Summary
ここでは、着床期間中に反復流産した患者の子宮内膜免疫細胞を定量的に分析するために、デジタル免疫組織化学画像解析プラットフォームが開発され、検証されました。
Abstract
反復流産(RM)患者の子宮内膜免疫微小環境を評価するために、黄体中期の子宮内膜免疫細胞を定量的に分析するためのデジタル免疫組織化学画像解析プラットフォームが開発され、検証されました。すべての子宮内膜サンプルは、月経周期の黄体中期に収集されました。パラフィン包埋子宮内膜組織を厚さ4 μmのスライドに切片化し、CD56+ uNK細胞、Foxp3+ Treg、CD163+ M2マクロファージ、CD1a+ DC、CD8+ T細胞などの子宮内膜免疫細胞を検出するために免疫組織化学(IHC)染色を実施しました。パノラマスライドはデジタルスライドスキャナーでスキャンし、定量分析には市販の画像解析システムを使用しました。子宮内膜免疫細胞の割合は、子宮内膜細胞全体の免疫細胞数を割って算出しました。市販の画像解析システムを用いることで、従来の画像解析では解析が困難または不可能であった子宮内膜免疫細胞の定量的評価を簡便かつ正確に解析することが可能となりました。この方法論は、免疫細胞間の相互作用を含む子宮内膜微小環境、およびさまざまな生殖不全患者の不均一性を定量的に特徴付けるために適用できます。子宮内膜免疫細胞の定量的評価のためのプラットフォームは、RM患者の診断と治療にとって重要な臨床的意義を持つ可能性があります。
Introduction
不定育症(RM)とは、2回以上連続して妊娠ができない病気で、近年、臨床医から注目されている複雑な疾患です。出産可能年齢の女性におけるRMの発生率は1%〜5%です1。以前の研究の結果は、免疫因子がRM2,3,4,5の病因と密接に関連していることを示しています。母体と胎児の界面における免疫ホメオスタシスの維持は、胚の着床と発育に必要です。子宮内膜免疫細胞は、栄養膜浸潤の促進、螺旋動脈のリモデリング、胎盤の発達への寄与など、この恒常性を維持するためにいくつかの調節的役割を果たします6,7,8,9。
RMの女性における子宮内膜免疫細胞の異常は以前に報告されています。結果は、高密度の子宮ナチュラルキラー細胞(uNK)とRM10,11,12の発生との間に密接な関連があることを示しています。RMの女性の子宮内膜では、生児出産の女性と比較して、マクロファージの数の増加が報告されています13。制御性T細胞(Treg)は、胚に対する母体の免疫寛容に関与しており、RM患者の脱落膜ではそのレベルと機能が低下している14。細胞傷害性T細胞(CTL)と樹状細胞(DC)も妊娠の免疫調節に関与しています15,16。したがって、黄体期中期の局所子宮内膜免疫細胞の包括的な定量分析は、RMの病因をよりよく理解するのに役立ちます。子宮内膜免疫細胞の定量分析のためのいくつかの現在の方法は、複数のマーカーで免疫細胞を正確に標識できるフローサイトメトリーを使用しています17,18。しかし、フローサイトメトリーは新鮮な組織にしか実施できないため、臨床応用は限られています。新鮮な組織を得ることは、大量の過剰腫瘍が利用可能である場合にのみ実行可能ですが、子宮内膜ではまれに発生します。免疫組織化学は、組織の形態をその場でよく観察でき、さまざまな免疫細胞を標識することもできますが、従来の免疫組織化学的手法では免疫細胞の定量分析を行うことができません。
従来の免疫組織化学実験と比較して、子宮内膜内の免疫細胞の定量的免疫組織化学的分析は重要な臨床的意義を持っています。IHC強度スコアリングは、通常、病理学的診断および研究において4段階評価または強弱でランク付けされます19,20,21。しかし、この半定量的手法は主観的であり、非常に不正確であり、観察者内および観察者間の有意な変動性を示している22。考えられる解決策の1つは、デジタル画像解析23,24で貴重な機械学習の応用です。定量的な測定を行うことで、子宮組織内の免疫細胞の浸潤、分布、密度をより正確に評価することができます。この定量的情報は、月経周期中およびさまざまな病理学的状態における免疫細胞集団の動的変化を解明するのに役立ちます。全体として、免疫組織化学を通じて子宮内膜の免疫細胞を定量的に分析する能力は、子宮の免疫微小環境に関する貴重な洞察を提供します。
したがって、プロトコルは、デジタル免疫組織化学画像分析プラットフォームを開発および検証して、 RM患者の黄体中期にuNK細胞、Treg、マクロファージ、DC、細胞傷害性T細胞などの子宮内膜免疫細胞を定量的に分析します。
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Protocol
研究内容とプロトコルは、深セン中山泌尿器科病院の研究倫理委員会によって倫理的にレビューされ、承認されています。研究に参加したすべての女性(20〜40歳)は、サンプルの収集と使用についてインフォームドコンセントを提供しました。
