Summary
Ici, une plateforme numérique d’analyse d’images d’immunohistochimie a été développée et validée pour analyser quantitativement les cellules immunitaires de l’endomètre de patientes présentant des fausses couches à répétition dans la fenêtre d’implantation.
Abstract
Afin d’évaluer le microenvironnement immunitaire de l’endomètre des patientes présentant des fausses couches récurrentes (RM), une plateforme numérique d’analyse d’images immunohistochimiques a été développée et validée pour analyser quantitativement les cellules immunitaires de l’endomètre pendant la phase mi-lutéale. Tous les échantillons d’endomètre ont été prélevés pendant la phase mi-lutéale du cycle menstruel. Les tissus endométriaux enrobés de paraffine ont été sectionnés en lames de 4 μm d’épaisseur, et une coloration immunohistochimique (IHC) a été effectuée pour détecter les cellules immunitaires de l’endomètre, y compris les cellules uNK CD56+, les Tregs Foxp3+, les macrophages M2 CD163+, les DC CD1a+ et les lymphocytes T CD8+. Les diapositives panoramiques ont été numérisées à l’aide d’un scanner numérique et un système commercial d’analyse d’images a été utilisé pour l’analyse quantitative. Le pourcentage de cellules immunitaires de l’endomètre a été calculé en divisant le nombre de cellules immunitaires dans le nombre total de cellules de l’endomètre. En utilisant le système d’analyse d’images commercial, l’évaluation quantitative des cellules immunitaires de l’endomètre, qui sont difficiles ou impossibles à analyser avec l’analyse d’image conventionnelle, pourrait être facilement et avec précision. Cette méthodologie peut être appliquée pour caractériser quantitativement le microenvironnement de l’endomètre, y compris l’interaction entre les cellules immunitaires, et son hétérogénéité pour différentes patientes souffrant d’insuffisance reproductive. La plate-forme d’évaluation quantitative des cellules immunitaires de l’endomètre peut être d’une importance clinique importante pour le diagnostic et le traitement des patientes atteintes de RM.
Introduction
Les fausses couches récurrentes (RM) sont la perte de deux grossesses consécutives ou plus et sont une maladie complexe qui a attiré l’attention des cliniciens ces dernières années. Le taux d’incidence de la MR chez les femmes en âge de procréer est de 1 % à 5 % 1. Les résultats d’études antérieures montrent que les facteurs immunitaires sont étroitement associés à la pathogenèse de RM 2,3,4,5. Le maintien de l’homéostasie immunitaire à l’interface mère-fœtus est nécessaire à l’implantation et au développement de l’embryon. Les cellules immunitaires de l’endomètre jouent plusieurs rôles régulateurs pour maintenir cette homéostasie, tels que favoriser l’invasion des trophoblastes, remodeler les artères spirales et contribuer au développement du placenta 6,7,8,9.
Des cas aberrants de cellules immunitaires de l’endomètre chez les femmes atteintes de RM ont déjà été rapportés. Les résultats montrent une association étroite entre la forte densité de cellules tueuses naturelles (uNKs) utérines et l’apparition de RM10,11,12. Une augmentation du nombre de macrophages a été rapportée dans l’endomètre des femmes atteintes de RM, par rapport à celles qui ont eu une naissance vivante13. Les lymphocytes T régulateurs (Treg) jouent un rôle dans la tolérance immunitaire maternelle à l’égard de l’embryon, et leur niveau et leur fonction sont diminués dans la caduque des patients atteints de RM14. Les lymphocytes T de cytotoxicité (CTL) et les cellules dendritiques (DC) jouent également un rôle dans la régulation immunitaire de la grossesse15,16. Par conséquent, une analyse quantitative complète des cellules immunitaires locales de l’endomètre pendant la phase mi-lutéale pourrait aider à mieux comprendre la pathogenèse de la RM. Certaines méthodes actuelles d’analyse quantitative des cellules immunitaires de l’endomètre utilisent la cytométrie en flux qui permet de marquer avec précision les cellules immunitaires avec plusieurs marqueurs17,18. Cependant, l’application clinique de la cytométrie en flux est limitée car elle ne peut être réalisée que sur des tissus frais. L’obtention de tissus frais n’est possible que lorsqu’un grand volume de tumeur en excès est disponible, ce qui est rare pour l’endomètre. L’immunohistochimie permet d’observer la morphologie des tissus in situ et de marquer diverses cellules immunitaires, alors que les techniques immunohistochimiques traditionnelles ne permettent pas d’effectuer d’analyse quantitative des cellules immunitaires.
