Summary
Här utvecklades och validerades en digital bildanalysplattform för immunhistokemi för att kvantitativt analysera endometrieimmuncellerna hos patienter med återkommande missfall i implantationsfönstret.
Abstract
För att utvärdera endometrieimmunmikromiljön hos patienter med återkommande missfall (RM) utvecklades och validerades en digital bildanalysplattform för immunhistokemi för att kvantitativt analysera endometrieimmunceller under midlutealfasen. Alla endometriumprover samlades in under mitten av lutealfasen av menstruationscykeln. Paraffinbäddade endometrievävnader snittades i 4 μm tjocka objektglas, och immunhistokemi (IHC) färgning utfördes för att detektera endometrieimmunceller, inklusive CD56+ uNK-celler, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2-makrofager, CD1a+ DCs och CD8+ T-celler. Panoramabilderna skannades med hjälp av en digital diabildsskanner och ett kommersiellt bildanalyssystem användes för kvantitativ analys. Andelen endometrieimmunceller beräknades genom att dividera antalet immunceller i det totala antalet endometrieceller. Med hjälp av det kommersiella bildanalyssystemet kan kvantitativ utvärdering av endometrieimmunceller, som är svåra eller omöjliga att analysera med konventionell bildanalys, enkelt och noggrant analyseras. Denna metodik kan användas för att kvantitativt karakterisera endometriums mikromiljö, inklusive interaktion mellan immunceller, och dess heterogenitet för olika patienter med reproduktiv svikt. Plattformen för kvantitativ utvärdering av endometrieimmunceller kan få viktig klinisk betydelse för diagnostik och behandling av RM-patienter.
Introduction
Återkommande missfall (RM) är förlusten av två eller flera på varandra följande graviditeter och är en komplex sjukdom som uppmärksammats av läkare under de senaste åren. Incidensen av RM hos kvinnor i fertil ålder är 1%-5% 1. Resultat från tidigare studier visar att immunfaktorer är nära associerade med patogenesen av RM 2,3,4,5. Upprätthållande av immunhomeostas vid gränssnittet mellan moder och foster krävs för embryoimplantation och utveckling. Endometrieimmunceller utför flera reglerande roller för att upprätthålla denna homeostas, såsom att främja trofoblastinvasion, omforma spiralartärer och bidra till placentautveckling 6,7,8,9.
Avvikande endometrieimmunceller hos kvinnor med RM har tidigare rapporterats. Resultaten visar ett nära samband mellan den höga tätheten av naturliga mördarceller i livmodern (uNK) och förekomsten av RM10,11,12. Ett ökat antal makrofager har rapporterats i livmoderslemhinnan hos kvinnor med RM, jämfört med de som fött13 barn levande. Regulatoriska T-celler (Treg) spelar en roll i moderns immuntolerans mot embryot, och deras nivå och funktion är nedsatt i decidua hos RM-patienter14. Cytotoxicitet T-celler (CTL) och dendritiska celler (DC) spelar också en roll i immunregleringen av graviditet15,16. Därför kan en omfattande kvantitativ analys av lokala endometrieimmunceller under den mellersta lutealfasen bidra till att bättre förstå patogenesen av RM. Vissa nuvarande metoder för kvantitativ analys av endometrieimmunceller använder flödescytometri som exakt kan märka immunceller med flera markörer17,18. Den kliniska tillämpningen av flödescytometri är dock begränsad eftersom den endast kan utföras på färsk vävnad. Att få färsk vävnad är endast möjligt när en stor volym av överskottstumör finns tillgänglig, en sällsynt händelse för endometrium. Immunhistokemi kan observera vävnadsmorfologi väl in situ och kan även märka olika immunceller, medan traditionella immunhistokemiska tekniker inte kan utföra kvantitativ analys av immunceller.
