Summary
Her blev en digital immunhistokemisk billedanalyseplatform udviklet og valideret til kvantitativt at analysere endometrieimmuncellerne hos patienter med tilbagevendende aborter i implantationsvinduet.
Abstract
For at evaluere endometrieimmunmikromiljøet hos patienter med tilbagevendende abort (RM) blev en digital immunhistokemisk billedanalyseplatform udviklet og valideret til kvantitativt at analysere endometrieimmunceller i midtlutealfasen. Alle endometriumprøver blev indsamlet i den midterste luteale fase af menstruationscyklussen. Paraffinindlejrede endometrievæv blev sektioneret i 4 μm tykke dias, og immunohistokemi (IHC) farvning blev udført til påvisning af endometrieimmunceller, herunder CD56 + uNK-celler, Foxp3 + Tregs, CD163 + M2 makrofager, CD1a + DC'er og CD8 + T-celler. De panoramiske dias blev scannet ved hjælp af en digital diasscanner, og et kommercielt billedanalysesystem blev brugt til kvantitativ analyse. Procentdelen af endometrieimmunceller blev beregnet ved at dividere antallet af immunceller i de samlede endometrieceller. Ved hjælp af det kommercielle billedanalysesystem kunne kvantitativ evaluering af endometrieimmunceller, som er vanskelige eller umulige at analysere med konventionel billedanalyse, let og nøjagtigt analyseres. Denne metode kan anvendes til kvantitativt at karakterisere endometriummikromiljøet, herunder interaktion mellem immunceller og dets heterogenitet for forskellige patienter med reproduktionssvigt. Platformen for kvantitativ evaluering af endometrieimmunceller kan være af vigtig klinisk betydning for diagnosticering og behandling af RM-patienter.
Introduction
Tilbagevendende abort (RM) er tabet af to eller flere på hinanden følgende graviditeter og er en kompleks sygdom, der tiltrækker opmærksomhed fra klinikere i de senere år. Incidensraten for RM hos kvinder i den fødedygtige alder er 1%-5% 1. Resultaterne af tidligere undersøgelser viser, at immunfaktorer er tæt forbundet med patogenesen af RM 2,3,4,5. Opretholdelse af immunhomeostase ved moder-føtal interface er nødvendig for embryoimplantation og udvikling. Endometrieimmune celler udfører flere regulerende roller for at opretholde denne homeostase, såsom at fremme trofoblastinvasion, ombygning af spiralarterier og bidrage til placentaudvikling 6,7,8,9.
Afvigende endometrieimmunceller hos kvinder med RM er tidligere blevet rapporteret. Resultaterne viser en tæt sammenhæng mellem den høje tæthed af livmoderens naturlige dræberceller (uNK'er) og forekomsten af RM10,11,12. Et øget antal makrofager er blevet rapporteret i endometrium af kvinder med RM, sammenlignet med dem, der havde en levende fødsel13. Regulatoriske T-celler (Treg) spiller en rolle i moderens immuntolerance over for embryoet, og deres niveau og funktion reduceres i RM-patienters decidua14. Cytotoksicitet T-celler (CTL) og dendritiske celler (DC'er) spiller også en rolle i immunreguleringen af graviditet15,16. Derfor kan en omfattende kvantitativ analyse af lokale endometrieimmunceller i midten af lutealfasen bidrage til bedre at forstå patogenesen af RM. Nogle nuværende metoder til kvantitativ analyse af endometrieimmunceller bruger flowcytometri, som nøjagtigt kan mærke immunceller med flere markører17,18. Imidlertid er klinisk anvendelse af flowcytometri begrænset, fordi den kun kan udføres på frisk væv. Opnåelse af frisk væv er kun muligt, når et stort volumen overskydende tumor er tilgængelig, en sjælden forekomst for endometrium. Immunohistokemi kan observere vævsmorfologi godt in situ og kan også mærke forskellige immunceller, mens traditionelle immunhistokemiske teknikker ikke kan udføre kvantitativ analyse af immunceller.