Par rapport aux expériences d’immunohistochimie conventionnelles, l’analyse immunohistochimique quantitative des cellules immunitaires de l’endomètre a une signification clinique importante. Le score d’intensité IHC est généralement classé sur une échelle de quatre points ou fort et faible dans les diagnostics pathologiques et la recherche 19,20,21. Cependant, cette technique semi-quantitative est subjective, très imprécise et démontre une variabilité intra-observateur et inter-observateursignificative 22. Une solution possible est l’application de l’apprentissage automatique, qui est précieux dans l’analyse d’images numériques23,24. En fournissant des mesures quantitatives, cette approche permet une évaluation plus précise de l’infiltration, de la distribution et de la densité des cellules immunitaires dans le tissu utérin. Ces informations quantitatives peuvent aider à élucider les changements dynamiques dans les populations de cellules immunitaires au cours du cycle menstruel et dans diverses conditions pathologiques. Dans l’ensemble, la capacité d’analyser quantitativement les cellules immunitaires de l’endomètre par immunohistochimie offre des informations précieuses sur le microenvironnement immunitaire de l’utérus.
Par conséquent, le protocole visait à développer et à valider une plateforme numérique d’analyse d’images immunohistochimiques pour analyser quantitativement les cellules immunitaires de l’endomètre, y compris les cellules uNK, les Tregs, les macrophages, les DC et les cellules T cytotoxiques pendant la phase mi-lutéale chez les patientes RM.
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Protocol
Le contenu et le protocole de la recherche ont été examinés et approuvés par le comité d’éthique de la recherche de l’hôpital d’urologie Zhongshan de Shenzhen. Toutes les femmes (âgées de 20 à 40 ans) qui ont participé à l’étude ont donné leur consentement éclairé pour le prélèvement et l’utilisation de l’échantillon.
1. Acquisition de tissus pathologiques
- Préparez les outils pour le prélèvement des tissus, à savoir la règle de mesure, la pince à épiler, la cassette d’enrobage, le papier d’enrobage et le panier à mouchoirs.
- Observez si la quantité de tissu endométrial (plus gros qu’un haricot mungo), prélevée à l’aide d’une approche standard avec un cathéter pipelle, est suffisante.
- Transférez le tissu endométrial du formol sur le papier d’enrobage à l’aide d’une pince à épiler et mesurez les dimensions du tissu endométrial à l’aide d’une règle.
- Enveloppez le tissu endométrial avec du papier d’enrobage et placez-le dans une cassette d’enrobage.
- Placez la cassette d’enrobage dans le panier à mouchoirs pour la déshydratation.
2. Déshydratation tissulaire
- Placez le panier de mouchoirs dans la chambre de réaction du déshydrateur (voir tableau des matériaux) et commencez la procédure de déshydratation systématique des tissus : formol pendant 100 min ; formol pendant 100 min ; 75% d’alcool pendant 60 min ; 85% d’alcool pendant 60 min ; 95% d’alcool pendant 60 min ; 100% d’alcool pendant 60 min ; 100% d’alcool pendant 60 min ; 100% d’alcool pendant 60 min ; xylène pendant 35 min ; xylène pendant 20 min ; xylène pendant 20 min ; cire pendant 80 min ; cire pendant 80 min ; cire pendant 80 min. Le processus prend environ 15 h.
- À la fin de la procédure de déshydratation des tissus, ouvrez la chambre de réaction du déshydrateur, retirez le panier de mouchoirs.
3. Enrobage tissulaire
- Sortez un moule d’enrobage approprié en fonction de la taille de l’échantillon et remplissez-le de cire de paraffine à 70 ° C.
- Placez rapidement le tissu dans le moule et ajustez-le soigneusement pour que le tissu soit situé au centre du moule.
- Déplacez doucement le moule vers la plaque de refroidissement et appuyez doucement sur le tissu pendant que la paraffine au fond durcit.
- Placez la cassette d’enrobage sur le dessus du moule et complétez avec plus de cire.
- Placez le moule sur la plaque de refroidissement et, lorsque la paraffine est complètement solidifiée, retirez le bloc avec sa cassette attachée loin du moule.
4. Coupes de tissus
- Insérez le bloc sur le clip d’échantillon du microtome, placez la lame dans le support, ajustez l’angle entre le plan du bloc et la lame, ajustez l’épaisseur de la section à 4 μm, tournez le volant et commencez le tranchage.
- Exposez la surface de tissu appropriée en coupant quelques sections minces du bloc. Retirez les sections continues et complètes avec le pinceau.
- Lorsque suffisamment de sections sont coupées, arrêtez de tourner le volant, retirez les sections non qualifiées à l’extrémité avant avec une pince à épiler et faites flotter les sections à la surface de l’eau à 42 °C dans le bain-marie avec une pince à épiler et une brosse.
