Summary
Qui, è stata sviluppata e convalidata una piattaforma digitale di analisi delle immagini immunoistochimiche per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali di pazienti con aborti spontanei ricorrenti nella finestra di impianto.
Abstract
Per valutare il microambiente immunitario endometriale delle pazienti con aborto spontaneo ricorrente (RM), è stata sviluppata e convalidata una piattaforma di analisi delle immagini di immunoistochimica digitale per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali durante la fase luteale media. Tutti i campioni di endometrio sono stati raccolti durante la fase luteale media del ciclo mestruale. I tessuti endometriali inclusi in paraffina sono stati sezionati in vetrini spessi 4 μm ed è stata eseguita la colorazione immunoistochimica (IHC) per rilevare le cellule immunitarie dell'endometrio, comprese le cellule uNK CD56+, le Treg Foxp3+, i macrofagi CD163+ M2, le DC CD1a+ e le cellule T CD8+. I vetrini panoramici sono stati scansionati utilizzando uno scanner digitale per diapositive e per l'analisi quantitativa è stato utilizzato un sistema commerciale di analisi delle immagini. La percentuale di cellule immunitarie endometriali è stata calcolata dividendo il numero di cellule immunitarie nelle cellule endometriali totali. Utilizzando il sistema di analisi delle immagini commerciale, la valutazione quantitativa delle cellule immunitarie endometriali, che sono difficili o impossibili da analizzare con l'analisi convenzionale delle immagini, potrebbe essere analizzata facilmente e accuratamente. Questa metodologia può essere applicata per caratterizzare quantitativamente il microambiente endometriale, compresa l'interazione tra le cellule immunitarie, e la sua eterogeneità per le diverse pazienti con insufficienza riproduttiva. La piattaforma per la valutazione quantitativa delle cellule immunitarie endometriali può essere di importante importanza clinica per la diagnosi e il trattamento delle pazienti con RM.
Introduction
L'aborto spontaneo ricorrente (RM) è la perdita di due o più gravidanze consecutive ed è una malattia complessa che ha attirato l'attenzione dei medici negli ultimi anni. Il tasso di incidenza della RM nelle donne in età fertile è dell'1%-5% 1. I risultati di studi precedenti mostrano che i fattori immunitari sono strettamente associati alla patogenesi di RM 2,3,4,5. Il mantenimento dell'omeostasi immunitaria all'interfaccia materno-fetale è necessario per l'impianto e lo sviluppo dell'embrione. Le cellule immunitarie dell'endometrio svolgono diversi ruoli regolatori per mantenere questa omeostasi, come promuovere l'invasione del trofoblasto, rimodellare le arterie spirali e contribuire allo sviluppo della placenta 6,7,8,9.
In precedenza sono state segnalate cellule immunitarie endometriali aberranti nelle donne con RM. I risultati mostrano una stretta associazione tra l'alta densità di cellule natural killer uterine (uNK) e la presenza di RM10,11,12. Un aumento del numero di macrofagi è stato riportato nell'endometrio delle donne con RM, rispetto a quelle che hanno avuto un parto vivo13. Le cellule T regolatorie (Treg) svolgono un ruolo nella tolleranza immunitaria materna nei confronti dell'embrione e il loro livello e la loro funzione sono diminuiti nella decidua dei pazienti con RM14. Anche le cellule T di citotossicità (CTL) e le cellule dendritiche (DC) svolgono un ruolo nella regolazione immunitaria della gravidanza15,16. Pertanto, un'analisi quantitativa completa delle cellule immunitarie endometriali locali durante la fase medio-luteale potrebbe aiutare a comprendere meglio la patogenesi della RM. Alcuni metodi attuali per l'analisi quantitativa delle cellule immunitarie endometriali utilizzano la citometria a flusso che può marcare con precisione le cellule immunitarie con più marcatori17,18. Tuttavia, l'applicazione clinica della citometria a flusso è limitata perché può essere eseguita solo su tessuto fresco. L'ottenimento di tessuto fresco è possibile solo quando è disponibile un grande volume di tumore in eccesso, un evento raro per l'endometrio. L'immunoistochimica può osservare bene la morfologia dei tessuti in situ e può anche marcare varie cellule immunitarie, mentre le tecniche immunoistochimiche tradizionali non possono eseguire analisi quantitative delle cellule immunitarie.
