Summary
Her ble en digital immunohistokjemi bildeanalyseplattform utviklet og validert for å kvantitativt analysere endometrieimmunceller hos pasienter med tilbakevendende spontanaborter i implantasjonsvinduet.
Abstract
For å evaluere immunmikromiljøet til pasienter med tilbakevendende abort (RM), ble en digital immunhistokjemi bildeanalyseplattform utviklet og validert for kvantitativt å analysere endometrieimmunceller i midten av lutealfasen. Alle endometriumprøver ble samlet inn i midten av lutealfasen av menstruasjonssyklusen. Parafininnebygd endometrievev ble seksjonert i 4 μm tykke lysbilder, og immunhistokjemi (IHC)farging ble utført for å oppdage endometrieimmunceller, inkludert CD56+ uNK-celler, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2-makrofager, CD1a+ DC-er og CD8+ T-celler. Panoramalysbildene ble skannet ved hjelp av en digital lysbildeskanner og et kommersielt bildeanalysesystem ble brukt til kvantitativ analyse. Prosentandelen av endometrieimmunceller ble beregnet ved å dele antall immunceller i de totale endometriecellene. Ved hjelp av det kommersielle bildeanalysesystemet kan kvantitativ evaluering av endometrieimmunceller, som er vanskelige eller umulige å analysere med konvensjonell bildeanalyse, enkelt og nøyaktig analyseres. Denne metoden kan brukes til å kvantitativt karakterisere endometriummikromiljøet, inkludert interaksjon mellom immunceller, og dets heterogenitet for forskjellige pasienter med reproduktiv svikt. Plattformen for kvantitativ evaluering av endometrieimmunceller kan være av viktig klinisk betydning for diagnostikk og behandling av RM-pasienter.
Introduction
Tilbakevendende abort (RM) er tap av to eller flere påfølgende graviditeter og er en kompleks sykdom som trekker oppmerksomhet fra klinikere de siste årene. Forekomsten av RM hos kvinner i fertil alder er 1% -5% 1. Resultater fra tidligere studier viser at immunfaktorer er nært forbundet med patogenesen av RM 2,3,4,5. Opprettholde immunhomeostase ved mor-føtalgrensesnittet er nødvendig for embryoimplantasjon og utvikling. Endometrial immunceller utfører flere regulatoriske roller for å opprettholde denne homeostasen, for eksempel å fremme trofoblastinvasjon, omforme spiralarterier og bidra til placentautvikling 6,7,8,9.
Avvikende endometrieimmunceller hos kvinner med RM er tidligere rapportert. Resultatene viser en nær sammenheng mellom den høye tettheten av livmor naturlige drepeceller (uNK) og forekomsten av RM10,11,12. Et økt antall makrofager er rapportert i endometrium hos kvinner med RM, sammenlignet med de som hadde en levende fødsel13. Regulatoriske T-celler (Treg) spiller en rolle i mors immuntoleranse mot embryoet, og deres nivå og funksjon reduseres i decidua hos RM-pasienter14. Cytotoksisitet T-celler (CTL) og dendrittiske celler (DC) spiller også en rolle i immunreguleringen av graviditet15,16. Derfor kan en omfattende kvantitativ analyse av lokale endometrieimmunceller i midt-lutealfasen bidra til å bedre forstå patogenesen av RM. Noen nåværende metoder for kvantitativ analyse av endometrieimmunceller bruker flowcytometri som nøyaktig kan merke immunceller med flere markører17,18. Klinisk anvendelse av flowcytometri er imidlertid begrenset fordi den kun kan utføres på ferskt vev. Innhenting av ferskt vev er bare mulig når et stort volum overflødig tumor er tilgjengelig, en sjelden forekomst for endometrium. Immunhistokjemi kan observere vevsmorfologi godt in situ og kan også merke ulike immunceller, mens tradisjonelle immunhistokjemiske teknikker ikke kan utføre kvantitativ analyse av immunceller.