- Une fois les sections complètement aplaties, prélevez les sections sur des lames anti-détachement et transférez-les dans un chauffe-lames à 65 °C pour cuire pendant 60 min.
- Lorsque la cuisson est terminée, retirez les lames de verre du chauffe-lames.
5. Coloration immunohistochimique
- Diluez l’anticorps primaire dans une solution de travail avec un diluant d’anticorps. Voir le tableau 1 pour plus de détails.
- Placez la solution d’anticorps diluée dans un flacon de réactif spécial et le kit de détection dans le compartiment à réactifs d’un instrument de coloration IHC automatique (voir tableau des matériaux).
- Placez les lames sur un porte-lames, recouvert d’une tuile spéciale, et insérez-les dans le compartiment de réaction expérimentale de l’instrument.
- Une fois que l’instrument a automatiquement reconnu le réactif et les informations expérimentales sur la lame, cliquez sur le bouton Démarrer pour lancer la coloration immunohistochimique. L’expérience dure environ 3 h.
6. Déshydratation et scellement de la lame
- Après la coloration immunohistochimique, retirez le support de lame, retirez la tuile de recouvrement spéciale, placez la lame tachée dans le support de lame et rincez le colorant restant sur la lame avec de l’eau claire.
- Transférez le porte-lames sur une pelle automatique (voir Tableau des matériaux), sélectionnez et exécutez la procédure de déshydratation et de scellage.
- Retirez les lames après déshydratation et scellage.
7. Balayage de la diapositive
- Placez les lames sur le support de lames du scanner d’images pathologiques panoramiques (voir tableau des matériaux) et placez-les dans le compartiment de numérisation des lames de l’instrument pour la numérisation d’images pathologiques panoramiques. Le balayage prend 2 min. Reportez-vous à la figure 1.
8. Analyse des images
- Importer l’image
- Ouvrez le logiciel d’analyse d’images pathologiques (voir Table des matériaux) et créez un nouveau dossier. Importez des images immunohistochimiques à analyser.
- Construire un classificateur de tissus
- Marquez plusieurs tissus et annotations vierges pour former et établir un classificateur permettant d’identifier le tissu et la zone vierge, respectivement.
- Utilisez le réglage en temps réel pour observer la capacité de reconnaissance du logiciel en temps réel lors de l’annotation des marques. Si la reconnaissance n’est pas effectuée en temps opportun, notez l’annotation et entraînez-vous à nouveau jusqu’à ce que la reconnaissance tissulaire soit précise.
- Algorithme d’analyse de build
- Sélectionnez l’algorithme standard dans le logiciel en fonction du type d’expérience : multiplex IHC.
- Définissez les paramètres de couleur de la reconnaissance des cellules en sélectionnant les pixels négatifs et positifs typiques.
Sur cette base, définissez les paramètres du noyau, du cytoplasme et de la membrane cellulaire, et observez la situation de reconnaissance cellulaire en temps réel jusqu’à ce que les paramètres les plus appropriés pour l’image aient été trouvés. - Définissez le seuil de reconnaissance de cellule positive et observez la situation de reconnaissance en temps réel jusqu’à ce que le seuil approprié soit ajusté.
- Sélectionnez le classificateur de tissus dans l’algorithme, et vérifiez la partie de tissu dans le classificateur de tissus, afin d’identifier les cellules sur la base des tissus. À ce stade, la mise en place d’un algorithme d’analyse est terminée.
- Exécuter l’analyse d’image
- Sélectionnez la zone d’analyse. Utilisez l’algorithme établi pour analyser les images.
- Une fois l’analyse du logiciel terminée, vérifiez manuellement si la reconnaissance d’image est exacte, y compris la reconnaissance des tissus, la reconnaissance des cellules négatives et positives.
- Si la reconnaissance d’image n’est pas précise, ajustez à nouveau l’algorithme et le seuil de paramètre, puis relancez l’analyse d’image jusqu’à ce qu’elle réussisse. Exportez les résultats de l’analyse. Reportez-vous à la figure 1.
- D’autres cellules immunitaires peuvent également être analysées selon les étapes ci-dessus (voir Figure 1). Définir différents paramètres d’analyse en fonction de l’expression réelle de différents marqueurs immunitaires de l’endomètre (cellules CD56+uNK, Foxp3+Tregs, macrophages CD68+, macrophages CD163+M2, CD1a+DCet cellules T CD8+25,26).