1.病理組織の獲得
- ティッシュ採取用のツール、つまり測定定規、ピンセット、埋め込みカセット、埋め込み紙、ティッシュバスケットを準備します。
- ピペルカテーテルによる標準的なアプローチを使用して収集された子宮内膜組織(緑豆よりも大きい)の量が十分であるかどうかを観察します。
- 子宮内膜組織をホルマリンからピンセットで包埋紙に転写し、定規で子宮内膜組織の寸法を測定します。
- 子宮内膜組織を包埋紙で包み、包埋カセットに入れます。
- 包埋カセットをティッシュバスケットに入れて脱水します。
2.組織の脱水
- 組織バスケットを脱水機の反応チャンバーに入れ( 材料表を参照)、日常的な組織脱水の手順を開始します:ホルマリンを100分間。ホルマリンを100分間。アルコール度数75%で60分。アルコール度数85%で60分。アルコール度数95%で60分。アルコール度数100%で60分。アルコール度数100%で60分。アルコール度数100%で60分。キシレンで35分。キシレンで20分。キシレンで20分。80分間ワックスをかけます。80分間ワックスをかけます。80分間ワックスを塗る。このプロセスには約15時間かかります。
- 組織脱水手順の最後に、脱水機の反応室を開き、組織バスケットを取り外します。
3. 組織包埋
- 試料の大きさに応じて適当な包埋型を取り出し、70°Cでパラフィンワックスを充填する。
- ティッシュを型にすばやく入れ、ティッシュが型の中心に配置されるように慎重に調整します。
- 金型を冷却プレートにスムーズに移動し、底のパラフィンが固まるまでティッシュをそっと押します。
- 型の上に埋め込みカセットを置き、さらにワックスを補充します。
- 金型を冷却プレートに置き、パラフィンが完全に固まったら、カセットを取り付けたブロックを金型から取り外します。
4. 組織切片
- ブロックをミクロトームのサンプルクリップに挿入し、ブレードをホルダーに置き、ブロックの平面とブレードの間の角度を調整し、セクションの厚さを4μmに調整し、ハンドホイールを回してスライスを開始します。
- ブロックからいくつかの薄い切片を切り取って、適切な組織表面を露出させます。ブラシで連続したセクションと完全なセクションを取り出します。
- 十分な切片が切断されたら、ハンドホイールを回すのをやめ、ピンセットで前端の不適格な切片を取り除き、ピンセットとブラシでウォーターバス内の42°Cの水の表面に切片を浮かせます。
- 切片が完全に平らになったら、剥離防止スライドで切片を選び、65°Cのスライドウォーマーに移して60分間焼きます。
- 焼きが終わったら、スライドウォーマーからスライドガラスを取り出します。
5. 免疫組織化学的染色
- 一次抗体を抗体希釈液で作業溶液に希釈します。詳しくは、 表 1 を参照してください。
- 希釈した抗体溶液を専用の試薬ボトルに入れ、検出キットを自動IHC染色装置の試薬室に入れます( 材料表を参照)。
- スライドを特殊なカバータイルで覆われたスライドホルダーに置き、装置の実験反応コンパートメントに挿入します。
- スライド上の試薬と実験情報が自動的に認識されたら、[ 開始 ]ボタンをクリックして免疫組織化学染色を開始します。実験は約3時間続きます。
6.スライドの脱水と密封
- 免疫組織化学的染色後、スライドホルダーを取り出し、特殊なカバータイルをはがし、染色したスライドをスライドホルダーに入れ、スライドに残っている染料をきれいな水で洗い流します。
- スライドホルダーを自動カバースリッパ( 材料表を参照)に移し、脱水および密封手順を選択して実行します。
- 脱水と密封後にスライドを取り出します。
7.スキャニングスライド
- スライドをパノラマ病理画像スキャナーのスライドラック( 材料表を参照)に置き、パノラマ病理画像スキャン用の機器スライドスキャンコンパートメントに置きます。スキャンには2分かかります。 図 1 を参照してください。
8. 画像の解析
- 画像をインポート
- 病理画像解析ソフト( 資料表参照)を開き、新規フォルダを作成します。分析する免疫組織化学的画像をインポートします。
- 組織分類器の構築
- 複数の組織と空白の注釈をマークして、組織と空白領域をそれぞれ識別するための分類器をトレーニングおよび確立します。
- リアルタイムチューニングを使用して、マーク注釈中にソフトウェアの認識能力をリアルタイムで観察します。認識がタイムリーでない場合は、注釈をメモし、組織認識が正確になるまで再度トレーニングします。
- ビルド分析アルゴリズム
- 実験の種類に応じて、ソフトウェアで標準アルゴリズム(マルチプレックスIHC)を選択します。
- 典型的なネガティブピクセルとポジティブピクセルを選択して、セル認識の色パラメータを設定します。