Sammenlignet med konvensjonelle immunhistokjemiske eksperimenter har kvantitativ immunhistokjemisk analyse av immunceller i endometrium viktig klinisk betydning. IHC-intensitetsskåring er vanligvis rangert på en firepunkts skala eller sterk og svak i patologisk diagnostikk og forskning 19,20,21. Imidlertid er denne semi-kvantitative teknikken subjektiv, svært unøyaktig, og demonstrerer betydelig intra-observatør og inter-observatør variabilitet22. En mulig løsning er bruk av maskinlæring, som er verdifull i digital bildeanalyse23,24. Ved å gi kvantitative målinger, muliggjør denne tilnærmingen en mer presis vurdering av immuncelleinfiltrasjon, distribusjon og tetthet i livmorvevet. Denne kvantitative informasjonen kan bidra til å belyse de dynamiske endringene i immuncellepopulasjoner under menstruasjonssyklusen og i ulike patologiske forhold. Samlet sett gir evnen til kvantitativt å analysere immunceller i endometrium gjennom immunhistokjemi verdifull innsikt i livmorens immunmikromiljø.
Derfor hadde protokollen som mål å utvikle og validere en digital immunhistokjemi bildeanalyseplattform for kvantitativt å analysere endometrieimmunceller, inkludert uNK-celler, Tregs, makrofager, DCs og cytotoksiske T-celler i midtlutealfasen hos RM-pasienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningsinnholdet og protokollen er etisk gjennomgått og godkjent av forskningsetisk komité ved Shenzhen Zhongshan urologisykehus. Alle kvinner (20-40 år) som var involvert i studien, ga informert samtykke til prøveinnsamling og bruk.
1. Oppkjøp av patologisk vev
- Forbered verktøyene for vevshøsting, nemlig målelinjal, pinsett, innebyggingskassett, embeddingpapir og vevkurv.
- Vær oppmerksom på om mengden endometrievev (større enn en mungbønne), samlet ved hjelp av en standard tilnærming med et pipellekateter, er tilstrekkelig.
- Overfør endometrievevet fra formalin til innebyggingspapiret med pinsett og mål endometrievevets dimensjoner med en linjal.
- Pakk endometrievevet med embedding papir og legg i en embedding kassett.
- Plasser innebyggingskassetten i vevskurven for dehydrering.
2. Dehydrering av vev
- Sett vevskurven inn i reaksjonskammeret til dehydratoren (se materialtabellen) og start prosedyren for rutinemessig dehydrering av vev: formalin i 100 minutter; formalin i 100 min; 75% alkohol i 60 minutter; 85% alkohol i 60 min; 95% alkohol i 60 min; 100% alkohol i 60 min; 100% alkohol i 60 min; 100% alkohol i 60 min; xylen i 35 minutter; xylen i 20 minutter; xylen i 20 minutter; voks i 80 min; voks i 80 min; voks i 80 min. Prosessen tar ca 15 timer.
- På slutten av vevsdehydreringsprosedyren, åpne reaksjonskammeret til dehydratoren, fjern vevskurven.
3. Vev embedding
- Ta ut en passende støpeform i henhold til prøvens størrelse, og fyll med parafinvoks ved 70 ° C.
- Plasser vevet raskt i formen og juster forsiktig slik at vevet ligger i midten av formen.
- Flytt formen jevnt til kjøleplaten og trykk forsiktig på vevet mens parafinen i bunnen stivner.
- Legg embedding kassett på toppen av formen og fyll opp med mer voks.
- Plasser formen på kjøleplaten, og når parafinen er helt størknet, fjern blokken med den vedlagte kassetten vekk fra formen.
4. Vev seksjoner
- Sett inn blokken på prøveklippet til mikrotomen, plasser bladet i holderen, juster vinkelen mellom blokkplanet og bladet, juster tykkelsen på seksjonen til 4 μm, vri håndhjulet og start skiven.
- Utsett riktig vevsoverflate ved å kutte noen tynne seksjoner fra blokken. Ta de kontinuerlige og komplette delene ut med børsten.
- Når nok seksjoner er kuttet, må du slutte å vri på håndhjulet, fjerne de ukvalifiserte seksjonene i frontenden med pinsett, og flyte seksjonene på overflaten av 42 °C vann i vannbadet med pinsett og børste.
- Etter at seksjonene er helt flate ut, plukk seksjonene på anti-detachment lysbilder og overfør til en lysbildevarmer ved 65 ° C for å bake i 60 minutter.
- Når stekingen er ferdig, tar du glassglidene ut fra lysbildevarmeren.
5. Immunhistokjemisk farging
- Fortynn det primære antistoffet til en fungerende løsning med antistofffortynningsmiddel. Se tabell 1 for detaljer.
- Sett den fortynnede antistoffoppløsningen i en spesiell reagensflaske og deteksjonssettet i reagensrommet til et automatisk IHC-fargeinstrument (se materialtabellen).