- Grâce au calcul du logiciel, obtenir la proportion de cellules immunitaires de l’endomètre (voir tableau 2). Utilisez-le pour évaluer les niveaux de diverses cellules immunitaires dans l’endomètre des patientes présentant des fausses couches récurrentes.
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Representative Results
Afin d’évaluer quantitativement les cellules immunitaires de l’endomètre et de réduire l’instabilité causée par les erreurs opérationnelles commises par l’homme, nous avons mis en place une plateforme d’analyse quantitative numérique pour les cellules immunitaires de l’endomètre en utilisant la détection immunohistochimique automatique et le système d’évaluation quantitative numérique. Une plateforme d’analyse d’images d’immunohistochimie a été mise en place pour analyser quantitativement les cellules immunitaires de l’endomètre des patientes présentant des fausses couches récurrentes (RM) dans la fenêtre d’implantation. Tous les tissus de l’endomètre ont été prélevés pendant la phase mi-lutéale du cycle menstruel. Les tissus endométrial enrobés de paraffine ont été sectionnés en lames de 4 μm d’épaisseur, et une coloration IHC a été effectuée pour détecter les cellules immunitaires de l’endomètre, y compris les cellules CD56+uNK, les Foxp3+Tregs, les macrophages CD163+M2, les DC CD1a+ et les lymphocytes T CD8+. Les diapositives panoramiques ont été numérisées à l’aide du scanner numérique de diapositives, et une analyse quantitative a été effectuée à l’aide d’un système d’analyse d’images numériques. Pour calculer le pourcentage de cellules immunitaires de l’endomètre, divisez le nombre de cellules immunitaires par le nombre total de cellules de l’endomètre. (Figure 1 et Figure 2). La proportion de différentes cellules immunitaires de l’endomètre chez les femmes atteintes de RM (N = 30) est indiquée dans le tableau 2.
Figure 1 : Schéma de travail pour l’analyse des cellules immunitaires de l’endomètre mi-lutéal. Le prélèvement d’échantillons a été effectué pendant la phase mi-lutéale du cycle menstruel, 7 à 9 jours après la poussée de l’hormone lutéinisante (LH). La fixation a été faite dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant 4 à 6 h à température ambiante, puis noyée dans de la cire de paraffine. La coloration IHC a été réalisée pour la détection des cellules immunitaires dans l’endomètre pendant la phase mi-lutéale, y compris les cellules CD56+uNK, les Foxp3+Tregs, les macrophages CD68+, les macrophages CD163+M2, les CD1a+DC et les cellules CD8+T25,26. Les tissus ont été scannés à l’aide d’un scanner commercial et une analyse quantitative a été effectuée à l’aide du système d’analyse d’images immunohistochimiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Immunomarquage des cellules de l’endomètre pour l’identification des cellules immunitaires positives. Immunomarquage des cellules CD56+uNK, des Foxp3+Tregs, des macrophages CD68+, des macrophages CD163+M2, des CD1a+DC et des lymphocytes T CD8+ dans l’endomètre des patientes RM. Le marron représente les cellules immunitaires positives et le bleu représente le noyau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Anticorps primaires | Clone | Dilution |
| Le CD56 | N° 123C3 | 1/800 |
| Par Foxp3 | 236A/E7 | 1/100 |
| CD163 | 10D6 | 1/1200 |
| CD1a | 10 | 1/200 |
| Disque CD8 | 4B11 | 1/300 |
Tableau 1 : Anticorps primaires utilisés lors de la coloration immunohistochimique. Le tableau montre le clone et la dilution des anticorps primaires.
| Marqueurs immunitaires | Médiane (%) | Minimum (%) | Maximum (%) | Moyenne (%) | 5e percentile (%) | 95e percentile (%) |
| Le CD56 | 4.83 | 1.8 | 16.76 | 6.03 | 2.04 | 13.63 |
| Par Foxp3 | 0.05 | 0.02 | 0.12 | 0.06 | 0.02 | 0.11 |
| Le CD68 | 0.78 | 0.37 | 3.62 | 0.99 | 0.44 | 2.67 |
| CD163 | 0.84 | 0.35 | 2.38 | 0.93 | 0.38 | 2.13 |
| CD1a | 0.04 | 0.01 | 0.11 | 0.05 | 0.01 | 0.1 |
| Disque CD8 | 1.69 | 0.76 | 4.1 | 1.85 | 0.81 | 3.72 |
Tableau 2 : Pourcentage de diverses cellules immunitaires de l’endomètre chez les femmes atteintes de RM. Le pourcentage de cellules CD56+uNK, Foxp3+Tregs, macrophages CD68+, macrophages CD163+M2, CD1a+DC et CD8+T chez les patients RM a été calculé par plateforme d’analyse d’images immunohistochimiques.