これに基づいて、核、細胞質、および細胞膜のパラメータを設定し、画像に最適なパラメータが見つかるまで、細胞認識状況をリアルタイムで観察します。 - 正の細胞認識閾値を設定し、適切な閾値が調整されるまでリアルタイムに認識状況を観察します。
- アルゴリズムで組織分類器を選択し、組織分類器で組織部分をチェックして、組織に基づいて細胞を識別します。この時点で、解析アルゴリズムの確立は完了です。
- 画像解析の実行
- 解析エリアを選択します。確立されたアルゴリズムを使用して画像を解析します。
- ソフトウェア解析が終了したら、組織認識、陰性および陽性の細胞認識など、画像認識が正確かどうかを手動で確認します。
- 画像認識が正確でない場合は、アルゴリズムとパラメーターのしきい値を再度調整し、成功するまで画像解析を再実行します。解析結果をエクスポートします。 図 1 を参照してください。
- 他の免疫細胞も、上記の手順に従って分析できます(図1を参照)。さまざまな子宮内膜免疫マーカー(CD56 + uNK細胞、Foxp3 + Treg、CD68 +マクロファージ、CD163 + M2マクロファージ、CD1a + DCおよびCD8 + T細胞25,26)の実際の発現に応じて、さまざまな分析パラメーターを設定します。
- ソフトウェアの計算を通じて、子宮内膜免疫細胞の割合を取得します( 表2を参照)。これを使用して、反復流産患者の子宮内膜内のさまざまな免疫細胞のレベルを評価します。
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Representative Results
子宮内膜免疫細胞を定量的に評価し、人為的な操作ミスによる不安定性を低減するために、免疫組織化学の自動検出とデジタル定量評価システムを用いた子宮内膜免疫細胞のデジタル定量分析プラットフォームを構築しました。不振流産(RM)患者の子宮内膜免疫細胞を着床時に定量的に解析するために、免疫組織化学画像解析プラットフォームを確立しました。すべての子宮内膜組織は、月経周期の黄体中期に収集されました。パラフィン包埋子宮内膜組織を厚さ4 μmのスライドに切片化し、CD56+uNK細胞、Foxp3+Treg、CD163+M2マクロファージ、CD1a+ DC、CD8+ T細胞などの子宮内膜免疫細胞を検出するためにIHC染色を行いました。パノラマスライドをデジタルスライドスキャナーでスキャンし、デジタル画像解析システムで定量分析を行った。子宮内膜免疫細胞の割合を計算するには、免疫細胞の数を子宮内膜細胞の総数で割ります。 (図1および図2)。RM(N = 30)の女性におけるさまざまな子宮内膜免疫細胞の割合を表2に示します。.
図1:黄体中期子宮内膜免疫細胞の解析のための概略ワークフロー。サンプルの収集は、月経周期の黄体期中期、黄体形成ホルモン(LH)サージの7〜9日後に行われました。固定は、10%中性緩衝ホルマリン中で室温で4〜6時間行い、次いでパラフィンワックスに包埋した。黄体期中期の子宮内膜の免疫細胞(CD56+uNK細胞、Foxp3+Treg、CD68+マクロファージ、CD163+M2マクロファージ、CD1a+DC、CD8+T細胞など)を検出するためにIHC染色を行った25,26。市販のスキャナーを用いて組織をスキャンし、免疫組織化学画像解析システムを用いて定量解析を行った。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:陽性免疫細胞を同定するための子宮内膜細胞の免疫染色。RM患者の子宮内膜におけるCD56+uNK細胞、Foxp3+Tregs、CD68+マクロファージ、CD163+M2マクロファージ、CD1a+DCおよびCD8+T細胞の免疫染色。茶色は陽性の免疫細胞を表し、青は核を表します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 一次抗体 | クローン | 希釈 |
| CD56の | 123C3型 | 1/800 |
| フォックスp3 | 236A/E7型 | 1/100 |
| CD163の | セッションID: 10D6 | 1/1200 |
| CD1aの | 10 | 1/200 |
| CD8の | セッションID:4B11 | 1/300 |
表1:免疫組織化学染色中に使用した一次抗体。 この表は、一次抗体のクローンと希釈を示しています。
| 免疫マーカー | 中央値(%) | 最小値 (%) | 最大値 (%) | 平均 (%) | 5パーセンタイル(%) | 95パーセンタイル(%) |
| CD56の | 4.83 | 1.8 | 16.76 | 6.03 | 2.04 | 13.63 |
| フォックスp3 | 0.05 | 0.02 | 0.12 | 0.06 | 0.02 | 0.11 |
| CD68の | 0.78 | 0.37 | 3.62 | 0.99 | 0.44 | 2.67 |