Rispetto agli esperimenti di immunoistochimica convenzionali, l'analisi immunoistochimica quantitativa delle cellule immunitarie nell'endometrio ha un importante significato clinico. Il punteggio dell'intensità IHC è solitamente classificato su una scala a quattro punti o forte e debole nella diagnostica e nella ricerca patologica 19,20,21. Tuttavia, questa tecnica semi-quantitativa è soggettiva, altamente imprecisa e dimostra una significativa variabilità intra-osservatore e inter-osservatore22. Una possibile soluzione è l'applicazione dell'apprendimento automatico, che è prezioso nell'analisi digitaledelle immagini 23,24. Fornendo misurazioni quantitative, questo approccio consente una valutazione più precisa dell'infiltrazione, della distribuzione e della densità delle cellule immunitarie all'interno del tessuto uterino. Queste informazioni quantitative possono aiutare a chiarire i cambiamenti dinamici nelle popolazioni di cellule immunitarie durante il ciclo mestruale e in varie condizioni patologiche. Nel complesso, la capacità di analizzare quantitativamente le cellule immunitarie nell'endometrio attraverso l'immunoistochimica offre preziose informazioni sul microambiente immunitario dell'utero.
Pertanto, il protocollo mirava a sviluppare e convalidare una piattaforma di analisi delle immagini di immunoistochimica digitale per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie dell'endometrio, comprese le cellule uNK, le Treg, i macrofagi, le DC e le cellule T citotossiche durante la fase luteale media nelle pazienti con RM.
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Protocol
Il contenuto e il protocollo della ricerca sono stati esaminati eticamente e approvati dal comitato etico di ricerca dell'ospedale urologico di Shenzhen Zhongshan. Tutte le donne (20-40 anni) coinvolte nello studio hanno fornito il consenso informato per la raccolta e l'utilizzo del campione.
1. Acquisizione di tessuto patologico
- Preparare gli strumenti per la raccolta dei tessuti, vale a dire righello di misurazione, pinzetta, cassetta per inclusione, carta per inclusione e cestello per tessuti.
- Osservare se la quantità di tessuto endometriale (più grande di un fagiolo mung), raccolta utilizzando un approccio standard con un catetere pipelle, è sufficiente.
- Trasferisci il tessuto endometriale dalla formalina sulla carta da inclusione con una pinzetta e misura le dimensioni del tessuto endometriale con un righello.
- Avvolgere il tessuto endometriale con carta da inclusione e posizionarlo in una cassetta per inclusione.
- Posizionare la cassetta di inclusione nel cestello dei tessuti per la disidratazione.
2. Disidratazione dei tessuti
- Mettere il cestello di tessuto nella camera di reazione del disidratatore (vedi Tabella dei materiali) e iniziare la procedura per la disidratazione tissutale di routine: formalina per 100 min; formalina per 100 min; 75% di alcol per 60 min; alcol all'85% per 60 min; 95% di alcol per 60 min; 100% alcol per 60 min; 100% alcol per 60 min; 100% alcol per 60 min; xilene per 35 min; xilene per 20 min; xilene per 20 min; cera per 80 min; cera per 80 min; cera per 80 min. Il processo dura circa 15 ore.
- Al termine della procedura di disidratazione dei tessuti, aprire la camera di reazione del disidratatore, rimuovere il cestello di tessuto.
3. Inclusione dei tessuti
- Estrarre uno stampo da incasso adatto in base alle dimensioni del campione e riempire con cera di paraffina a 70 ° C.
- Posizionare rapidamente il tessuto nello stampo e regolare con cura in modo che il tessuto si trovi al centro dello stampo.
- Spostare lo stampo senza intoppi sulla piastra di raffreddamento e premere delicatamente il tessuto mentre la paraffina sul fondo si solidifica.
- Metti la cassetta di inclusione sopra lo stampo e riempi con altra cera.
- Posizionare lo stampo sulla piastra di raffreddamento e, quando la paraffina è completamente solidificata, rimuovere il blocco con la cassetta attaccata lontano dallo stampo.
4. Sezioni di tessuto
- Inserire il blocco sulla clip del campione del microtomo, posizionare la lama nel supporto, regolare l'angolo tra il piano del blocco e la lama, regolare lo spessore della sezione a 4 μm, ruotare il volantino e iniziare l'affettatura.
- Esporre la superficie del tessuto appropriata tagliando alcune sezioni sottili dal blocco. Estrarre le sezioni continue e complete con il pennello.
- Quando un numero sufficiente di sezioni è stato tagliato, smettere di girare il volantino, rimuovere le sezioni non qualificate all'estremità anteriore con una pinzetta e far galleggiare le sezioni sulla superficie di acqua a 42 °C a bagnomaria con pinzette e pennello.