Sammenlignet med konventionelle immunhistokemiske eksperimenter har kvantitativ immunohistokemisk analyse af immunceller i endometrium vigtig klinisk betydning. IHC-intensitetsscore rangeres normalt på en firepunktsskala eller stærk og svag i patologisk diagnostik og forskning 19,20,21. Denne semikvantitative teknik er imidlertid subjektiv, meget unøjagtig og viser betydelig variation inden for observatøren og mellem observatørerne22. En mulig løsning er anvendelsen af maskinlæring, som er værdifuld idigital billedanalyse23,24. Ved at tilvejebringe kvantitative målinger muliggør denne tilgang en mere præcis vurdering af immuncelleinfiltration, distribution og densitet i livmodervævet. Disse kvantitative oplysninger kan bidrage til at belyse de dynamiske ændringer i immuncellepopulationer under menstruationscyklussen og under forskellige patologiske tilstande. Samlet set giver evnen til kvantitativt at analysere immunceller i endometrium gennem immunhistokemi værdifuld indsigt i livmoderens immunmikromiljø.
Derfor havde protokollen til formål at udvikle og validere en digital immunhistokemisk billedanalyseplatform til kvantitativt at analysere endometrieimmunceller, herunder uNK-celler, Tregs, makrofager, DC'er og cytotoksiske T-celler i midtlutealfasen hos RM-patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningsindholdet og protokollen er blevet etisk gennemgået og godkendt af den forskningsetiske komité på Shenzhen Zhongshan Urology Hospital. Alle kvinder (20-40 år), der var involveret i undersøgelsen, gav informeret samtykke til prøveindsamling og brug.
1. Erhvervelse af patologisk væv
- Forbered værktøjerne til vævshøstning, nemlig måling af lineal, pincet, indlejringskassette, indlejringspapir og vævskurv.
- Overhold om mængden af endometrievæv (større end en mungbønne), opsamlet ved hjælp af en standardtilgang med et pipellekateter, er tilstrækkelig.
- Overfør endometrievævet fra formalin til indlejringspapiret med pincet, og mål endometrievævets dimensioner med en lineal.
- Pakk endometrievævet med indlejringspapir og læg det i en indlejringskassette.
- Placer indlejringskassetten i vævskurven for dehydrering.
2. Dehydrering af væv
- Sæt vævskurven i dehydratorens reaktionskammer (se materialetabel) og start proceduren for rutinemæssig vævsdehydrering: formalin i 100 min; formalin i 100 minutter; 75% alkohol i 60 minutter; 85% alkohol i 60 min; 95% alkohol i 60 min; 100% alkohol i 60 minutter; 100% alkohol i 60 minutter; 100% alkohol i 60 minutter; xylen i 35 minutter; xylen i 20 minutter; xylen i 20 minutter; voks i 80 min; voks i 80 min; voks i 80 min. Processen tager cirka 15 timer.
- Ved afslutningen af vævsdehydreringsproceduren skal du åbne dehydratorens reaktionskammer, fjerne vævskurven.
3. Indlejring af væv
- Tag en passende indlejringsform ud i henhold til prøvens størrelse, og fyld med paraffinvoks ved 70 ° C.
- Placer hurtigt vævet i formen og juster forsigtigt, så vævet er placeret i midten af formen.
- Flyt formen glat til kølepladen, og tryk forsigtigt på vævet, mens paraffinen i bunden sætter sig.
- Sæt indlejringskassette oven på formen og fyld op med mere voks.
- Placer formen på kølepladen, og når paraffinen er helt størknet, skal du fjerne blokken med dens vedhæftede kassette væk fra formen.
4. Vævssektioner
- Indsæt blokken på prøveklemmen på mikrotomet, placer bladet i holderen, juster vinklen mellem blokplanet og bladet, juster sektionens tykkelse til 4 μm, drej håndhjulet, og start udskæringen.
- Udsæt den passende vævsoverflade ved at skære et par tynde sektioner fra blokken. Tag de kontinuerlige og komplette sektioner ud med børsten.
- Når der er skåret nok sektioner, skal du stoppe med at dreje håndhjulet, fjerne de ukvalificerede sektioner i forenden med pincet og flyde sektionerne på overfladen af 42 °C vand i vandbadet med pincet og børste.
- Når sektionerne er helt fladt ud, skal du vælge sektionerne på anti-løsrivelsesdias og overføre til en diasvarmere ved 65 ° C for at bage i 60 min.
- Når bagningen er færdig, skal du tage glasrutsjebanerne ud fra diasvarmeren.
5. Immunohistokemisk farvning
- Fortynd det primære antistof til en arbejdsløsning med antistoffortyndingsmiddel. Se tabel 1 for yderligere oplysninger.