Jämfört med konventionella immunhistokemiska experiment har kvantitativ immunhistokemisk analys av immunceller i livmoderslemhinnan viktig klinisk betydelse. IHC-intensitetspoäng rankas vanligtvis på en fyrgradig skala eller stark och svag inom patologisk diagnostik och forskning 19,20,21. Denna semikvantitativa teknik är dock subjektiv, mycket felaktig och uppvisar betydande variabilitet inom och mellan observatörer22. En möjlig lösning är tillämpning av maskininlärning, vilket är värdefullt inom digital bildanalys23,24. Genom att tillhandahålla kvantitativa mätningar möjliggör detta tillvägagångssätt en mer exakt bedömning av immuncellernas infiltration, distribution och densitet i livmodervävnaden. Denna kvantitativa information kan hjälpa till att belysa de dynamiska förändringarna i immuncellspopulationer under menstruationscykeln och vid olika patologiska tillstånd. Sammantaget ger förmågan att kvantitativt analysera immunceller i livmoderslemhinnan genom immunhistokemi värdefulla insikter i livmoderns immunmikromiljö.
Därför syftade protokollet till att utveckla och validera en digital bildanalysplattform för immunhistokemi för att kvantitativt analysera endometrieimmunceller inklusive uNK-celler, Tregs, makrofager, DCs och cytotoxiska T-celler under mid-lutealfasen hos RM-patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningsinnehållet och protokollet har granskats etiskt och godkänts av den forskningsetiska kommittén vid Shenzhen Zhongshan Urology Hospital. Alla kvinnor (20-40 år) som deltog i studien gav informerat samtycke för provtagning och användning.
1. Förvärv av patologisk vävnad
- Förbered verktygen för vävnadsskörd, nämligen mätlinjal, pincett, inbäddningskassett, inbäddningspapper och vävnadskorg.
- Observera om mängden endometrievävnad (större än en mungböna), som samlas in med en standardmetod med en pipelle-kateter, är tillräcklig.
- Överför endometrievävnaden från formalin till inbäddningspapperet med en pincett och mät endometrievävnadens dimensioner med en linjal.
- Linda in endometrievävnaden med inbäddningspapper och lägg den i en inbäddningskassett.
- Placera inbäddningskassetten i vävnadskorgen för uttorkning.
2. Uttorkning av vävnad
- Sätt in vävnadskorgen i dehydratorns reaktionskammare (se materialförteckning) och starta proceduren för rutinmässig vävnadsuttorkning: formalin i 100 min; formalin i 100 min; 75 % alkohol i 60 min; 85 % alkohol i 60 min; 95 % alkohol i 60 min; 100 % alkohol i 60 min; 100 % alkohol i 60 min; 100 % alkohol i 60 min; xylen i 35 min; xylen i 20 min; xylen i 20 min; vax i 80 min; vax i 80 min; Vaxa i 80 min. Processen tar ca 15 timmar.
- I slutet av vävnadsuttorkningsproceduren, öppna dehydratorns reaktionskammare, ta bort vävnadskorgen.
3. Inbäddning av vävnad
- Ta ut en lämplig inbäddningsform beroende på provets storlek och fyll med paraffinvax vid 70 ° C.
- Placera snabbt vävnaden i formen och justera försiktigt så att vävnaden ligger i mitten av formen.
- Flytta formen smidigt till kylplattan och tryck försiktigt på vävnaden medan paraffinet i botten stelnar.
- Lägg inbäddningskassetten ovanpå formen och fyll på med mer vax.
- Placera formen på kylplattan och när paraffinet är helt stelnat, ta bort blocket med den bifogade kassetten bort från formen.
4. Vävnadssnitt
- Sätt in blocket på sampklämman på mikrotomen, placera bladet i hållaren, justera vinkeln mellan blockplanet och bladet, justera sektionens tjocklek till 4 μm, vrid handhjulet och börja skivningen.
- Exponera lämplig vävnadsyta genom att skära några tunna sektioner från blocket. Ta ut de kontinuerliga och kompletta sektionerna med borsten.
- När tillräckligt många sektioner har skurits, sluta vrida på handhjulet, ta bort de okvalificerade sektionerna i framänden med en pincett och flyt sektionerna på ytan av 42 °C vatten i vattenbadet med pincett och borste.
- När sektionerna är helt platta, plocka sektionerna på anti-lossningsglas och överför till en glasvärmare vid 65 °C för att grädda i 60 minuter.
- När gräddningen är klar tar du ut glasskivorna från glidvärmaren.
5. Immunhistokemisk färgning
- Späd den primära antikroppen till en arbetslösning med antikroppsspädningsvätska. Se tabell 1 för mer information.
- Placera den utspädda antikroppslösningen i en speciell reagensflaska och detektionssatsen i reagensfacket på ett automatiskt IHC-färgningsinstrument (se materialförteckning).
