेषण के साथ विश्लेषण करना मुश्किल या असंभव है, आसानी से और सटीक विश्लेषण किया जा सकता है। इस पद्धति को एंडोमेट्रियम माइक्रोएन्वायरमेंट को मात्रात्मक रूप से चिह्नित करने के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत और विभिन्न प्रजनन विफलता रोगियों के लिए इसकी विषमता शामिल है। एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए मंच आरएम रोगियों के निदान और उपचार के लिए महत्वपूर्ण नैदानिक महत्व का हो सकता है।

Introduction

आवर्तक गर्भपात (आरएम) दो या दो से अधिक लगातार गर्भधारण का नुकसान है और हाल के वर्षों में चिकित्सकों का ध्यान आकर्षित करने वाली एक जटिल बीमारी है। प्रसव उम्र की महिलाओं में आरएम की घटना दर 1% -5% है 1. पिछले अध्ययनों के परिणाम बताते हैं कि प्रतिरक्षा कारक आरएम 2,3,4,5 के रोगजनन के साथ निकटता से जुड़े हुए हैं। भ्रूण आरोपण और विकास के लिए मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस पर प्रतिरक्षा होमियोस्टेसिस बनाए रखना आवश्यक है। एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाएं इस होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए कई नियामक भूमिकाएं करती हैं, जैसे कि ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण को बढ़ावा देना, सर्पिल धमनियों को फिर से तैयार करना और प्लेसेंटा विकास 6,7,8,9 में योगदान देना।

आरएम के साथ महिलाओं में असामान्य एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं को पहले रिपोर्ट किया गया है। परिणाम गर्भाशय प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (यूएनके) के उच्च घनत्व और आरएम10,11,12 की घटना के बीच घनिष्ठ संबंध दिखाते हैं। मैक्रोफेज की एक वृद्धि हुई संख्या आरएम के साथ महिलाओं के एंडोमेट्रियम में सूचित किया गया है, जो एक जीवित जन्मथा 13 की तुलना में. नियामक टी कोशिकाओं (Treg) भ्रूण की ओर मातृ प्रतिरक्षा सहिष्णुता में एक भूमिका निभाते हैं, और उनके स्तर और समारोह आरएम रोगियों14 के decidua में कमी आई है. साइटोटॉक्सिसिटी टी कोशिकाओं (सीटीएल) और वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) भी गर्भावस्था15,16 की प्रतिरक्षा विनियमन में एक भूमिका निभाते हैं. इसलिए, मध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान स्थानीय एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक व्यापक मात्रात्मक विश्लेषण आरएम के रोगजनन को बेहतर ढंग से समझने में मदद कर सकता है। एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कुछ मौजूदा तरीकों प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करें जो कई मार्करों17,18 के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सटीक रूप से लेबल कर सकते हैं। हालांकि, प्रवाह साइटोमेट्री का नैदानिक अनुप्रयोग सीमित है क्योंकि यह केवल ताजा ऊतक पर किया जा सकता है। ताजा ऊतक प्राप्त करना केवल तभी संभव है जब अतिरिक्त ट्यूमर की एक बड़ी मात्रा उपलब्ध हो, एंडोमेट्रियम के लिए एक दुर्लभ घटना। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ऊतक आकृति विज्ञान को सीटू में अच्छी तरह से देख सकती है और विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भी लेबल कर सकती है, जबकि पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल तकनीक प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण नहीं कर सकती है।

पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रयोगों की तुलना में, एंडोमेट्रियम में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मात्रात्मक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण का महत्वपूर्ण नैदानिक महत्व है। आईएचसी तीव्रता स्कोरिंग आमतौर पर एक चार बिंदु पैमाने पर या मजबूत और पैथोलॉजिकल निदान और अनुसंधान 19,20,21 में कमजोर पर रैंक किया जाता है. हालांकि, इस अर्द्ध मात्रात्मक तकनीक व्यक्तिपरक, अत्यधिक गलत है, और महत्वपूर्ण इंट्रा पर्यवेक्षक और अंतर-पर्यवेक्षक परिवर्तनशीलता22 प्रदर्शित करता है. एक संभावित समाधान मशीन सीखने का अनुप्रयोग है, जो मूल्यवान हैडिजिटल छवि विश्लेषण23,24. मात्रात्मक माप प्रदान करके, यह दृष्टिकोण गर्भाशय के ऊतकों के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ, वितरण और घनत्व का अधिक सटीक मूल्यांकन सक्षम बनाता है। यह मात्रात्मक जानकारी मासिक धर्म चक्र के दौरान और विभिन्न रोग स्थितियों में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी में गतिशील परिवर्तनों को स्पष्ट करने में मदद कर सकती है। कुल मिलाकर, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से एंडोमेट्रियम में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण करने की क्षमता गर्भाशय के प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।

