Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

פלטפורמה לזיהוי כמותי של תאי מערכת החיסון ברירית הרחם על בסיס אימונוהיסטוכימיה וניתוח תמונה דיגיטלית

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65643
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Shenzhen Key Laboratory of Reproductive Immunology for Peri-implantation, Shenzhen Zhongshan Institute for Reproduction and Genetics, Fertility Center, Shenzhen Zhongshan Urology Hospital, 2Shenzhen Jinxin Medical Technology Innovation Center, Co., Ltd.

Summary

כאן, פותחה ואומתה פלטפורמת ניתוח תמונה אימונוהיסטוכימית דיגיטלית לניתוח כמותי של תאי החיסון של רירית הרחם של חולים עם הפלות חוזרות בחלון ההשתלה.

Abstract

כדי להעריך את המיקרו-סביבה החיסונית של רירית הרחם של חולים עם הפלות חוזרות (RM), פותחה ואומתה פלטפורמת ניתוח תמונה דיגיטלית של אימונוהיסטוכימיה כדי לנתח כמותית תאים חיסוניים של רירית הרחם במהלך השלב האמצעי-לוטאלי. כל דגימות רירית הרחם נאספו במהלך השלב האמצעי-לוטאלי של המחזור החודשי. רקמות רירית הרחם המשובצות בפרפין חולקו לשקופיות בעובי 4 מיקרומטר, וצביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) בוצעה לאיתור תאים חיסוניים של רירית הרחם, כולל תאי CD56+ uNK, Foxp3+ Tregs, מקרופאגים CD163+ M2, DCs CD1a+ ותאי T CD8+. השקופיות הפנורמיות נסרקו באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי ומערכת ניתוח תמונות מסחרית שימשה לניתוח כמותי. אחוז תאי מערכת החיסון של רירית הרחם חושב על ידי חלוקת מספר תאי החיסון בסך תאי רירית הרחם. באמצעות מערכת ניתוח התמונה המסחרית, הערכה כמותית של תאי מערכת החיסון של רירית הרחם, שקשה או בלתי אפשרי לנתח באמצעות ניתוח תמונה קונבנציונלי, יכולה להיות מנותחת בקלות ובמדויק. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת כדי לאפיין כמותית את המיקרו-סביבה של רירית הרחם, כולל אינטראקציה בין תאים חיסוניים, ואת ההטרוגניות שלה עבור חולים שונים באי ספיקת רבייה. הפלטפורמה להערכה כמותית של תאי מערכת החיסון של רירית הרחם עשויה להיות בעלת משמעות קלינית חשובה לאבחון וטיפול בחולי RM.

Introduction

הפלה חוזרת (RM) היא אובדן של שני הריונות רצופים או יותר והיא מחלה מורכבת המושכת תשומת לב מצד רופאים בשנים האחרונות. שיעור ההיארעות של RM בנשים בגיל הפוריות הוא 1%-5% 1. תוצאות מחקרים קודמים מראות כי גורמים חיסוניים קשורים קשר הדוק עם הפתוגנזה של RM 2,3,4,5. שמירה על הומאוסטזיס חיסוני בממשק האם-עובר נדרשת להשתלת עובר והתפתחותו. תאי חיסון רירית הרחם מבצעים מספר תפקידי ויסות לשמירה על הומאוסטזיס זה, כגון קידום פלישת טרופובלסט, עיצוב מחדש של עורקים ספירליים ותרומה להתפתחות שליה 6,7,8,9.

תאי חיסון חריגים של רירית הרחם אצל נשים עם RM דווחו בעבר. התוצאות מראות קשר הדוק בין הצפיפות הגבוהה של תאי הרג טבעי ברחם (uNKs) לבין המופע של RM10,11,12. מספר מוגבר של מקרופאגים דווח ברירית הרחם של נשים עם RM, בהשוואה לאלו שעברו לידת חי13. תאי T רגולטוריים (Treg) ממלאים תפקיד בסבילות החיסונית האימהית כלפי העובר, ורמתם ותפקודם יורדים בהחלטה של חולי RM14. תאי T ציטוטוקסיים (CTL) ותאים דנדריטיים (DCs) גם לשחק תפקיד בוויסות החיסון של הריון15,16. לכן, ניתוח כמותי מקיף של תאי חיסון רירית הרחם המקומי במהלך השלב האמצעי-לוטאלי יכול לעזור להבין טוב יותר את הפתוגנזה של RM. חלק מהשיטות הנוכחיות לניתוח כמותי של תאי מערכת החיסון של רירית הרחם משתמשות בציטומטריית זרימה שיכולה לתייג במדויק תאי חיסון עם סמנים מרובים17,18. עם זאת, היישום הקליני של ציטומטריית זרימה מוגבל מכיוון שניתן לבצע אותו רק על רקמות טריות. השגת רקמה טרייה אפשרית רק כאשר כמות גדולה של גידול עודף זמין, תופעה נדירה עבור אנדומטריום. אימונוהיסטוכימיה יכולה לצפות במורפולוגיה של רקמות היטב באתרה ויכולה גם לתייג תאים חיסוניים שונים, בעוד שטכניקות אימונוהיסטוכימיות מסורתיות אינן יכולות לבצע ניתוח כמותי של תאי מערכת החיסון.