- Placera objektglasen på en objektglashållare, täckt med en speciell täckplatta, och sätt in dem i instrumentets experimentella reaktionsfack.
- När instrumentet automatiskt känner igen reagenset och experimentell information på objektglaset, klicka på Start-knappen för att starta den immunhistokemiska färgningen. Experimentet varar i ca 3 timmar.
6. Uttorkning och tätning av objektglaset
- Efter immunhistokemisk färgning, ta ut objektglashållaren, ta av den speciella täckplattan, sätt den färgade bilden i objektglashållaren och tvätta bort det återstående färgämnet på objektglaset med rent vatten.
- Överför glidhållaren till en automatiserad täcktofflor (se materialförteckning), välj och kör uttorknings- och tätningsproceduren.
- Ta ut glasen efter uttorkning och försegling.
7. Skanna bild
- Lägg objektglasen på objektglasstället på den panoramiska patologiska bildskannern (se materialtabell) och placera den i instrumentglasets skanningsfack för panoramapatologisk bildskanning. Skanningen tar 2 min. Se figur 1.
8. Analys av bilder
- Importera bild
- Öppna det patologiska bildanalysprogrammet (se Materialförteckning) och skapa en ny mapp. Importera immunhistokemiska bilder som ska analyseras.
- Skapa en vävnadsklassificerare
- Markera flera vävnader och blanka anteckningar för att träna och upprätta en klassificerare för att identifiera vävnaden respektive det tomma området.
- Använd realtidsjustering för att observera programvarans igenkänningskapacitet i realtid under markeringsanteckningar. Om identifieringen inte sker i rätt tid, anteckna och träna igen tills vävnadsigenkänningen är korrekt.
- Skapa analysalgoritm
- Välj standardalgoritmen i programvaran enligt typen av experiment: multiplex IHC.
- Ställ in färgparametrarna för celligenkänning genom att välja typiska negativa och positiva pixlar.
På grundval av detta, ställ in parametrarna för kärna, cytoplasma och cellmembran och observera celligenkänningssituationen i realtid tills de mest lämpliga parametrarna för bilden har hittats. - Ställ in tröskelvärdet för positiv celligenkänning och observera igenkänningssituationen i realtid tills lämplig tröskel justeras.
- Välj vävnadsklassificeraren i algoritmen och kontrollera vävnadsdelen i vävnadsklassificeraren för att identifiera celler på basis av vävnader. Vid denna tidpunkt är upprättandet av en analysalgoritm klar.
- Köra bildanalys
- Välj analysområde. Använd den etablerade algoritmen för att analysera bilder.
- När programvaruanalysen har analyserats kontrollerar du manuellt om bildigenkänningen är korrekt, inklusive vävnadsigenkänning, negativ och positiv celligenkänning.
- Om bildigenkänningen inte är korrekt justerar du algoritmen och parametertröskeln igen och kör bildanalysen igen tills den lyckas. Exportera resultatet av analysen. Se figur 1.
- Andra immunceller kan också analyseras enligt stegen ovan (se figur 1). Ställ in olika analysparametrar beroende på det faktiska uttrycket av olika endometrieimmunmarkörer (CD56+uNK-celler, Foxp3+Tregs, CD68+-makrofager, CD163+M2-makrofager, CD1a+DCs och CD8+T-celler25,26).
- Genom beräkning av programvaran erhållas andelen endometrieimmunceller (se tabell 2). Använd detta för att utvärdera nivåerna av olika immunceller i livmoderslemhinnan hos patienter med återkommande missfall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utvärdera endometrieimmunceller kvantitativt och minska den instabilitet som orsakas av konstgjorda operativa misstag, etablerade vi en digital kvantitativ analysplattform för endometrieimmunceller genom att använda automatisk immunhistokemisk detektion och digitalt kvantitativt utvärderingssystem. Immunohistokemisk bildanalysplattform etablerades för att kvantitativt analysera endometrieimmunceller hos patienter med återkommande missfall (RM) i implantationsfönstret. Alla vävnader i livmoderslemhinnan samlades in under den mellersta lutealfasen av menstruationscykeln. Paraffininbäddade endometrievävnader snittades i 4 μm tjocka objektglas, och IHC-färgning utfördes för att detektera endometrieimmunceller, inklusive CD56+uNK-celler, Foxp3+Tregs, CD163+M2-makrofager, CD1a+ DCs och CD8+ T-celler. Panoramabilderna skannades med hjälp av den digitala diabildsskannern och kvantitativ analys utfördes med hjälp av ett digitalt bildanalyssystem. För att beräkna procentandelen endometrieimmunceller, dividera antalet immunceller med det totala antalet endometrieceller. (Figur 1 och Figur 2). Andelen olika endometrieimmunceller hos kvinnor med RM (N=30) visas i tabell 2.