- Læg den fortyndede antistofopløsning i en speciel reagensflaske og detektionssættet i reagensrummet på et automatisk IHC-farvningsinstrument (se materialetabel).
- Placer diasene på en diasholder, dækket af en speciel dækflise, og indsæt dem i instrumentets eksperimentelle reaktionsrum.
- Når instrumentet automatisk genkender reagenset og eksperimentelle oplysninger på diaset, skal du klikke på knappen Start for at starte den immunhistokemiske farvning. Eksperimentet varer i ca. 3 timer.
6. Dehydrering og forsegling af diaset
- Efter immunohistokemisk farvning skal du tage diasholderen ud, tage den specielle dækflise af, sætte det farvede dias i diasholderen og vaske det resterende farvestof på diaset af med rent vand.
- Overfør glideholderen til en automatisk dæksel (se materialetabellen), vælg og kør dehydrerings- og forseglingsproceduren.
- Tag diasene ud efter dehydrering og forsegling.
7. Scanning dias
- Sæt diasene på diasstativet på den panoramiske patologiske billedscanner (se materialetabel), og placer det i instrumentdiasscanningsrummet til panoramisk patologisk billedscanning. Scanningen tager 2 min. Se figur 1.
8. Analyse af billeder
- Importer billede
- Åbn den patologiske billedanalysesoftware (se materialetabel) og opret en ny mappe. Importer immunhistokemiske billeder, der skal analyseres.
- Byg en vævsklassifikator
- Marker flere væv og blank annotation for at træne og etablere en klassifikator til identifikation af henholdsvis vævet og det tomme område.
- Brug realtidsindstilling til at observere softwarens genkendelseskapacitet i realtid under markeringsannotering. Hvis genkendelsen ikke er rettidig, skal du bemærke annotationen og træne igen, indtil vævsgenkendelsen er nøjagtig.
- Byg analysealgoritme
- Vælg standardalgoritmen i softwaren i henhold til typen af eksperiment: multiplex IHC.
- Indstil farveparametrene for cellegenkendelse ved at vælge typisk negativ og positiv pixel.
På dette grundlag skal du indstille parametrene for kerne, cytoplasma og cellemembran og observere cellegenkendelsessituationen i realtid, indtil de mest egnede parametre til billedet er fundet. - Indstil tærsklen for positiv cellegenkendelse, og observer genkendelsessituationen i realtid, indtil den relevante tærskel justeres.
- Vælg vævsklassifikatoren i algoritmen, og kontroller vævsdelen i vævsklassifikatoren for at identificere celler på basis af væv. På dette tidspunkt er etableringen af en analysealgoritme afsluttet.
- Kør billedanalyse
- Vælg analyseområdet. Brug den etablerede algoritme til at analysere billeder.
- Når softwareanalysen er færdig med analysen, skal du manuelt kontrollere, om billedgenkendelsen er nøjagtig, herunder vævsgenkendelse, negativ og positiv cellegenkendelse.
- Hvis billedgenkendelsen ikke er nøjagtig, skal du justere algoritmen og parametertærsklen igen og køre billedanalysen igen, indtil den lykkes. Eksporter resultaterne af analysen. Se figur 1.
- Andre immunceller kan også analyseres i henhold til ovenstående trin (se figur 1). Indstil forskellige analyseparametre i henhold til den faktiske ekspression af forskellige endometrieimmunmarkører (CD56 + uNK-celler, Foxp3 + Tregs, CD68 + makrofager, CD163 + M2 makrofager, CD1a + DC'er og CD8 + T-celler25,26).
- Gennem beregningen af softwaren opnås andelen af endometrieimmunceller (se tabel 2). Brug dette til at evaluere niveauerne af forskellige immunceller i endometrium hos patienter med tilbagevendende abort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at evaluere endometrieimmunceller kvantitativt og reducere ustabiliteten forårsaget af menneskeskabte driftsfejl etablerede vi en digital kvantitativ analyseplatform for endometrieimmunceller ved hjælp af automatisk immunhistokemisk detektion og digitalt kvantitativt evalueringssystem. Immunohistokemisk billedanalyseplatform blev etableret til kvantitativt at analysere endometrieimmunceller hos patienter med tilbagevendende abort (RM) i implantationsvinduet. Alle endometriumvæv blev indsamlet i midten af lutealfasen af menstruationscyklussen. Paraffinindlejrede endometrievæv blev sektioneret i 4 μm tykke dias, og IHC-farvning blev udført til påvisning af endometrieimmunceller, herunder CD56 + uNK-celler, Foxp3 + Tregs, CD163 + M2 makrofager, CD1a + DC'er og CD8 + T-celler. De panoramiske dias blev scannet ved hjælp af den digitale diasscanner, og kvantitativ analyse blev udført ved hjælp af et digitalt billedanalysesystem. Til beregning af procentdelen af endometrieimmunceller divideres antallet af immunceller med det samlede antal endometrieceller. (Figur 1 og figur 2). Andelen af forskellige endometrieimmunceller hos kvinder med RM (N=30) er vist i tabel 2.