בהשוואה לניסויים אימונוהיסטוכימיים קונבנציונליים, לניתוח אימונוהיסטוכימי כמותי של תאי מערכת החיסון ברירית הרחם יש משמעות קלינית חשובה. ניקוד עוצמת IHC מדורג בדרך כלל בסולם של ארבע נקודות או חזק וחלש באבחון פתולוגי ומחקר 19,20,21. עם זאת, טכניקה כמותית למחצה זו היא סובייקטיבית, מאוד לא מדויקת, ומדגימה שונות משמעותית בין צופה ובין צופה22. פתרון אפשרי אחד הוא יישום של למידת מכונה, שהיא בעלת ערך בניתוח תמונה דיגיטלית23,24. על ידי מתן מדידות כמותיות, גישה זו מאפשרת הערכה מדויקת יותר של חדירה, פיזור וצפיפות של תאי מערכת החיסון בתוך רקמת הרחם. מידע כמותי זה יכול לעזור להבהיר את השינויים הדינמיים באוכלוסיית תאי החיסון במהלך המחזור החודשי ובמצבים פתולוגיים שונים. בסך הכל, היכולת לנתח כמותית תאי מערכת החיסון ברירית הרחם באמצעות אימונוהיסטוכימיה מציעה תובנות חשובות על המיקרו-סביבה החיסונית של הרחם.

לכן, מטרת הפרוטוקול הייתה לפתח ולתקוף פלטפורמת ניתוח תמונה דיגיטלית של אימונוהיסטוכימיה לניתוח כמותי של תאי מערכת החיסון של רירית הרחם, כולל תאי uNK, Tregs, מקרופאגים, DCs ותאי T ציטוטוקסיים במהלך השלב האמצעי-לוטאלי בחולי RM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

תוכן המחקר והפרוטוקול נבדקו באופן אתי ואושרו על ידי ועדת האתיקה של המחקר של בית החולים האורולוגי שנג'ן ז'ונגשאן. כל הנשים (בגילאי 20-40) שהשתתפו במחקר סיפקו הסכמה מדעת לאיסוף הדגימות ולשימושן.

1. רכישת רקמה פתולוגית

  1. הכינו את הכלים לקצירת רקמות, כלומר סרגל מדידה, טוויטר, הטמעת קלטת, נייר הטבעה וסל טישו.
  2. שימו לב האם כמות רקמת רירית הרחם (גדולה יותר משעועית מש), שנאספה בגישה סטנדרטית עם קטטר צינור, מספיקה.
  3. מעבירים את רקמת רירית הרחם מהפורמלין אל נייר ההטבעה בפינצטה ומודדים את מידות רקמת רירית הרחם בעזרת סרגל.
  4. עוטפים את רקמת רירית הרחם בנייר הטבעה ומניחים בקלטת הטבעה.
  5. מניחים את קלטת ההטבעה בסלסלת הטישו להתייבשות.

2. התייבשות רקמות

  1. מכניסים את סל הרקמה לתא התגובה של מייבש הרקמות (ראו טבלת חומרים) ומתחילים בהליך להתייבשות שגרתית ברקמות: פורמלין למשך 100 דקות; פורמלין במשך 100 דקות; 75% אלכוהול במשך 60 דקות; 85% אלכוהול במשך 60 דקות; 95% אלכוהול במשך 60 דקות; 100% אלכוהול במשך 60 דקות; 100% אלכוהול במשך 60 דקות; 100% אלכוהול במשך 60 דקות; קסילן במשך 35 דקות; קסילן במשך 20 דקות; קסילן במשך 20 דקות; שעווה במשך 80 דקות; שעווה במשך 80 דקות; שעווה למשך 80 דקות. התהליך אורך כ-15 שעות.
  2. בסוף הליך התייבשות הרקמות, לפתוח את תא התגובה של המייבש, להסיר את סל הרקמות.

3. הטבעת רקמות

  1. מוציאים תבנית הטבעה מתאימה בהתאם לגודל הדגימה, וממלאים בשעוות פרפין ב 70 מעלות צלזיוס.
  2. מניחים במהירות את הרקמה לתוך התבנית ומתאימים בזהירות כך שהרקמה ממוקמת במרכז התבנית.
  3. מעבירים את התבנית בצורה חלקה לצלחת הקירור ולוחצים בעדינות על הרקמה בזמן שהפרפין בתחתית שוקע.
  4. מניחים קסטת הטבעה על גבי התבנית וממלאים בשעווה נוספת.
  5. מניחים את התבנית על צלחת הקירור, וכאשר הפרפין מוצק לחלוטין, מסירים את הבלוק עם הקלטת המצורפת שלו הרחק מהתבנית.