इसलिए, प्रोटोकॉल का उद्देश्य आरएम रोगियों में मध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान यूएनके कोशिकाओं, ट्रेग्स, मैक्रोफेज, डीसी और साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं सहित एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए एक डिजिटल इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण मंच को विकसित और मान्य करना है।

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Protocol

अनुसंधान सामग्री और प्रोटोकॉल नैतिक समीक्षा की गई है और शेन्ज़ेन Zhongshan मूत्रविज्ञान अस्पताल के अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है. अध्ययन में शामिल सभी महिलाओं (20- 40 वर्ष) ने नमूना संग्रह और उपयोग के लिए सूचित सहमति प्रदान की।

1. पैथोलॉजिकल ऊतक का अधिग्रहण

  1. ऊतक कटाई के लिए उपकरण तैयार करें, अर्थात्, मापने, शासक, चिमटी, एम्बेडिंग कैसेट, एम्बेडिंग पेपर और टिशू बास्केट।
  2. निरीक्षण करें कि क्या एंडोमेट्रियल ऊतक (मूंग की फलियों से बड़ा) की मात्रा, एक पिपेल कैथेटर के साथ एक मानक दृष्टिकोण का उपयोग करके एकत्र की जाती है, पर्याप्त है।
  3. एंडोमेट्रियल ऊतक को फॉर्मेलिन से ट्वीजर के साथ एम्बेडिंग पेपर पर स्थानांतरित करें और एक शासक के साथ एंडोमेट्रियल ऊतक आयामों को मापें।
  4. एंडोमेट्रियल ऊतक को एम्बेडिंग पेपर के साथ लपेटें और एक एम्बेडिंग कैसेट में रखें।
  5. निर्जलीकरण के लिए ऊतक टोकरी में एम्बेडिंग कैसेट रखें।

2. ऊतक निर्जलीकरण

  1. ऊतक टोकरी को निर्जलीकरण के प्रतिक्रिया कक्ष में रखें ( सामग्री की तालिकादेखें) और नियमित ऊतक निर्जलीकरण के लिए प्रक्रिया शुरू करें: 100 मिनट के लिए फॉर्मेलिन; 100 मिनट के लिए फॉर्मेलिन; 60 मिनट के लिए 75% शराब; 60 मिनट के लिए 85% शराब; 60 मिनट के लिए 95% शराब; 60 मिनट के लिए 100% शराब; 60 मिनट के लिए 100% शराब; 60 मिनट के लिए 100% शराब; 35 मिनट के लिए ज़ाइलीन; 20 मिनट के लिए ज़ाइलीन; 20 मिनट के लिए ज़ाइलीन; 80 मिनट के लिए मोम; 80 मिनट के लिए मोम; 80 मिनट के लिए मोम। प्रक्रिया में लगभग 15 घंटे लगते हैं।
  2. ऊतक निर्जलीकरण प्रक्रिया के अंत में, निर्जलीकरण की प्रतिक्रिया कक्ष खोलें, ऊतक टोकरी को हटा दें।

3. ऊतक एम्बेडिंग

  1. नमूने के आकार के अनुसार एक उपयुक्त एम्बेडिंग मोल्ड निकालें, और 70 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन मोम से भरें।
  2. जल्दी से ऊतक को मोल्ड में रखें और ध्यान से समायोजित करें ताकि ऊतक मोल्ड के केंद्र में स्थित हो।
  3. मोल्ड को आसानी से कूलिंग प्लेट में ले जाएं और नीचे सेट होने पर पैराफिन को धीरे से दबाएं।
  4. मोल्ड के ऊपर एम्बेडिंग कैसेट लगाएं और अधिक मोम के साथ ऊपर रखें।
  5. मोल्ड को कूलिंग प्लेट पर रखें, और जब पैराफिन पूरी तरह से जम जाए, तो ब्लॉक को उसके संलग्न कैसेट के साथ मोल्ड से दूर हटा दें।