- Dopo che le sezioni sono completamente appiattite, prelevare le sezioni su vetrini antidistacco e trasferirle in uno scaldino a 65 °C per cuocere per 60 min.
- Al termine della cottura, estrarre i vetrini dallo scaldavetrini.
5. Colorazione immunoistochimica
- Diluire l'anticorpo primario in una soluzione di lavoro con diluente anticorpale. Vedere la Tabella 1 per i dettagli.
- Mettere la soluzione anticorpale diluita in uno speciale flacone di reagenti e il kit di rilevamento nello scomparto dei reagenti di uno strumento di colorazione automatico IHC (vedere Tabella dei materiali).
- Posizionare i vetrini su un supporto per vetrini, coperto da un'apposita coprente, e inserirli nel vano di reazione sperimentale dello strumento.
- Dopo che lo strumento ha riconosciuto automaticamente il reagente e le informazioni sperimentali sul vetrino, fare clic sul pulsante Start per avviare la colorazione immunoistochimica. L'esperimento dura circa 3 ore.
6. Disidratazione e sigillatura del vetrino
- Dopo la colorazione immunoistochimica, estrarre il supporto per vetrini, rimuovere la speciale piastrella di copertura, inserire il vetrino colorato nel supporto per vetrini e lavare via il colorante rimanente sul vetrino con acqua pulita.
- Trasferire il portavetrini su un montavetrini automatizzato (vedi Tabella dei materiali), selezionare ed eseguire la procedura di disidratazione e sigillatura.
- Estrarre i vetrini dopo la disidratazione e la sigillatura.
7. Scansione del vetrino
- Posizionare i vetrini sul rack per vetrini dello scanner di immagini patologiche panoramiche (vedere Tabella dei materiali) e posizionarlo nello scomparto di scansione dei vetrini dello strumento per la scansione di immagini patologiche panoramiche. La scansione richiede 2 minuti. Vedere la Figura 1.
8. Analisi delle immagini
- Importa immagine
- Aprire il software di analisi delle immagini patologiche (vedi Tabella dei materiali) e creare una nuova cartella. Importare immagini immunoistochimiche da analizzare.
- Costruire un classificatore di tessuti
- Contrassegnare diversi tessuti e l'annotazione vuota per addestrare e stabilire un classificatore per identificare rispettivamente il tessuto e l'area vuota.
- Utilizza l'ottimizzazione in tempo reale per osservare la capacità di riconoscimento del software in tempo reale durante l'annotazione dei segni. Se il riconoscimento non è tempestivo, annotare l'annotazione e addestrarsi di nuovo fino a quando il riconoscimento del tessuto non è accurato.
- Algoritmo di analisi della build
- Selezionare l'algoritmo standard nel software in base al tipo di esperimento: multiplex IHC.
- Impostare i parametri di colore del riconoscimento delle celle selezionando i pixel negativi e positivi tipici.
Su questa base, imposta i parametri di nucleo, citoplasma e membrana cellulare e osserva la situazione di riconoscimento cellulare in tempo reale fino a quando non sono stati trovati i parametri più adatti per l'immagine. - Impostare la soglia positiva di riconoscimento delle celle e osservare la situazione di riconoscimento in tempo reale fino a quando non viene regolata la soglia appropriata.
- Selezionare il classificatore di tessuti nell'algoritmo e controllare la parte di tessuto nel classificatore di tessuti, in modo da identificare le cellule sulla base dei tessuti. A questo punto, la creazione di un algoritmo di analisi è completata.
- Eseguire l'analisi delle immagini
- Selezionate l'area di analisi. Usa l'algoritmo stabilito per analizzare le immagini.
- Al termine dell'analisi del software, verificare manualmente se il riconoscimento dell'immagine è accurato, incluso il riconoscimento dei tessuti, il riconoscimento delle cellule negative e positive.
- Se il riconoscimento dell'immagine non è accurato, regolare nuovamente l'algoritmo e la soglia dei parametri ed eseguire nuovamente l'analisi dell'immagine fino a quando non ha esito positivo. Esportare i risultati dell'analisi. Vedere la Figura 1.
- Anche altre cellule immunitarie possono essere analizzate in base ai passaggi precedenti (vedi Figura 1). Impostare diversi parametri di analisi in base all'effettiva espressione di diversi marcatori immunitari endometriali (cellule CD56+uNK, Foxp3+Tregs, macrofagi CD68+, macrofagi CD163+M2, CD1a+DC e cellule CD8+T25,26).