- Plasser lysbildene på en glideholder, dekket med et spesielt deksel, og sett dem inn i instrumentets eksperimentelle reaksjonsrom.
- Etter at instrumentet automatisk gjenkjenner reagenset og eksperimentell informasjon på lysbildet, klikker du Start-knappen for å starte den immunhistokjemiske fargingen. Forsøket varer i ca 3 timer.
6. Dehydrering og tetting av lysbildet
- Etter immunhistokjemisk farging, ta ut glideholderen, ta av det spesielle dekselet, sett det fargede lysbildet inn i glideholderen og vask av det gjenværende fargestoffet på lysbildet med rent vann.
- Overfør glideholderen til en automatisk dekseltøffel (se materialfortegnelse), velg og kjør dehydrerings- og forseglingsprosedyren.
- Ta ut lysbildene etter dehydrering og tetting.
7. Skanne lysbilde
- Sett lysbildene på lysbildestativet til den panoramiske patologiske bildeskanneren (se materialfortegnelse) og plasser den i instrumentlysbildeskanningsrommet for panoramautsikt patologisk bildeskanning. Skanningen tar 2 min. Se figur 1.
8. Analyse av bilder
- Importere bilde
- Åpne det patologiske bildeanalyseprogrammet (se Materialfortegnelse) og opprett en ny mappe. Importer immunhistokjemiske bilder som skal analyseres.
- Bygg en vevsklassifiserer
- Merk flere vev og blank merknad for å trene og etablere en klassifiserer for å identifisere henholdsvis vev og tomt område.
- Bruk justering i sanntid for å observere gjenkjenningskapasiteten til programvaren i sanntid under merkemerknad. Hvis anerkjennelsen ikke er rettidig, bemerk merknad og tren igjen til vevsgjenkjenningen er nøyaktig.
- Bygg analysealgoritme
- Velg standardalgoritmen i programvaren i henhold til type eksperiment: multiplex IHC.
- Angi fargeparametrene for cellegjenkjenning ved å velge typisk negativ og positiv piksel.
På dette grunnlaget, angi parametrene for kjerne, cytoplasma og cellemembran, og observer cellegjenkjenningssituasjonen i sanntid til de mest passende parametrene for bildet er funnet. - Angi terskelen for positiv cellegjenkjenning og observer gjenkjenningssituasjonen i sanntid til riktig terskel er justert.
- Velg vevsklassifisereren i algoritmen, og kontroller vevsdelen i vevsklassifisereren for å identifisere celler på grunnlag av vev. På dette tidspunktet er etableringen av en analysealgoritme fullført.
- Kjør bildeanalyse
- Velg analyseområdet. Bruk den etablerte algoritmen til å analysere bilder.
- Etter at programvareanalysen er ferdig med å analysere, må du manuelt kontrollere om bildegjenkjenningen er nøyaktig, inkludert vevsgjenkjenning, negativ og positiv cellegjenkjenning.
- Hvis bildegjenkjenningen ikke er nøyaktig, justerer du algoritmen og parameterterskelen på nytt og kjører bildeanalysen på nytt til den er fullført. Eksporter resultatene av analysen. Se figur 1.
- Andre immunceller kan også analyseres i henhold til trinnene ovenfor (se figur 1). Sett forskjellige analyseparametere i henhold til det faktiske uttrykket av forskjellige endometrieimmunmarkører (CD56+uNK-celler, Foxp3+Tregs, CD68+-makrofager, CD163+M2-makrofager, CD1a+DC og CD8+T-celler25,26).
- Ved beregning av programvaren får du andelen endometrieimmunceller (se tabell 2). Bruk dette til å evaluere nivåene av ulike immunceller i endometrium hos pasienter med tilbakevendende abort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å evaluere endometrieimmunceller kvantitativt og redusere ustabiliteten forårsaket av menneskeskapte operasjonsfeil, etablerte vi en digital kvantitativ analyseplattform for endometrieimmunceller ved hjelp av automatisk immunhistokjemisk deteksjon og digitalt kvantitativt evalueringssystem. Immunohistochemistry bildeanalyseplattform ble etablert for å kvantitativt analysere endometrieimmunceller hos pasienter med tilbakevendende abort (RM) i implantasjonsvinduet. Alle endometriumvev ble samlet i midten av lutealfasen i menstruasjonssyklusen. Parafininnebygd endometrievev ble seksjonert i 4 μm tykke lysbilder, og IHC-farging ble utført for å oppdage endometrieimmunceller, inkludert CD56 + uNK-celler, Foxp3 + Tregs, CD163 + M2 makrofager, CD1a + DC og CD8 + T-celler. Panoramalysbildene ble skannet ved hjelp av den digitale lysbildeskanneren, og kvantitativ analyse ble utført ved hjelp av et digitalt bildeanalysesystem. For beregning av prosentandelen endometrieimmunceller, divider antall immunceller med totalt antall endometrieceller. (figur 1 og figur 2). Andelen ulike immunceller i endometriet hos kvinner med RM (N=30) er vist i tabell 2.