Figur 1: Schematiskt arbetsflöde för analys av immunceller i midluteal endometrie. Provtagning gjordes under mitten av lutealfasen av menstruationscykeln, 7-9 dagar efter ökningen av teluteiniserande hormon (LH). Fixering gjordes i 10% neutralt buffrat formalin i 4-6 timmar vid rumstemperatur och bäddades sedan in i paraffinvax. IHC-färgning utfördes för detektion av immunceller i endometrium under den mellersta lutealfasen, inklusive CD56+uNK-celler, Foxp3+Tregs, CD68+ makrofager, CD163+M2-makrofager, CD1a+DCs och CD8+T-celler25,26. Vävnaderna skannades med hjälp av en kommersiell skanner och kvantitativ analys utfördes med hjälp av det immunhistokemiska bildanalyssystemet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Immunfärgning av endometrieceller för identifiering av positiva immunceller. Immunfärgning av CD56+uNK-celler, Foxp3+Tregs, CD68+ makrofager, CD163+M2-makrofager, CD1a+DCs och CD8+T-celler i endometrium från RM-patienter. Brunt representerar positiva immunceller och blått representerar kärnan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Primär antikropp | Klon | Utspädning |
| CD56 | 123C3 | 1/800 |
| Foxp3 | 236A/E7 | 1/100 |
| CD163 | 10D6 | 1/1200 |
| CD1a | 10 | 1/200 |
| CD8 | 4B11 | 1/300 |
Tabell 1: Primära antikroppar som används vid immunhistokemisk färgning. Tabellen visar kloning och spädning av de primära antikropparna.
| Immunmarkörer | Medianvärde (%) | Minimum (%) | Högst (%) | Medelvärde (%) | 5:e percentilen (%) | 95:e percentilen (%) |
| CD56 | 4.83 | 1.8 | 16.76 | 6.03 | 2.04 | 13.63 |
| Foxp3 | 0.05 | 0.02 | 0.12 | 0.06 | 0.02 | 0.11 |
| CD68 | 0.78 | 0.37 | 3.62 | 0.99 | 0.44 | 2.67 |
| CD163 | 0.84 | 0.35 | 2.38 | 0.93 | 0.38 | 2.13 |
| CD1a | 0.04 | 0.01 | 0.11 | 0.05 | 0.01 | 0.1 |
| CD8 | 1.69 | 0.76 | 4.1 | 1.85 | 0.81 | 3.72 |
Tabell 2: Andel olika endometrieimmunceller hos kvinnor med RM. Andelen CD56+uNK-celler, Foxp3+Tregs, CD68+ makrofager, CD163+M2-makrofager, CD1a+DCs och CD8+T-celler hos RM-patienter beräknades med immunohistokemisk bildanalysplattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll etablerade en digital bildanalysplattform för immunhistokemi för att kvantitativt analysera endometrieimmunceller hos RM-patienter. Här upptäcktes sex endometrieimmunmarkörer för att utvärdera endometrieimmunmikromiljön hos RM-patienter.
Ett receptivt livmoderslemhinna under mitten av lutealfasen är nyckeln till framgångsrik implantation och graviditet27,28. Därför spelar utvärdering av procentuella endometrieimmunceller en viktig roll för att uppskatta endometriemottagligheten. Endometrieimmuncellsanalys, med konventionella patologiska metoder, är prediktiv så den hjälper inte vid klinisk tillämpning. För närvarande finns det ingen standardiserad metod för mätning av andelen immunceller, vilket utgör ett hinder för att förstå dessa cellers roll under graviditeten. Konventionell IHC-analys baseras på utvalda synfält och manuell räkning. Exakt vävnadssegmentering och lokalisering av immunceller kan inte utvärderas med konventionell IHC eftersom manuell analys är subjektiv vilket leder till observatörsbias29.