4. ऊतक वर्गों

  1. माइक्रोटोम के नमूना क्लिप पर ब्लॉक डालें, ब्लेड को धारक में रखें, ब्लॉक के विमान और ब्लेड के बीच के कोण को समायोजित करें, अनुभाग की मोटाई को 4 माइक्रोन तक समायोजित करें, हाथ पहिया को चालू करें, और टुकड़ा करने की क्रिया शुरू करें।
  2. ब्लॉक से कुछ पतली वर्गों को काटने के द्वारा उपयुक्त ऊतक सतह बेनकाब. ब्रश के साथ निरंतर और पूर्ण वर्गों को बाहर निकालें।
  3. जब पर्याप्त वर्गों में कटौती कर रहे हैं, हाथ पहिया मोड़ बंद करो, चिमटी के साथ सामने के अंत में अयोग्य वर्गों को हटा दें, और चिमटी और ब्रश के साथ पानी के स्नान में 42 डिग्री सेल्सियस पानी की सतह पर वर्गों तैर.
  4. वर्गों को पूरी तरह से चपटा करने के बाद, विरोधी टुकड़ी स्लाइड पर वर्गों को चुनें और 60 मिनट के लिए सेंकना करने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक स्लाइड गर्म करने के लिए स्थानांतरण।
  5. जब बेकिंग समाप्त हो जाए, तो ग्लास स्लाइड को गर्म स्लाइड से बाहर निकालें।

5. इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला हो जाना

  1. एंटीबॉडी मंदक के साथ एक कार्यशील समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला। विवरण के लिए तालिका 1 देखें।
  2. पतला एंटीबॉडी समाधान को एक विशेष अभिकर्मक बोतल में डालें और एक स्वचालित आईएचसी धुंधला उपकरण के अभिकर्मक डिब्बे में डिटेक्शन किट डालें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. स्लाइड्स को एक स्लाइड धारक पर रखें, एक विशेष कवरटाइल के साथ कवर किया गया है, और उन्हें उपकरण के प्रयोगात्मक प्रतिक्रिया डिब्बे में डालें।
  4. उपकरण स्वचालित रूप से स्लाइड पर अभिकर्मक और प्रयोगात्मक जानकारी को पहचानने के बाद, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला शुरू करने के लिए स्टार्ट बटन पर क्लिक करें। प्रयोग लगभग 3 घंटे तक रहता है।

6. निर्जलीकरण और स्लाइड की सीलिंग

  1. इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने के बाद, स्लाइड धारक को बाहर निकालें, विशेष कवरटाइल को उतारें, सना हुआ स्लाइड को स्लाइड धारक में डालें, और स्लाइड पर शेष डाई को साफ पानी से धो लें।
  2. स्लाइड धारक को एक स्वचालित कवरस्लिपर में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिकादेखें), निर्जलीकरण और सीलिंग प्रक्रिया का चयन करें और चलाएं।
  3. निर्जलीकरण और सील के बाद स्लाइड बाहर निकालें.

7. स्कैनिंग स्लाइड

  1. पैनोरमिक पैथोलॉजिकल इमेज स्कैनर के स्लाइड रैक पर स्लाइड्स रखें ( सामग्री की तालिकादेखें) और इसे पैनोरमिक पैथोलॉजिकल इमेज स्कैनिंग के लिए इंस्ट्रूमेंट स्लाइड स्कैनिंग कम्पार्टमेंट में रखें। स्कैनिंग में 2 मिनट लगते हैं। चित्र 1 देखें।