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Discussion
Ce protocole a permis d’établir une plateforme numérique d’analyse d’images immunohistochimiques permettant d’analyser quantitativement les cellules immunitaires de l’endomètre des patientes atteintes de RM. Ici, six marqueurs immunitaires de l’endomètre ont été détectés pour évaluer le microenvironnement immunitaire de l’endomètre chez les patientes atteintes de RM.
Un endomètre réceptif pendant la phase mi-lutéale est la clé d’une implantation et d’une grossesse réussies27,28. Par conséquent, l’évaluation du pourcentage de cellules immunitaires de l’endomètre joue un rôle important dans l’estimation de la réceptivité de l’endomètre. L’analyse des cellules immunitaires de l’endomètre, par des méthodes pathologiques conventionnelles, est prédictive, elle n’aide donc pas à l’application clinique. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode normalisée pour mesurer le pourcentage de cellules immunitaires, ce qui constitue un obstacle à la compréhension du rôle de ces cellules pendant la grossesse. L’analyse IHC conventionnelle est basée sur des champs visuels sélectionnés et un comptage manuel. La segmentation précise des tissus et la localisation des cellules immunitaires ne peuvent pas être évaluées avec l’IHC conventionnelle car l’analyse manuelle est subjective, ce qui entraîne un biais de l’observateur29.
Par rapport à l’analyse de la distribution des cellules immunitaires dans le champ sélectionné, l’analyse panoramique des tissus est plus précise pour analyser la distribution des cellules immunitaires de l’endomètre. Des approches de pathologie numérique qui utilisent des algorithmes d’apprentissage automatique ont été testées dans plusieurs tumeurs pour évaluer de grandes surfaces tissulaires et des phénotypes cellulaires complexes30,31. Dans la présente étude, un système commercial a été introduit pour obtenir une image panoramique d’échantillons d’endomètre. Le pourcentage de cellules immunitaires de l’endomètre a ensuite été déterminé à l’aide d’une analyse quantitative automatisée basée sur le système d’analyse d’images immunohistochimiques.
Le système d’analyse d’images d’immunohistochimie utilisé ici est une plateforme d’analyse d’images spécialisée dans les tissus pathologiques, qui permet de segmenter les tissus en utilisant l’intelligence artificielle. De nombreuses études utilisant divers modules avec ce système ont été rapportées32,33,34. Le système a été utilisé pour quantifier divers changements histopathologiques et des résultats difficiles à analyser à l’aide d’un logiciel de traitement d’images conventionnel. Par exemple, le nombre de cellules CD56+NK représente environ 5 % du nombre total de cellules de l’endomètre pendant la phase mi-lutéale. L’analyse immunohistochimique traditionnelle est difficile à calculer avec précision le nombre de cellules NK CD56+, et cela peut prendre au moins 30 minutes pour calculer le nombre total de cellules positives sur l’ensemble de la section, mais cela prend 2 à 3 minutes avec le système utilisé ici. Par conséquent, en utilisant le système d’analyse d’images immunohistochimiques utilisé ici, les cellules immunitaires de l’endomètre pourraient être analysées facilement et avec précision. La quantification des résultats pathologiques par analyse d’images peut contribuer à améliorer l’objectivité, la précision et la persuasion de l’évaluation de l’environnement immunitaire de l’endomètre.
Cependant, il existe une limite à la méthode décrite. L’endomètre est constitué de divers immunocytes qui ont une association avec l’issue de la grossesse. Par conséquent, la définition d’un ou deux marqueurs immunitaires peut être insuffisante. Par conséquent, des approches multiparamétriques sont nécessaires pour évaluer de manière exhaustive le profil immunitaire des cellules.
En résumé, on peut conclure que ce protocole a appliqué avec succès l’analyse d’images numériques dans les coupes d’endomètre pendant la phase mi-lutéale des patientes RM pour la quantification des cellules immunitaires et une analyse panoramique a été menée dans la présente étude pour déterminer la distribution des uNK CD56+ de l’endomètre, des Foxp3+Tregs, des macrophages CD68+, des macrophages CD163+ M2, des iDC CD1a+ et CD8+Lymphocytes T pendant la phase mi-lutéale. D’autres preuves sont nécessaires pour étayer l’association entre les cellules immunitaires de l’endomètre et les issues de grossesse des patientes atteintes de RM et les études futures se concentreront sur ce point. Il s’agissait de la première étude portant sur l’environnement immunitaire de l’endomètre chez les patientes atteintes de RM à l’aide d’une pathologie numérique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants envers toutes les femmes qui ont consenti et donné des échantillons pour cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
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