Summary
Aquí, se desarrolló y validó una plataforma digital de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales de pacientes con abortos espontáneos recurrentes en la ventana de implantación.
Abstract
Para evaluar el microambiente inmune endometrial de pacientes con aborto espontáneo recurrente (RM), se desarrolló y validó una plataforma de análisis de imágenes inmunohistoquímicas digitales para analizar cuantitativamente las células inmunes endometriales durante la fase lútea media. Todas las muestras de endometrio se recogieron durante la fase lútea media del ciclo menstrual. Los tejidos endometriales incluidos en parafina se seccionaron en portaobjetos de 4 μm de espesor y se llevó a cabo una tinción inmunohistoquímica (IHQ) para detectar células inmunitarias endometriales, incluidas las células uNK CD56+, las Tregs Foxp3+, los macrófagos CD163+ M2, las CD CD1a+ y las células T CD8+. Las diapositivas panorámicas se escanearon con un escáner digital de diapositivas y se utilizó un sistema comercial de análisis de imágenes para el análisis cuantitativo. El porcentaje de células inmunitarias endometriales se calculó dividiendo el número de células inmunitarias en el total de células endometriales. Utilizando el sistema comercial de análisis de imágenes, la evaluación cuantitativa de las células inmunitarias endometriales, que son difíciles o imposibles de analizar con el análisis de imágenes convencional, podría analizarse de forma fácil y precisa. Esta metodología se puede aplicar para caracterizar cuantitativamente el microambiente del endometrio, incluida la interacción entre las células inmunitarias, y su heterogeneidad para diferentes pacientes con insuficiencia reproductiva. La plataforma para la evaluación cuantitativa de las células inmunitarias endometriales puede tener una importancia clínica importante para el diagnóstico y el tratamiento de las pacientes con RM.
Introduction
El aborto espontáneo recurrente (RM) es la pérdida de dos o más embarazos consecutivos y es una enfermedad compleja que ha llamado la atención de los médicos en los últimos años. La tasa de incidencia de RM en mujeres en edad fértil es del 1%-5% 1. Los resultados de estudios previos muestran que los factores inmunes están estrechamente asociados con la patogénesis de RM 2,3,4,5. El mantenimiento de la homeostasis inmunitaria en la interfaz materno-fetal es necesario para la implantación y el desarrollo embrionario. Las células inmunitarias endometriales desempeñan varias funciones reguladoras para mantener esta homeostasis, como promover la invasión del trofoblasto, remodelar las arterias espirales y contribuir al desarrollo de la placenta 6,7,8,9.
Se han reportado previamente células inmunitarias endometriales aberrantes en mujeres con RM. Los resultados muestran una estrecha asociación entre la alta densidad de células asesinas naturales uterinas (uNK) y la ocurrencia de RM10,11,12. Se ha descrito un aumento del número de macrófagos en el endometrio de mujeres con RM, en comparación con las que tuvieron un nacido vivo13. Las células T reguladoras (Treg) desempeñan un papel en la inmunidad materna hacia el embrión, y su nivel y función están disminuidos en la decidua de los pacientes con RM14. Los linfocitos T (CTL) y los linfocitos dendríticos (CD) también desempeñan un papel en la regulación inmunitaria del embarazo15,16. Por lo tanto, un análisis cuantitativo exhaustivo de las células inmunitarias endometriales locales durante la fase lútea media podría ayudar a comprender mejor la patogénesis de la RM. Algunos métodos actuales para el análisis cuantitativo de las células inmunitarias endometriales utilizan la citometría de flujo, que puede etiquetar con precisión las células inmunitarias con múltiples marcadores17,18. Sin embargo, la aplicación clínica de la citometría de flujo es limitada porque solo se puede realizar en tejido fresco. La obtención de tejido fresco solo es factible cuando se dispone de un gran volumen de exceso de tumor, algo poco frecuente en el endometrio. La inmunohistoquímica puede observar bien la morfología de los tejidos in situ y también puede marcar varias células inmunitarias, mientras que las técnicas inmunohistoquímicas tradicionales no pueden realizar análisis cuantitativos de las células inmunitarias.