8. छवियों का विश्लेषण

  1. छवि आयात करें
    1. पैथोलॉजिकल इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें) और एक नया फ़ोल्डर बनाएं। आयात immunohistochemical छवियों का विश्लेषण किया जा करने के लिए.
  2. एक ऊतक क्लासिफायरियर बनाएँ
    1. क्रमशः ऊतक और रिक्त क्षेत्र की पहचान करने के लिए एक क्लासिफायरियर को प्रशिक्षित करने और स्थापित करने के लिए कई ऊतकों और रिक्त एनोटेशन को चिह्नित करें।
    2. मार्क एनोटेशन के दौरान वास्तविक समय में सॉफ़्टवेयर की पहचान क्षमता का निरीक्षण करने के लिए रीयल-टाइम ट्यूनिंग का उपयोग करें। यदि मान्यता समय पर नहीं है, तो टिप्पणी एनोटेशन और ऊतक पहचान सटीक होने तक फिर से प्रशिक्षित करें।
  3. विश्लेषण एल्गोरिथ्म बनाएँ
    1. प्रयोग के प्रकार के अनुसार सॉफ्टवेयर में मानक एल्गोरिथ्म का चयन करें: मल्टीप्लेक्स IHC.
    2. विशिष्ट नकारात्मक और सकारात्मक पिक्सेल का चयन करके सेल पहचान के रंग पैरामीटर सेट करें।
      इस आधार पर, नाभिक, साइटोप्लाज्म और कोशिका झिल्ली के मापदंडों को सेट करें, और वास्तविक समय में सेल मान्यता की स्थिति का निरीक्षण करें जब तक कि छवि के लिए सबसे उपयुक्त पैरामीटर नहीं मिल जाते।
    3. सकारात्मक सेल मान्यता सीमा निर्धारित करें और वास्तविक समय में मान्यता की स्थिति का निरीक्षण करें जब तक कि उचित सीमा समायोजित न हो जाए।
    4. एल्गोरिथ्म में ऊतक क्लासिफायरियर का चयन करें, और ऊतक क्लासिफायरियर में ऊतक भाग की जांच करें, ताकि ऊतकों के आधार पर कोशिकाओं की पहचान की जा सके। इस बिंदु पर, एक विश्लेषण एल्गोरिथ्म की स्थापना पूरी हो गई है।
  4. छवि विश्लेषण चलाएँ
    1. विश्लेषण क्षेत्र का चयन करें। छवियों का विश्लेषण करने के लिए स्थापित एल्गोरिथ्म का उपयोग करें।
  5. सॉफ्टवेयर विश्लेषण का विश्लेषण समाप्त होने के बाद, मैन्युअल रूप से जांचें कि क्या छवि पहचान सटीक है, जिसमें ऊतक पहचान, नकारात्मक और सकारात्मक सेल पहचान शामिल है।
  6. यदि छवि पहचान सटीक नहीं है, तो एल्गोरिथ्म और पैरामीटर थ्रेशोल्ड को फिर से समायोजित करें, और सफलता तक छवि विश्लेषण को फिर से चलाएं। विश्लेषण के परिणाम निर्यात करें। चित्र 1 देखें।
  7. उपरोक्त चरणों के अनुसार अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं का भी विश्लेषण किया जा सकता है (चित्र 1 देखें)। विभिन्न एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा मार्करों (CD56 + uNK कोशिकाओं, Foxp3 + Tregs, CD68+ मैक्रोफेज, CD163 + M2 मैक्रोफेज, CD1a + DCs और CD8 + T कोशिकाओं25,26) की वास्तविक अभिव्यक्ति के अनुसार विभिन्न विश्लेषण पैरामीटर सेट करें।
  8. सॉफ्टवेयर की गणना के माध्यम से, एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अनुपात प्राप्त करें ( तालिका 2 देखें)। आवर्तक गर्भपात वाले रोगियों के एंडोमेट्रियम में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए इसका उपयोग करें।

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Representative Results

एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक मूल्यांकन करने और मानव निर्मित परिचालन गलतियों के कारण अस्थिरता को कम करने के लिए, हमने स्वचालित इम्यूनोहिस्टोकेमिकल डिटेक्शन और डिजिटल मात्रात्मक मूल्यांकन प्रणाली का उपयोग करके एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए एक डिजिटल मात्रात्मक विश्लेषण मंच स्थापित किया। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण मंच आरोपण की खिड़की में आवर्तक गर्भपात (आरएम) वाले रोगियों के एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए स्थापित किया गया था। मासिक धर्म चक्र के मध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान सभी एंडोमेट्रियम ऊतक एकत्र किए गए थे। पैराफिन-एम्बेडेड एंडोमेट्रियल ऊतकों को 4 माइक्रोन मोटी स्लाइड में विभाजित किया गया था, और आईएचसी धुंधला एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया गया था, जिसमें सीडी 56 + यूएनके कोशिकाएं, फॉक्सपी 3 + ट्रेग्स, सीडी 163 + एम 2 मैक्रोफेज, सीडी 1 ए + डीसी, और सीडी 8 + टी कोशिकाएं शामिल हैं। पैनोरमिक स्लाइड्स को डिजिटल स्लाइड स्कैनर का उपयोग करके स्कैन किया गया था, और डिजिटल छवि विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके मात्रात्मक विश्लेषण किया गया था। एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना के लिए, एंडोमेट्रियल कोशिकाओं की कुल संख्या से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करें। (चित्र 1 और चित्र 2)। आरएम (एन = 30) के साथ महिलाओं में विभिन्न एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अनुपात तालिका 2में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: मध्य-ल्यूटियल एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए योजनाबद्ध कार्यप्रवाह। नमूनों का संग्रह मासिक धर्म चक्र के मध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान किया गया था, ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच) बढ़ने के 7-9 दिनों के बाद। निर्धारण कमरे के तापमान पर 4-6 घंटे के लिए 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन में किया गया था, और फिर पैराफिन मोम में एम्बेडेड। आईएचसी धुंधला सीडी 56 + यूएनके कोशिकाओं, Foxp3 + Tregs, CD68 + मैक्रोफेज, CD163 + M2 मैक्रोफेज, CD163 + डीसी और CD8 + टी कोशिकाओं25,26 सहित मध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान एंडोमेट्रियम में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का पता लगाने के लिए प्रदर्शन किया गया था. ऊतकों को एक वाणिज्यिक स्कैनर का उपयोग करके स्कैन किया गया था और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके मात्रात्मक विश्लेषण किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सकारात्मक प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान के लिए एंडोमेट्रियल कोशिकाओं की इम्यूनोस्टेनिंग। आरएम रोगियों से एंडोमेट्रियम में सीडी 56 + यूएनके कोशिकाओं, फॉक्सपी 3 + ट्रेग्स, सीडी 68 + मैक्रोफेज, सीडी 163 + एम 2 मैक्रोफेज, सीडी 1 ए + डीसी और सीडी 8 + टी कोशिकाओं की इम्यूनोस्टेनिंग। भूरा सकारात्मक प्रतिरक्षा कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है और नीला नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राथमिक एंटीबॉडी क्लोन तनूकरण
सीडी56 123सी3 1/800
फॉक्सपी3 236ए/ई7 1/100
सीडी163 10डी6 1/1200
सीडी1ए 10 1/200
सीडी8 4ख11 1/300