Figur 1: Skematisk arbejdsgang til analyse af mid-luteal endometrieimmunceller. Indsamling af prøver blev udført i den midterste luteale fase af menstruationscyklussen 7-9 dage efter luteiniserende hormon (LH) stigning. Fastgørelse blev udført i 10% neutral bufret formalin i 4-6 timer ved stuetemperatur og derefter indlejret i paraffinvoks. IHC-farvning blev udført til påvisning af immunceller i endometrium i midtlutealfasen, herunder CD56 + uNK-celler, Foxp3 + Tregs, CD68 + makrofager, CD163 + M2 makrofager, CD1a + DC'er og CD8 + T-celler25,26. Væv blev scannet ved hjælp af en kommerciel scanner, og kvantitativ analyse blev udført ved hjælp af det immunhistokemiske billedanalysesystem. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Immunfarvning af endometrieceller til identifikation af positive immunceller. Immunfarvning af CD56+uNK-celler, Foxp3+Tregs, CD68+ makrofager, CD163+M2 makrofager, CD1a+DC'er og CD8+T-celler i endometrium fra RM-patienter. Brun repræsenterer positive immunceller og blå repræsenterer kernen. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Primært antistof | Klon | Fortynding |
| CD56 | 123C3 | 1/800 |
| Foxp3 | 236A/E7 | 1/100 |
| CD163 | 10D6 | 1/1200 |
| CD1a | 10 | 1/200 |
| CD8 | 4B11 | 1/300 |
Tabel 1: Primære antistoffer anvendt under immunohistokemisk farvning. Tabellen viser klonen og fortyndingen af de primære antistoffer.
| Immune markører | Median (%) | Minimum (%) | Maksimum (%) | Gennemsnit (%) | 5. percentil (%) | 95. percentil (%) |
| CD56 | 4.83 | 1.8 | 16.76 | 6.03 | 2.04 | 13.63 |
| Foxp3 | 0.05 | 0.02 | 0.12 | 0.06 | 0.02 | 0.11 |
| CD68 | 0.78 | 0.37 | 3.62 | 0.99 | 0.44 | 2.67 |
| CD163 | 0.84 | 0.35 | 2.38 | 0.93 | 0.38 | 2.13 |
| CD1a | 0.04 | 0.01 | 0.11 | 0.05 | 0.01 | 0.1 |
| CD8 | 1.69 | 0.76 | 4.1 | 1.85 | 0.81 | 3.72 |
Tabel 2: Procentdel af forskellige endometrieimmunceller hos kvinder med RM. Procentdelen af CD56+uNK-celler, Foxp3+Tregs, CD68+ makrofager, CD163+M2 makrofager, CD1a+DC'er og CD8+T-celler hos RM-patienter blev beregnet ved hjælp af immunhistokemisk billedanalyseplatform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol etablerede en digital immunhistokemisk billedanalyseplatform til kvantitativt at analysere endometrieimmunceller hos RM-patienter. Her blev seks endometrieimmunmarkører påvist for at evaluere endometrieimmunmikromiljøet hos RM-patienter.
Et modtageligt endometrium i midten af lutealfasen er nøglen til vellykket implantation og graviditet27,28. Derfor spiller evaluering af procent endometrieimmunceller en vigtig rolle i estimering af endometriemodtagelighed. Endometrieimmuncelleanalyse ved konventionelle patologiske metoder er prædiktiv, så det hjælper ikke med klinisk anvendelse. På nuværende tidspunkt er der ingen standardiseret metode til måling af immuncelleprocent, som udgør en barriere for at forstå disse cellers rolle i graviditeten. Konventionel IHC-analyse er baseret på udvalgte synsfelter og manuel tælling. Præcis vævssegmentering og lokalisering af immunceller kan ikke evalueres med konventionel IHC, fordi manuel analyse er subjektiv, hvilket fører til observatørbias29.