En comparación con los experimentos de inmunohistoquímica convencionales, el análisis inmunohistoquímico cuantitativo de las células inmunitarias del endometrio tiene una importancia clínica importante. La puntuación de la intensidad de la IHQ suele clasificarse en una escala de cuatro puntos o fuerte y débil en el diagnóstico patológico y la investigación 19,20,21. Sin embargo, esta técnica semicuantitativa es subjetiva, altamente inexacta y demuestra una variabilidad significativa intraobservador e interobservador22. Una posible solución es la aplicación del aprendizaje automático, que es valioso en el análisis de imágenes digitales23,24. Al proporcionar mediciones cuantitativas, este enfoque permite una evaluación más precisa de la infiltración, distribución y densidad de las células inmunitarias dentro del tejido uterino. Esta información cuantitativa puede ayudar a dilucidar los cambios dinámicos en las poblaciones de células inmunitarias durante el ciclo menstrual y en diversas condiciones patológicas. En general, la capacidad de analizar cuantitativamente las células inmunitarias del endometrio a través de la inmunohistoquímica ofrece información valiosa sobre el microambiente inmunitario del útero.
Por lo tanto, el protocolo tenía como objetivo desarrollar y validar una plataforma digital de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales, incluidas las células uNK, Tregs, macrófagos, CD y células T citotóxicas durante la fase lútea media en pacientes con RM.
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Protocol
El contenido y el protocolo de la investigación han sido revisados éticamente y aprobados por el comité de ética de investigación del Hospital de Urología Shenzhen Zhongshan. Todas las mujeres (de 20 a 40 años) que participaron en el estudio dieron su consentimiento informado para la recolección y el uso de la muestra.
1. Adquisición de tejido patológico
- Prepare las herramientas para la recolección de pañuelos, a saber, la regla de medición, la pinza, el casete de inclusión, el papel de incrustación y la canasta de pañuelos.
- Observe si la cantidad de tejido endometrial (más grande que un frijol mungo), recolectado mediante un abordaje estándar con un catéter de pipella, es suficiente.
- Transfiera el tejido endometrial de la formalina al papel de inclusión con pinzas y mida las dimensiones del tejido endometrial con una regla.
- Envuelva el tejido endometrial con papel de inclusión y colóquelo en un casete de inclusión.
- Coloque el casete de inclusión en la canasta de pañuelos para deshidratarlo.
2. Deshidratación de tejidos
- Coloque la canasta de pañuelos en la cámara de reacción del deshidratador (consulte la Tabla de materiales) e inicie el procedimiento para la deshidratación de tejidos de rutina: formol durante 100 minutos; formol durante 100 min; 75% de alcohol durante 60 min; 85% de alcohol durante 60 min; 95% de alcohol durante 60 min; 100% alcohol durante 60 min; 100% alcohol durante 60 min; 100% alcohol durante 60 min; xileno durante 35 min; xileno durante 20 min; xileno durante 20 min; cera durante 80 min; cera durante 80 min; Cera durante 80 min. El proceso dura unas 15 h.
- Al final del procedimiento de deshidratación de tejidos, abra la cámara de reacción del deshidratador, retire la canasta de tejidos.
3. Inclusión de tejidos
- Saque un molde de inclusión adecuado según el tamaño de la muestra y llénelo con cera de parafina a 70 ° C.
- Coloque rápidamente el pañuelo en el molde y ajústelo con cuidado para que el tejido quede ubicado en el centro del molde.
- Mueva el molde suavemente a la placa de enfriamiento y presione suavemente el pañuelo mientras la parafina en la parte inferior se asienta.
- Coloque el casete de incrustación encima del molde y rellene con más cera.
- Coloque el molde en la placa de enfriamiento y, cuando la parafina esté completamente solidificada, retire el bloque con su casete adjunto lejos del molde.
4. Secciones de tejido
- Inserte el bloque en el clip de muestra del micrótomo, coloque la cuchilla en el soporte, ajuste el ángulo entre el plano del bloque y la cuchilla, ajuste el grosor de la sección a 4 μm, gire el volante y comience el corte.
- Exponga la superficie de tejido adecuada cortando algunas secciones delgadas del bloque. Saca las secciones continuas y completas con el pincel.
- Cuando se corten suficientes secciones, deje de girar el volante, retire las secciones no calificadas en la parte delantera con pinzas y haga flotar las secciones en la superficie de agua a 42 ° C en el baño de agua con pinzas y cepillo.