- Attraverso il calcolo del software, ottenere la proporzione di cellule immunitarie endometriali (vedi Tabella 2). Usalo per valutare i livelli di varie cellule immunitarie nell'endometrio di pazienti con aborto spontaneo ricorrente.
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Representative Results
Al fine di valutare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali e ridurre l'instabilità causata da errori operativi causati dall'uomo, abbiamo creato una piattaforma di analisi quantitativa digitale per le cellule immunitarie endometriali utilizzando il rilevamento immunoistochimico automatico e il sistema di valutazione quantitativa digitale. La piattaforma di analisi delle immagini immunoistochimiche è stata istituita per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali di pazienti con aborto spontaneo ricorrente (RM) nella finestra di impianto. Tutti i tessuti endometriali sono stati raccolti durante la fase luteale media del ciclo mestruale. I tessuti endometriali inclusi in paraffina sono stati sezionati in vetrini spessi 4 μm ed è stata eseguita la colorazione IHC per rilevare le cellule immunitarie dell'endometrio, comprese le cellule CD56 + uNK, Foxp + Tregs, i macrofagi CD163 + M2, le DC CD1a + e le cellule T CD8 +. I vetrini panoramici sono stati scansionati utilizzando lo scanner digitale per diapositive e l'analisi quantitativa è stata eseguita utilizzando un sistema di analisi digitale delle immagini. Per calcolare la percentuale di cellule immunitarie endometriali, dividere il numero di cellule immunitarie per il numero totale di cellule endometriali. (Figura 1 e Figura 2). La proporzione di diverse cellule immunitarie endometriali nelle donne con RM (N=30) è mostrata nella Tabella 2.
Figura 1: Flusso di lavoro schematico per l'analisi delle cellule immunitarie dell'endometrio luteale medio. La raccolta dei campioni è stata effettuata durante la fase luteale media del ciclo mestruale, a 7-9 giorni dopo il picco dell'ormone luteinizzante (LH). La fissazione è stata effettuata in formalina tamponata neutra al 10% per 4-6 ore a temperatura ambiente, quindi incorporata in cera di paraffina. La colorazione IHC è stata eseguita per rilevare le cellule immunitarie nell'endometrio durante la fase luteale media, comprese le cellule CD56 + uNK, Foxp3 + Tregs, i macrofagi CD68 +, i macrofagi CD163 + M2, le cellule CD1a + DC e le cellule CD8 + T25,26. I tessuti sono stati scansionati utilizzando uno scanner commerciale e l'analisi quantitativa è stata eseguita utilizzando il sistema di analisi delle immagini immunoistochimiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immunocolorazione delle cellule endometriali per l'identificazione di cellule immunitarie positive. Immunocolorazione di cellule CD56 + uNK, Foxp + Tregs, macrofagi CD68 + , macrofagi CD163 + M2, cellule CD1a + DC e CD8 + T nell'endometrio di pazienti con RM. Il marrone rappresenta le cellule immunitarie positive e il blu rappresenta il nucleo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Anticorpo primario | Clone | Diluizione |
| CD56 | 123C3 | 1/800 |
| Foxp3 | 236A/E7 | 1/100 |
| CD163 | 10D6 | 1/1200 |
| CD1a | 10 | 1/200 |
| CD8 | 4B11 | 1/300 |
Tabella 1: Anticorpi primari utilizzati durante la colorazione immunoistochimica. La tabella mostra la clonazione e la diluizione degli anticorpi primari.
| Marcatori immunitari | Mediana (%) | Minimo (%) | Massimo (%) | Media (%) | 5° percentile (%) | 95° percentile (%) |
| CD56 | 4.83 | 1.8 | 16.76 | 6.03 | 2.04 | 13.63 |
| Foxp3 | 0.05 | 0.02 | 0.12 | 0.06 | 0.02 | 0.11 |
| CD68 | 0.78 | 0.37 | 3.62 | 0.99 | 0.44 | 2.67 |
| CD163 | 0.84 | 0.35 | 2.38 | 0.93 | 0.38 | 2.13 |
| CD1a | 0.04 | 0.01 | 0.11 | 0.05 | 0.01 | 0.1 |
| CD8 | 1.69 | 0.76 | 4.1 | 1.85 | 0.81 | 3.72 |
Tabella 2: Percentuale di varie cellule immunitarie endometriali nelle donne con RM. La percentuale di cellule CD56+uNK, Foxp3+Tregs, macrofagi CD68+, macrofagi CD163+M2, CD1a+DC e cellule CD8+T nei pazienti RM è stata calcolata mediante piattaforma di analisi delle immagini immunoistochimiche.