| CD163の | 0.84 | 0.35 | 2.38 | 0.93 | 0.38 | 2.13 |
| CD1aの | 0.04 | 0.01 | 0.11 | 0.05 | 0.01 | 0.1 |
| CD8の | 1.69 | 0.76 | 4.1 | 1.85 | 0.81 | 3.72 |
表2:RMの女性におけるさまざまな子宮内膜免疫細胞の割合。 RM患者におけるCD56 + uNK細胞、Foxp3 + Treg、CD68 +マクロファージ、CD163 + M2マクロファージ、CD1a + DCおよびCD8 + T細胞の割合は、免疫組織化学画像解析プラットフォームによって計算されました。
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Discussion
このプロトコルは、RM患者の子宮内膜免疫細胞を定量的に分析するためのデジタル免疫組織化学画像解析プラットフォームを確立しました。ここでは、RM患者の子宮内膜免疫微小環境を評価するために、6つの子宮内膜免疫マーカーが検出されました。
黄体中期の受容性子宮内膜は、着床と妊娠を成功させるための鍵です27,28。したがって、子宮内膜免疫細胞の割合の評価は、子宮内膜受容性を推定する上で重要な役割を果たします。子宮内膜免疫細胞の分析は、従来の病理学的方法による予測的であるため、臨床応用には役立ちません。現在、免疫細胞の割合を測定するための標準化された方法はなく、妊娠におけるこれらの細胞の役割を理解する上で障壁となっています。従来のIHC分析は、選択された視野と手動カウントに基づいています。免疫細胞の正確な組織セグメンテーションと局在化は、手動分析が主観的であり、観察者のバイアスにつながるため、従来のIHCでは評価できません29。
選択した分野における免疫細胞の分布の解析と比較して、組織のパノラマ解析は、子宮内膜免疫細胞の分布を分析するのにより正確です。機械学習アルゴリズムを利用するデジタル病理学アプローチは、大きな組織領域と複雑な細胞表現型を評価するために、複数の腫瘍でテストされています30,31。本研究では、子宮内膜サンプルのパノラマ画像を取得するための商用システムが導入されました。その後、子宮内膜免疫細胞の割合は、免疫組織化学画像解析システムに基づく自動定量分析を使用して決定されました。
ここで用いる免疫組織化学画像解析システムは、病理組織に特化した画像解析プラットフォームであり、人工知能を用いて組織セグメンテーションを可能とする。このシステムでさまざまなモジュールを使用した多くの研究が報告されています32,33,34。このシステムを用いて、従来の画像処理ソフトでは解析が困難であった様々な病理組織学的変化や所見を定量化しました。例えば、CD56+NK細胞の数は、黄体中期の子宮内膜の全細胞の約5%を占めています。従来の免疫組織化学的分析では、CD56+ NK細胞の数を正確に計算することは困難であり、切片全体の陽性細胞の総数を計算するのに少なくとも30分かかる場合がありますが、ここで使用するシステムでは2〜3分かかります。そこで、ここで用いる免疫組織化学画像解析システムを用いることで、子宮内膜免疫細胞を簡便かつ正確に解析することができる。画像解析による病理所見の定量化は、子宮内膜免疫環境評価の客観性、精度、説得力の向上に貢献します。
但し、記載方法には限界がある。子宮内膜は、妊娠結果に関連するさまざまな免疫細胞で構成されています。したがって、1つまたは2つの免疫マーカーのみを定義するだけでは不十分である可能性があります。したがって、細胞の免疫プロファイリングを包括的に評価するには、マルチパラメトリックアプローチが必要です。
要約すると、このプロトコルは、免疫細胞の定量化のためにRM患者の黄体期中期に子宮内膜切片にデジタル画像解析を適用することに成功し、本研究では、子宮内膜CD56 + uNK、Foxp3 + Treg、CD68 +マクロファージ、CD163 + M2マクロファージ、CD1a + iDCおよびCD8 +の分布を決定するためにパノラマ分析が実施されたと結論付けることができます黄体中期のT細胞。子宮内膜免疫細胞とRM患者の妊娠転帰との関連を裏付けるには、より多くのエビデンスが必要であり、今後の研究はこれに焦点を当てる予定である。これは、デジタル病理学を使用してRM患者の子宮内膜免疫環境を調査した最初の研究でした。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
著者らは、この研究に同意し、サンプルを提供してくれたすべての女性に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
References
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