- Una vez que las secciones estén completamente aplanadas, recoja las secciones en portaobjetos antidesprendimiento y transfiéralas a un calentador de portaobjetos a 65 °C para hornear durante 60 minutos.
- Cuando termine de hornear, saque los portaobjetos de vidrio del calentador de portaobjetos.
5. Tinción inmunohistoquímica
- Diluya el anticuerpo primario en una solución funcional con diluyente de anticuerpos. Consulte la Tabla 1 para obtener más detalles.
- Coloque la solución de anticuerpos diluida en un frasco de reactivo especial y el kit de detección en el compartimiento de reactivos de un instrumento automático de tinción IHQ (consulte la Tabla de materiales).
- Coloque los portaobjetos en un soporte para portaobjetos, cubierto con un vértice especial, e insértelos en el compartimento de reacción experimental del instrumento.
- Después de que el instrumento reconozca automáticamente el reactivo y la información experimental en el portaobjetos, haga clic en el botón Inicio para iniciar la tinción inmunohistoquímica. El experimento tiene una duración aproximada de 3 h.
6. Deshidratación y sellado del portaobjetos
- Después de la tinción inmunohistoquímica, saque el portaobjetos, retire el vértice especial, coloque el portaobjetos teñido en el portaobjetos y lave el tinte restante del portaobjetos con agua limpia.
- Transfiera el portaobjetos a un cubreobjetos automatizado (consulte la Tabla de materiales), seleccione y ejecute el procedimiento de deshidratación y sellado.
- Saque los portaobjetos después de deshidratarlos y sellarlos.
7. Escaneo de diapositiva
- Coloque los portaobjetos en el soporte de portaobjetos del escáner panorámico de imágenes patológicas (consulte la Tabla de materiales) y colóquelo en el compartimento de escaneo de portaobjetos del instrumento para el escaneo de imágenes patológicas panorámicas. El escaneo tarda 2 min. Véase la figura 1.
8. Análisis de imágenes
- Importar imagen
- Abra el software de análisis de imágenes patológicas (consulte Tabla de materiales) y cree una nueva carpeta. Importar imágenes inmunohistoquímicas para ser analizadas.
- Construir un clasificador de tejidos
- Marque varios tejidos y una anotación en blanco para entrenar y establecer un clasificador para identificar el tejido y el área en blanco, respectivamente.
- Utilice el ajuste en tiempo real para observar la capacidad de reconocimiento del software en tiempo real durante la anotación de marcas. Si el reconocimiento no es oportuno, retome la anotación y vuelva a entrenar hasta que el reconocimiento de tejidos sea preciso.
- Algoritmo de análisis de compilación
- Seleccione el algoritmo estándar en el software de acuerdo con el tipo de experimento: IHC múltiplex.
- Establezca los parámetros de color del reconocimiento de celdas seleccionando píxeles negativos y positivos típicos.
Sobre esta base, establezca los parámetros del núcleo, el citoplasma y la membrana celular, y observe la situación de reconocimiento celular en tiempo real hasta que se hayan encontrado los parámetros más adecuados para la imagen. - Establezca el umbral de reconocimiento de celdas positivo y observe la situación de reconocimiento en tiempo real hasta que se ajuste el umbral apropiado.
- Seleccione el clasificador de tejido en el algoritmo y verifique la parte de tejido en el clasificador de tejido, para identificar las células sobre la base de los tejidos. En este punto, se completa el establecimiento de un algoritmo de análisis.
- Ejecutar análisis de imágenes
- Seleccione el área de análisis. Utilice el algoritmo establecido para analizar imágenes.
- Una vez finalizado el análisis del software, compruebe manualmente si el reconocimiento de imágenes es preciso, incluido el reconocimiento de tejidos, el reconocimiento de células negativas y positivas.
- Si el reconocimiento de imágenes no es preciso, vuelva a ajustar el algoritmo y el umbral de parámetros, y vuelva a ejecutar el análisis de imágenes hasta que se realice correctamente. Exporte los resultados del análisis. Véase la figura 1.
- También se pueden analizar otras células inmunitarias de acuerdo con los pasos anteriores (véase la figura 1). Establecer diferentes parámetros de análisis en función de la expresión real de diferentes marcadores inmunitarios endometriales (células CD56+uNK, Foxp3+Tregs, macrófagos CD68+, macrófagos CD163+M2, CD1a+DCs y células CD8+T25,26).