Jämfört med analys av fördelningen av immunceller inom det valda området är panoramaanalys av vävnader mer exakt för att analysera fördelningen av endometrieimmunceller. Digitala patologimetoder som använder maskinbaserade inlärningsalgoritmer har testats i flera tumörer för att utvärdera stora vävnadsområden och komplexa cellfenotyper30,31. I den aktuella studien introducerades ett kommersiellt system för att få en panoramabild av endometriumprover. Andelen endometrieimmunceller bestämdes därefter med hjälp av en automatiserad kvantitativ analys baserad på det immunhistokemiska bildanalyssystemet.
Det immunhistokemiska bildanalyssystemet som används här är en bildanalysplattform specialiserad på patologiska vävnader, som möjliggör vävnadssegmentering med hjälp av artificiell intelligens. Många studier som använder olika moduler med detta system har rapporterats32,33,34. Systemet användes för att kvantifiera olika histopatologiska förändringar och fynd som var svåra att analysera med konventionell bildbehandlingsprogramvara. Till exempel står antalet CD56+NK-celler för cirka 5 % av det totala antalet celler i livmoderslemhinnan under den mellersta lutealfasen. Traditionell immunhistokemisk analys är svår att exakt beräkna antalet CD56+ NK-celler, och det kan ta minst 30 minuter att beräkna det totala antalet positiva celler på hela sektionen, men det tar 2-3 min med det system som används här. Därför, med hjälp av det immunhistokemiska bildanalyssystemet som används här, kan endometrieimmunceller enkelt och noggrant analyseras. Kvantifiering av patologiska fynd genom bildanalys kan bidra till att förbättra objektiviteten, precisionen och övertalningsförmågan vid utvärdering av endometrieimmunmiljön.
Det finns dock en begränsning i den beskrivna metoden. Endometrium består av olika immunocyter som har ett samband med graviditetsutfall. Därför kan det vara otillräckligt att bara definiera en eller två immunmarkörer. Därför behövs multiparametriska metoder för att på ett heltäckande sätt bedöma immunprofilering av celler.
Sammanfattningsvis kan man dra slutsatsen att detta protokoll framgångsrikt har tillämpat digital bildanalys i endometriesektioner under mid-lutealfasen av RM-patienter för kvantifiering av immunceller och panoramaanalys genomfördes i denna studie för att bestämma fördelningen av endometrie-CD56+ uNKs, Foxp3+Tregs, CD68+ makrofager, CD163+ M2-makrofager, CD1a+ iDCs och CD8+T-celler under mitten av lutealfasen. Mer evidens krävs för att stödja sambandet mellan endometrieimmunceller och graviditetsutfall hos patienter med RM och framtida studier kommer att fokusera på detta. Detta var den första studien som undersökte endometrieimmunmiljön hos RM-patienter med hjälp av digital patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för alla kvinnor som samtyckt och donerat prover till denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
References
- Practice Committee of the American Society for Reproductive. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).
- Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J.
- Kavvadas, D., et al. Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss. 12 (2), 177-193 (2022).
- Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).
- Du, M., et al. Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss. Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).
- Faas, M. M., de Vos, P. Uterine NK cells and macrophages in pregnancy. Placenta. 56, 44-52 (2017).
- Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).
- Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106 (2017).
- Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy. American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).
- Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study. Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).
- Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).
- Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF. Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).
- Laird, S. M., et al. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).
- Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review. Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).
- Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. The endometrial immune environment of women with endometriosis. Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).
- Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface. Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).
- Hey-Cunningham, A. J., et al. Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis. Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).
- Zhong, Q., et al. Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages. Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).
- Attems, J., et al. Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study. Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).
- Kovacs, G. G., et al. Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG). Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).
- Modis, L. V., et al. Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology. Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2. Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).
- Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).
- Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion. Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).
- Diao, L., et al. New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI. Placenta. 99, 180-188 (2020).
- Hewitt, S. C., Korach, K. S. Cell biology. A hand to support the implantation window. Science. 331 (6019), 863-864 (2011).
- Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).
- Algars, A., et al. Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients. International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
- Ascierto, M. L., et al. Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy. Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).
- O'Rourke, D. M., et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).
- Canesin, G., et al. Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).