तालिका 1: इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला के दौरान उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी। तालिका प्राथमिक एंटीबॉडी के क्लोन और कमजोर पड़ने को दर्शाती है।

प्रतिरक्षा मार्कर माध्यिका (%) न्यूनतम (%) अधिकतम (%) मीन (%) 5th पर्सेंटाइल (%) 95वां पर्सेंटाइल (%)
सीडी56 4.83 1.8 16.76 6.03 2.04 13.63
फॉक्सपी3 0.05 0.02 0.12 0.06 0.02 0.11
सीडी68 0.78 0.37 3.62 0.99 0.44 2.67
सीडी163 0.84 0.35 2.38 0.93 0.38 2.13
सीडी1ए 0.04 0.01 0.11 0.05 0.01 0.1
सीडी8 1.69 0.76 4.1 1.85 0.81 3.72

तालिका 2: आरएम के साथ महिलाओं में विभिन्न एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का प्रतिशत। आरएम रोगियों में सीडी 56 + यूएनके कोशिकाओं, फॉक्सपी 3 + ट्रेग्स, सीडी 68 + मैक्रोफेज, सीडी 163 + एम 2 मैक्रोफेज, सीडी 1 ए + डीसी और सीडी 8 + टी कोशिकाओं का प्रतिशत इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण मंच द्वारा गणना की गई थी।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल ने आरएम रोगियों के एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए एक डिजिटल इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण मंच स्थापित किया। यहां, आरएम रोगियों में एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट का मूल्यांकन करने के लिए छह एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा मार्करों का पता लगाया गया था।

मध्य luteal चरण के दौरान एक ग्रहणशील एंडोमेट्रियम सफल आरोपण और गर्भावस्था27,28 के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, एंडोमेट्रियल रिसेप्टिविटी का आकलन करने में प्रतिशत एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मूल्यांकन महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण, पारंपरिक रोग संबंधी तरीकों से, भविष्य कहनेवाला है, इसलिए यह नैदानिक अनुप्रयोग में मदद नहीं करता है। वर्तमान में, प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिशत के माप के लिए कोई मानकीकृत विधि नहीं है जो गर्भावस्था में इन कोशिकाओं की भूमिका को समझने में बाधा उत्पन्न करती है। पारंपरिक IHC विश्लेषण चयनित दृश्य क्षेत्रों और मैनुअल गिनती पर आधारित है. सटीक ऊतक विभाजन और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानीयकरण पारंपरिक आईएचसी के साथ मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है क्योंकि मैनुअल विश्लेषण पर्यवेक्षक पूर्वाग्रह29 के लिए अग्रणी व्यक्तिपरक है.