Figur 1 Skjematisk arbeidsflyt for analyse av endometrieimmune celler i mid-luteal. Innsamling av prøver ble gjort i midten av lutealfasen av menstruasjonssyklusen, 7-9 dager etter theluteiniserende hormon (LH) bølge. Fiksering ble gjort i 10% nøytral bufret formalin i 4-6 timer ved romtemperatur, og deretter innebygd i parafinvoks. IHC-farging ble utført for påvisning av immunceller i endometrium i midtlutealfasen, inkludert CD56+uNK-celler, Foxp3+Tregs, CD68+-makrofager, CD163+M2-makrofager, CD1a+DC-er og CD8+T-celler25,26. Vev ble skannet ved hjelp av en kommersiell skanner og kvantitativ analyse ble utført ved hjelp av immunohistokjemi bildeanalysesystem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Immunfarging av endometrieceller for identifisering av positive immunceller. Immunfarging av CD56+uNK-celler, Foxp3+Tregs, CD68+ makrofager, CD163+M2-makrofager, CD1a+DC og CD8+T-celler i endometrium fra RM-pasienter. Brun representerer positive immunceller og blå representerer kjernen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Primær antistoff | Klon | Fortynning |
| CD56 | 123C3 | 1/800 |
| Foxp3 | 236A/E7 | 1/100 |
| CD163 | 10D6 | 1/1200 |
| CD1a | 10 | 1/200 |
| CD8 | 4B11 | 1/300 |
Tabell 1 Primære antistoffer brukt ved immunhistokjemisk farging. Tabellen viser klonen og fortynningen av de primære antistoffene.
| Markører for immunforsvar | Median (%) | Minimum (%) | Maksimum (%) | Gjennomsnitt (%) | 5. persentil (%) | 95-prosentilen (%) |
| CD56 | 4.83 | 1.8 | 16.76 | 6.03 | 2.04 | 13.63 |
| Foxp3 | 0.05 | 0.02 | 0.12 | 0.06 | 0.02 | 0.11 |
| CD68 | 0.78 | 0.37 | 3.62 | 0.99 | 0.44 | 2.67 |
| CD163 | 0.84 | 0.35 | 2.38 | 0.93 | 0.38 | 2.13 |
| CD1a | 0.04 | 0.01 | 0.11 | 0.05 | 0.01 | 0.1 |
| CD8 | 1.69 | 0.76 | 4.1 | 1.85 | 0.81 | 3.72 |
Tabell 2: Prosentandel av ulike endometrieimmunceller hos kvinner med RM. Prosentandelen av CD56+uNK-celler, Foxp3+Tregs, CD68+-makrofager, CD163+M2-makrofager, CD1a+DC-er og CD8+T-celler hos RM-pasienter ble beregnet ved hjelp av immunhistokjemi bildeanalyseplattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen etablerte en digital immunhistokjemi bildeanalyseplattform for kvantitativt å analysere endometrieimmunceller hos RM-pasienter. Her ble seks endometrieimmunmarkører detektert for å evaluere endometrieimmunmikromiljøet hos RM-pasienter.
Et mottakelig endometrium i midten av lutealfasen er nøkkelen til vellykket implantasjon og graviditet27,28. Derfor spiller evaluering av prosentvise endometrieimmunceller en viktig rolle i estimering av endometriell reseptivitet. Endometrial immunceller analyse, ved konvensjonelle patologiske metoder, er prediktiv slik at det ikke hjelper i klinisk anvendelse. For tiden er det ingen standardisert metode for måling av immuncelleprosent som utgjør en barriere for å forstå disse cellens rolle i svangerskapet. Konvensjonell IHC-analyse er basert på utvalgte visuelle felt og manuell telling. Presis vevssegmentering og lokalisering av immunceller kan ikke evalueres med konvensjonell IHC fordi manuell analyse er subjektiv, noe som fører til observatørskjevhet29.