- A través del cálculo del software, se obtiene la proporción de células inmunes endometriales (ver Tabla 2). Utilícelo para evaluar los niveles de varias células inmunitarias en el endometrio de pacientes con abortos espontáneos recurrentes.
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Representative Results
Con el fin de evaluar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales y reducir la inestabilidad causada por errores operativos provocados por el hombre, establecimos una plataforma de análisis cuantitativo digital para las células inmunitarias endometriales mediante el uso de la detección inmunohistoquímica automática y el sistema de evaluación cuantitativa digital. Se estableció la plataforma de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunes endometriales de pacientes con aborto espontáneo recurrente (RM) en la ventana de implantación. Todos los tejidos del endometrio se recolectaron durante la fase lútea media del ciclo menstrual. Los tejidos endometriales incluidos en parafina se seccionaron en portaobjetos de 4 μm de espesor y se llevó a cabo la tinción IHQ para detectar células inmunitarias endometriales, incluidas las células CD56+uNK, Foxp3+Tregs, los macrófagos CD163+M2, las CD CD1a+ y las células T CD8+. Las diapositivas panorámicas se escanearon con el escáner digital de diapositivas y el análisis cuantitativo se realizó con un sistema de análisis de imágenes digitales. Para calcular el porcentaje de células inmunitarias endometriales, divida el número de células inmunitarias por el número total de células endometriales. (Figura 1 y Figura 2). La proporción de diferentes células inmunes endometriales en mujeres con RM (N=30) se muestra en la Tabla 2.
Figura 1: Flujo de trabajo esquemático para el análisis de células inmunitarias endometriales medias lúteas. La recolección de muestras se realizó durante la fase lútea media del ciclo menstrual, a los 7-9 días después del aumento de la hormona luteinizante (LH). La fijación se realizó en formalina tamponada neutra al 10% durante 4-6 h a temperatura ambiente, y luego se incrustó en cera de parafina. La tinción IHQ se realizó para la detección de células inmunitarias en el endometrio durante la fase lútea media, incluyendo células CD56+uNK, Foxp3+Tregs, macrófagos CD68+, macrófagos CD163+M2, CD1a+DC y células T CD8+ 25,26. Los tejidos se escanearon con un escáner comercial y el análisis cuantitativo se realizó con el sistema de análisis de imágenes inmunohistoquímicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Inmunotinción de células endometriales para la identificación de células inmunitarias positivas. Inmunotinción de células CD56+uNK, Foxp3+Tregs, macrófagos CD68+, macrófagos CD163+M2, CD1a+DCs y células T CD8+ en endometrio de pacientes con RM. El marrón representa las células inmunitarias positivas y el azul representa el núcleo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Anticuerpo primario | Clon | Dilución |
| CD56 | 123C3 | 1/800 |
| Foxp3 | 236A/E7 | 1/100 |
| CD163 | 10D6 | 1/1200 |
| CD1a | 10 | 1/200 |
| CD8 | 4B11 | 1/300 |
Tabla 1: Anticuerpos primarios utilizados durante la tinción inmunohistoquímica. La tabla muestra el clon y la dilución de los anticuerpos primarios.
| Marcadores inmunitarios | Mediana (%) | Mínimo (%) | Máximo (%) | Media (%) | Percentil 5 (%) | Percentil 95 (%) |
| CD56 | 4.83 | 1.8 | 16.76 | 6.03 | 2.04 | 13.63 |
| Foxp3 | 0.05 | 0.02 | 0.12 | 0.06 | 0.02 | 0.11 |
| CD68 | 0.78 | 0.37 | 3.62 | 0.99 | 0.44 | 2.67 |
| CD163 | 0.84 | 0.35 | 2.38 | 0.93 | 0.38 | 2.13 |
| CD1a | 0.04 | 0.01 | 0.11 | 0.05 | 0.01 | 0.1 |
| CD8 | 1.69 | 0.76 | 4.1 | 1.85 | 0.81 | 3.72 |
Tabla 2: Porcentaje de diversas células inmunitarias endometriales en mujeres con RM. El porcentaje de células CD56+uNK, Foxp3+Tregs, macrófagos CD68+, macrófagos CD163+M2, CD1a+DC y células CD8+T en pacientes con RM se calculó mediante la plataforma de análisis de imágenes inmunohistoquímicas.