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Discussion
Questo protocollo ha stabilito una piattaforma digitale di analisi delle immagini immunoistochimiche per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali delle pazienti RM. Qui, sono stati rilevati sei marcatori immunitari endometriali per valutare il microambiente immunitario endometriale nelle pazienti con RM.
Un endometrio ricettivo durante la fase luteale media è fondamentale per il successo dell'impianto e della gravidanza27,28. Pertanto, la valutazione della percentuale di cellule immunitarie endometriali svolge un ruolo importante nella stima della ricettività endometriale. L'analisi delle cellule immunitarie endometriali, con metodi patologici convenzionali, è predittiva, quindi non aiuta nell'applicazione clinica. Attualmente, non esiste un metodo standardizzato per la misurazione della percentuale di cellule immunitarie, il che rappresenta un ostacolo alla comprensione del ruolo di queste cellule in gravidanza. L'analisi IHC convenzionale si basa su campi visivi selezionati e sul conteggio manuale. La segmentazione precisa dei tessuti e la localizzazione delle cellule immunitarie non possono essere valutate con l'IHC convenzionale perché l'analisi manuale è soggettiva e porta a bias dell'osservatore29.
Rispetto all'analisi della distribuzione delle cellule immunitarie nel campo selezionato, l'analisi panoramica dei tessuti è più accurata per analizzare la distribuzione delle cellule immunitarie endometriali. Gli approcci di patologia digitale che utilizzano algoritmi di apprendimento automatico sono stati testati in più tumori per valutare ampie aree di tessuto e fenotipi cellulari complessi30,31. Nel presente studio è stato introdotto un sistema commerciale per ottenere un'immagine panoramica dei campioni di endometrio. La percentuale di cellule immunitarie endometriali è stata successivamente determinata utilizzando un'analisi quantitativa automatizzata basata sul sistema di analisi delle immagini immunoistochimiche.
Il sistema di analisi delle immagini immunoistochimiche utilizzato è una piattaforma di analisi delle immagini specializzata per i tessuti patologici, che consente la segmentazione dei tessuti utilizzando l'intelligenza artificiale. Molti studi che utilizzano vari moduli con questo sistema sono stati riportati32,33,34. Il sistema è stato utilizzato per quantificare vari cambiamenti e risultati istopatologici difficili da analizzare utilizzando un software di elaborazione delle immagini convenzionale. Ad esempio, il numero di cellule CD56+NK rappresenta circa il 5% del totale delle cellule dell'endometrio durante la fase luteale media. L'analisi immunoistochimica tradizionale è difficile calcolare con precisione il numero di cellule NK CD56+ e potrebbero essere necessari almeno 30 minuti per calcolare il numero totale di cellule positive sull'intera sezione, ma ci vogliono 2-3 minuti con il sistema utilizzato qui. Pertanto, utilizzando il sistema di analisi delle immagini immunoistochimiche utilizzato qui, le cellule immunitarie endometriali potrebbero essere analizzate facilmente e accuratamente. La quantificazione dei risultati patologici mediante l'analisi delle immagini può contribuire a migliorare l'obiettività, la precisione e la persuasività della valutazione dell'ambiente immunitario endometriale.
Tuttavia, c'è una limitazione del metodo descritto. L'endometrio è costituito da vari immunociti che hanno un'associazione con l'esito della gravidanza. Pertanto, definire solo uno o due marcatori immunitari potrebbe essere insufficiente. Pertanto, sono necessari approcci multiparametrici per valutare in modo completo il profilo immunitario delle cellule.
In sintesi, si può concludere che questo protocollo ha applicato con successo l'analisi delle immagini digitali nelle sezioni endometriali durante la fase luteale media delle pazienti RM per la quantificazione delle cellule immunitarie e l'analisi panoramica è stata condotta nel presente studio per determinare la distribuzione di uNK CD56+ dell'endometrio, Foxp3+Tregs, macrofagi CD68+, macrofagi CD163+ M2, iDC CD1a+ e CD8+Cellule T durante la fase luteale media. Sono necessarie ulteriori prove per sostenere l'associazione tra le cellule immunitarie endometriali con gli esiti della gravidanza delle pazienti con RM e gli studi futuri si concentreranno su questo. Questo è stato il primo studio che ha indagato l'ambiente immunitario endometriale nelle pazienti con RM utilizzando la patologia digitale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori sono grati a tutte le donne che hanno acconsentito e donato campioni per questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
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