चयनित क्षेत्र में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के वितरण के विश्लेषण की तुलना में, एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के वितरण का विश्लेषण करने के लिए ऊतकों का मनोरम विश्लेषण अधिक सटीक है। डिजिटल पैथोलॉजी दृष्टिकोण है कि मशीन आधारित सीखने एल्गोरिदम का उपयोग बड़े ऊतक क्षेत्रों और जटिल सेल phenotypes30,31 का मूल्यांकन करने के लिए कई ट्यूमर में परीक्षण किया गया है. वर्तमान अध्ययन में, एंडोमेट्रियम नमूनों की मनोरम छवि प्राप्त करने के लिए एक वाणिज्यिक प्रणाली शुरू की गई थी। एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का प्रतिशत बाद में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण प्रणाली के आधार पर एक स्वचालित मात्रात्मक विश्लेषण का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।

यहां उपयोग की जाने वाली इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण प्रणाली एक छवि विश्लेषण मंच है जो पैथोलॉजिकल ऊतकों के लिए विशिष्ट है, जो कृत्रिम बुद्धि का उपयोग करके ऊतक विभाजन को सक्षम बनाता है। इस प्रणाली के साथ विभिन्न मॉड्यूल का उपयोग करने वाले कई अध्ययनों को 32,33,34 बताया गया है। प्रणाली का उपयोग विभिन्न हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों और निष्कर्षों को निर्धारित करने के लिए किया गया था जो पारंपरिक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण करना मुश्किल था। उदाहरण के लिए, सीडी 56 + एनके कोशिकाओं की संख्या मध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान एंडोमेट्रियम में कुल कोशिकाओं का लगभग 5% है। पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण सीडी 56 + एनके कोशिकाओं की संख्या की सटीक गणना करना मुश्किल है, और पूरे खंड पर सकारात्मक कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करने में कम से कम 30 मिनट लग सकते हैं, लेकिन यहां उपयोग की जाने वाली प्रणाली के साथ 2-3 मिनट लगते हैं। इसलिए, यहां उपयोग किए जाने वाले इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके, एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं को आसानी से और सटीक रूप से विश्लेषण किया जा सकता है। छवि विश्लेषण द्वारा रोग संबंधी निष्कर्षों की मात्रा का ठहराव एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा पर्यावरण मूल्यांकन की निष्पक्षता, सटीकता और प्रेरक में सुधार करने में योगदान कर सकता है।

हालांकि, वर्णित विधि की एक सीमा है। एंडोमेट्रियम में विभिन्न इम्यूनोसाइट्स होते हैं जिनका गर्भावस्था के परिणाम के साथ संबंध होता है। इसलिए, केवल एक या दो प्रतिरक्षा मार्करों को परिभाषित करना अपर्याप्त हो सकता है। इसलिए, कोशिकाओं की प्रतिरक्षा रूपरेखा का व्यापक आकलन करने के लिए मल्टीपैरामीट्रिक दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।

सारांश में, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि इस प्रोटोकॉल ने प्रतिरक्षा कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए आरएम रोगियों के मध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान एंडोमेट्रियल वर्गों में डिजिटल छवि विश्लेषण को सफलतापूर्वक लागू किया है और एंडोमेट्रियल सीडी 56 + यूएनके, फॉक्सपी 3 + ट्रेग्स, सीडी 68 + मैक्रोफेज, सीडी 163 + एम 2 मैक्रोफेज, सीडी 1 ए + आईडीसी और सीडी 8 + के वितरण का निर्धारण करने के लिए वर्तमान अध्ययन में पैनोरमिक विश्लेषण किया गया थामध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान टी कोशिकाएं। आरएम के साथ रोगियों के गर्भावस्था के परिणामों के साथ एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच संबंध का समर्थन करने के लिए अधिक सबूत की आवश्यकता है और भविष्य के अध्ययन इस पर ध्यान केंद्रित करेंगे। यह पहला अध्ययन था जिसने डिजिटल पैथोलॉजी का उपयोग करके आरएम रोगियों में एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा वातावरण की जांच की।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक उन सभी महिलाओं के आभारी हैं जिन्होंने इस अध्ययन के लिए सहमति दी और नमूने दान किए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated coverslipper Sakuraus DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163 GrowGn Biotechnology NCL-L-CD163
CD1a Gene Tech GM357129
CD56 Gene Tech GT200529
CD8 Novocastra NCL-L-CD8-4B11
Dehydrator Thermo Fisher Excelsior ES
Digital pathology and Indica labs HALO
Foxp3 YILIFANG biological 14-477-82
IHC stainer Leica BOND III
Image analysis platform Indica labs HALO
Slide Scanner Olympus life science VS200

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