Sammenlignet med analyse af fordelingen af immunceller i det valgte felt er panoramaanalyse af væv mere præcis til analyse af fordelingen af endometrieimmunceller. Digitale patologiske tilgange, der bruger maskinbaserede læringsalgoritmer, er blevet testet i flere tumorer for at evaluere store vævsområder og komplekse cellefænotyper30,31. I denne undersøgelse blev der indført et kommercielt system til opnåelse af et panoramabillede af endometriumprøver. Procentdelen af endometrieimmunceller blev efterfølgende bestemt ved hjælp af en automatiseret kvantitativ analyse baseret på det immunohistokemiske billedanalysesystem.
Det immunhistokemiske billedanalysesystem, der anvendes her, er en billedanalyseplatform specialiseret til patologisk væv, som muliggør vævssegmentering ved hjælp af kunstig intelligens. Mange undersøgelser ved hjælp af forskellige moduler med dette system er blevet rapporteret32,33,34. Systemet blev brugt til at kvantificere forskellige histopatologiske ændringer og fund, der var vanskelige at analysere ved hjælp af konventionel billedbehandlingssoftware. For eksempel tegner antallet af CD56 + NK-celler sig for ca. 5% af de samlede celler i endometrium i midten af lutealfasen. Traditionel immunhistokemisk analyse er vanskelig at beregne antallet af CD56+ NK-celler nøjagtigt, og det kan tage mindst 30 minutter at beregne det samlede antal positive celler på hele sektionen, men det tager 2-3 minutter med det system, der anvendes her. Derfor kunne endometrieimmunceller let og nøjagtigt analyseres ved hjælp af det immunohistokemiske billedanalysesystem, der anvendes her. Kvantificering af patologiske fund ved billedanalyse kan bidrage til at forbedre objektivitet, præcision og overbevisning af endometrieimmunmiljøevaluering.
Der er dog en begrænsning af den beskrevne metode. Endometrium består af forskellige immunocytter, der har en sammenhæng med graviditetsresultatet. Derfor kan det være utilstrækkeligt kun at definere en eller to immunmarkører. Derfor er multiparametriske tilgange nødvendige for omfattende vurdering af immunprofilering af celler.
Sammenfattende kan det konkluderes, at denne protokol med succes har anvendt digital billedanalyse i endometriesektioner i midten af lutealfasen af RM-patienter til kvantificering af immunceller, og panoramaanalyse blev udført i denne undersøgelse for at bestemme fordelingen af endometrie CD56 + uNK'er, Foxp3 + Tregs, CD68 + makrofager, CD163 + M2 makrofager, CD1a + iDC'er og CD8 +T-celler i midten af lutealfasen. Der kræves flere beviser for at understøtte sammenhængen mellem endometrieimmunceller med graviditetsresultater hos patienter med RM, og fremtidige undersøgelser vil fokusere på dette. Dette var den første undersøgelse, der undersøgte endometrieimmunmiljøet hos RM-patienter ved hjælp af digital patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for alle kvinder, der samtykkede og donerede prøver til denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
References
- Practice Committee of the American Society for Reproductive. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).
- Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J.
- Kavvadas, D., et al. Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss. 12 (2), 177-193 (2022).
- Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).
- Du, M., et al. Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss. Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).
- Faas, M. M., de Vos, P. Uterine NK cells and macrophages in pregnancy. Placenta. 56, 44-52 (2017).
- Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).
- Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106 (2017).
- Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy. American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).
- Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study. Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).
- Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).
- Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF. Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).
- Laird, S. M., et al. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).
- Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review. Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).
- Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. The endometrial immune environment of women with endometriosis. Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).
- Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface. Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).
- Hey-Cunningham, A. J., et al. Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis. Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).
- Zhong, Q., et al. Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages. Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).
- Attems, J., et al. Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study. Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).
- Kovacs, G. G., et al. Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG). Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).
- Modis, L. V., et al. Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology. Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2. Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).
- Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).
- Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion. Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).
- Diao, L., et al. New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI. Placenta. 99, 180-188 (2020).
- Hewitt, S. C., Korach, K. S. Cell biology. A hand to support the implantation window. Science. 331 (6019), 863-864 (2011).
- Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).
- Algars, A., et al. Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients. International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
- Ascierto, M. L., et al. Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy. Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).
- O'Rourke, D. M., et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).
- Canesin, G., et al. Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).