Sammenlignet med analyse av fordelingen av immunceller i det valgte feltet, er panoramaanalyse av vev mer nøyaktig for å analysere fordelingen av endometrielle immunceller. Digitale patologiske tilnærminger som bruker maskinbaserte læringsalgoritmer har blitt testet i flere svulster for å evaluere store vevsområder og komplekse cellefenotyper30,31. I denne studien ble det innført et kommersielt system for å oppnå et panoramabilde av endometriumprøver. Prosentandelen av endometrieimmunceller ble deretter bestemt ved hjelp av en automatisert kvantitativ analyse basert på det immunhistokjemiske bildeanalysesystemet.
Det immunhistokjemiske bildeanalysesystemet som brukes her er en bildeanalyseplattform spesialisert for patologisk vev, som muliggjør vevsegmentering ved hjelp av kunstig intelligens. Mange studier som bruker ulike moduler med dette systemet har blitt rapportert32,33,34. Systemet ble brukt til å kvantifisere ulike histopatologiske endringer og funn som var vanskelige å analysere ved hjelp av konvensjonell bildebehandlingsprogramvare. For eksempel utgjør antallet CD56 + NK-celler ca. 5% av de totale cellene i endometrium i midtlutealfasen. Tradisjonell immunhistokjemisk analyse er vanskelig å beregne nøyaktig antall CD56+ NK-celler, og det kan ta minst 30 min å beregne totalt antall positive celler på hele seksjonen, men det tar 2-3 min med systemet som brukes her. Derfor, ved hjelp av immunhistokjemi bildeanalysesystemet som brukes her, kan endometrieimmunceller enkelt og nøyaktig analyseres. Kvantifisering av patologiske funn ved bildeanalyse kan bidra til å forbedre objektivitet, presisjon og overtalelsesevne av endometrial immunmiljøevaluering.
Det er imidlertid en begrensning av den beskrevne metoden. Endometrium består av forskjellige immuncytter som har en sammenheng med graviditetsutfall. Derfor kan det være utilstrekkelig å definere bare en eller to immunmarkører. Derfor er det nødvendig med multiparametriske tilnærminger for å vurdere immunprofilering av celler grundig.
Oppsummert kan det konkluderes med at denne protokollen har brukt digital bildeanalyse i endometrieseksjoner i midten av lutealfasen av RM-pasienter for kvantifisering av immunceller, og panoramaanalyse ble utført i denne studien for å bestemme fordelingen av endometrial CD56+ uNKs, Foxp3+Tregs, CD68+ makrofager, CD163+ M2-makrofager, CD1a+ iDCs og CD8+T-celler i midten av lutealfasen. Mer bevis er nødvendig for å støtte sammenhengen mellom endometrieimmunceller med graviditetsutfall hos pasienter med RM, og fremtidige studier vil fokusere på dette. Dette var den første studien som undersøkte endometrieimmunmiljøet hos RM-pasienter ved hjelp av digital patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for alle kvinner som samtykket og donerte prøver til denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
References
- Practice Committee of the American Society for Reproductive. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).
- Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J.
- Kavvadas, D., et al. Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss. 12 (2), 177-193 (2022).
- Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).
- Du, M., et al. Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss. Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).
- Faas, M. M., de Vos, P. Uterine NK cells and macrophages in pregnancy. Placenta. 56, 44-52 (2017).
- Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).
- Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106 (2017).
- Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy. American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).
- Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study. Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).
- Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).
- Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF. Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).
- Laird, S. M., et al. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).
- Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review. Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).
- Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. The endometrial immune environment of women with endometriosis. Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).
- Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface. Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).
- Hey-Cunningham, A. J., et al. Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis. Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).
- Zhong, Q., et al. Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages. Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).
- Attems, J., et al. Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study. Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).
- Kovacs, G. G., et al. Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG). Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).
- Modis, L. V., et al. Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology. Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2. Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).
- Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).
- Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion. Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).
- Diao, L., et al. New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI. Placenta. 99, 180-188 (2020).
- Hewitt, S. C., Korach, K. S. Cell biology. A hand to support the implantation window. Science. 331 (6019), 863-864 (2011).
- Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).
- Algars, A., et al. Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients. International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
- Ascierto, M. L., et al. Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy. Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).
- O'Rourke, D. M., et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).
- Canesin, G., et al. Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).