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Discussion
Este protocolo estableció una plataforma digital de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales de pacientes con RM. En este caso, se detectaron seis marcadores inmunitarios endometriales para evaluar el microambiente inmunitario endometrial en pacientes con RM.
Un endometrio receptivo durante la fase lútea media es clave para el éxito de la implantación y el embarazo27,28. Por lo tanto, la evaluación del porcentaje de células inmunitarias endometriales desempeña un papel importante en la estimación de la receptividad endometrial. El análisis de las células inmunitarias endometriales, mediante métodos patológicos convencionales, es predictivo por lo que no ayuda en la aplicación clínica. En la actualidad, no existe un método estandarizado para la medición del porcentaje de células inmunitarias, lo que supone un obstáculo para comprender el papel de estas células en el embarazo. El análisis convencional de IHQ se basa en campos visuales seleccionados y en el recuento manual. La segmentación y localización precisa de los tejidos de las células inmunitarias no puede evaluarse con la IHQ convencional porque el análisis manual es subjetivo, lo que conduce a un sesgo del observador29.
En comparación con el análisis de la distribución de las células inmunitarias en el campo seleccionado, el análisis panorámico de los tejidos es más preciso para analizar la distribución de las células inmunitarias endometriales. Los enfoques de patología digital que utilizan algoritmos de aprendizaje automático se han probado en múltiples tumores para evaluar grandes áreas de tejido y fenotipos celulares complejos30,31. En el presente estudio, se introdujo un sistema comercial para la obtención de una imagen panorámica de muestras de endometrio. Posteriormente, se determinó el porcentaje de células inmunitarias endometriales mediante un análisis cuantitativo automatizado basado en el sistema de análisis de imágenes inmunohistoquímicas.
El sistema de análisis de imágenes inmunohistoquímica utilizado aquí es una plataforma de análisis de imágenes especializada en tejidos patológicos, que permite la segmentación de tejidos mediante el uso de inteligencia artificial. Se han reportado muchos estudios que utilizan diversos módulos con este sistema32,33,34. El sistema se utilizó para cuantificar diversos cambios histopatológicos y hallazgos que eran difíciles de analizar utilizando un software convencional de procesamiento de imágenes. Por ejemplo, el número de células CD56+NK representa aproximadamente el 5% del total de células en el endometrio durante la fase lútea media. El análisis inmunohistoquímico tradicional es difícil para calcular con precisión el número de células NK CD56+, y puede llevar al menos 30 minutos calcular el número total de células positivas en toda la sección, pero se tarda entre 2 y 3 minutos con el sistema utilizado aquí. Por lo tanto, utilizando el sistema de análisis de imágenes inmunohistoquímicas utilizado aquí, las células inmunitarias endometriales podrían analizarse de manera fácil y precisa. La cuantificación de los hallazgos patológicos mediante el análisis de imágenes puede contribuir a mejorar la objetividad, la precisión y la capacidad de persuasión de la evaluación del entorno inmunitario endometrial.
Sin embargo, existe una limitación del método descrito. El endometrio está formado por varios inmunocitos que tienen una asociación con el resultado del embarazo. Por lo tanto, definir solo uno o dos marcadores inmunes podría ser insuficiente. Por lo tanto, se necesitan enfoques multiparamétricos para evaluar de forma exhaustiva el perfil inmunitario de las células.
En resumen, se puede concluir que este protocolo ha aplicado con éxito el análisis digital de imágenes en cortes endometriales durante la fase lútea media de pacientes con RM para la cuantificación de células inmunes y en el presente estudio se realizó un análisis panorámico para determinar la distribución de uNKs CD56+ endometriales, Foxp3+Tregs, macrófagos CD68+, macrófagos CD163+ M2, iDCs CD1a+ y CD8+Células T durante la fase lútea media. Se necesita más evidencia para respaldar la asociación entre las células inmunitarias endometriales con los resultados del embarazo de pacientes con RM y los estudios futuros se centrarán en esto. Este fue el primer estudio que investigó el entorno inmune endometrial en pacientes con RM utilizando patología digital.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a todas las mujeres que dieron su consentimiento y donaron muestras para este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
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