4. קטעי רקמות

  1. הכנס את הבלוק על תפס הדגימה של המיקרוטום, מקם את הלהב במחזיק, התאם את הזווית בין מישור הבלוק ללהב, התאם את עובי הקטע ל -4 מיקרומטר, סובב את גלגל היד והתחל את החיתוך.
  2. חשוף את משטח הרקמה המתאים על ידי חיתוך כמה חלקים דקים מהבלוק. הוציאו את המקטעים הרציפים והשלמים בעזרת המברשת.
  3. כאשר חותכים מספיק חלקים, הפסיקו לסובב את גלגל היד, הסירו את החלקים הבלתי מוסמכים בקצה הקדמי עם פינצטה, וצפו את החלקים על פני המים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס באמבט המים עם פינצטה ומברשת.
  4. לאחר שיטוח מלא של הנתחים, בוחרים את החלקים במגלשות נגד ניתוק ומעבירים למגלשה חמה יותר ב-65°C לאפייה במשך 60 דקות.
  5. בסיום האפייה, הוציאו את מגלשות הזכוכית מהמגלשה חמה יותר.

5. צביעה אימונוהיסטוכימית

  1. לדלל את הנוגדן הראשוני לתוך פתרון עובד עם נוגדנים מדללים. ראו טבלה 1 לפרטים.
  2. הכניסו את תמיסת הנוגדנים המדוללת לבקבוק מגיב מיוחד ואת ערכת הזיהוי לתא מגיב של מכשיר צביעה IHC אוטומטי (ראו טבלת חומרים).
  3. הניחו את המגלשות על מחזיק שקופיות, מכוסה בכיסוי מיוחד, והכניסו אותן לתא התגובה הניסיונית של המכשיר.
  4. לאחר שהמכשיר מזהה באופן אוטומטי את המידע המגיב והניסויי בשקופית, לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל את הצביעה האימונוהיסטוכימית. הניסוי נמשך כ-3 שעות.

6. התייבשות ואיטום המגלשה

  1. לאחר צביעה אימונוהיסטוכימית, מוציאים את מחזיק המגלשה, מורידים את הכיסוי המיוחד, מכניסים את המגלשה המוכתמת למחזיק המגלשה ושוטפים את הצבע שנותר במגלשה במים נקיים.
  2. העבר את מחזיק השקופיות לנעלי כיסוי אוטומטיות (ראה רשימת חומרים), בחר והפעל את הליך ההתייבשות והאיטום.
  3. הוציאו את המגלשות לאחר התייבשות ואיטום.

7. סריקת שקופית

  1. הניחו את השקופיות על מדף השקופיות של סורק התמונות הפתולוגי הפנורמי (ראו טבלת חומרים) והניחו אותן בתא סריקת שקופיות המכשיר לסריקת תמונות פתולוגיות פנורמיות. הסריקה אורכת 2 דקות. ראו איור 1.

8. ניתוח תמונות

  1. ייבוא תמונה
    1. פתח את התוכנה לניתוח תמונות פתולוגיות (ראה רשימת חומרים) וצור תיקייה חדשה. ייבוא תמונות אימונוהיסטוכימיות לניתוח.
  2. בניית מסווג רקמות
    1. סמן מספר רקמות וביאור ריק כדי לאמן ולהקים מסווג לזיהוי הרקמה והאזור הריק, בהתאמה.
    2. השתמש בכוונון בזמן אמת כדי לבחון את יכולת הזיהוי של התוכנה בזמן אמת במהלך ביאור סימונים. אם הזיהוי אינו בזמן, העירו הערות והתאמנו שוב עד שזיהוי הרקמה יהיה מדויק.
  3. בניית אלגוריתם ניתוח
    1. בחר את האלגוריתם הסטנדרטי בתוכנה בהתאם לסוג הניסוי: מולטיפלקס IHC.
    2. הגדר את פרמטרי הצבע של זיהוי תא על-ידי בחירת פיקסל שלילי וחיובי טיפוסי.
      על בסיס זה, קבעו את הפרמטרים של הגרעין, הציטופלסמה וקרום התא, והתבוננו במצב זיהוי התא בזמן אמת עד למציאת הפרמטרים המתאימים ביותר לתמונה.
    3. הגדר את סף זיהוי התאים החיובי והתבונן במצב הזיהוי בזמן אמת עד להתאמת הסף המתאים.
    4. בחר את מסווג הרקמה באלגוריתם, ובדוק את חלק הרקמה במסווג הרקמות, כדי לזהות תאים על בסיס רקמות. בשלב זה הושלמה הקמת אלגוריתם ניתוח.
  4. הפעלת ניתוח תמונות
    1. בחר את אזור הניתוח. השתמש באלגוריתם שהוקם כדי לנתח תמונות.
  5. לאחר סיום ניתוח התוכנה, בדוק ידנית אם זיהוי התמונה מדויק, כולל זיהוי רקמות, זיהוי תאים שלילי וחיובי.
  6. אם זיהוי התמונה אינו מדויק, התאם שוב את האלגוריתם ואת סף הפרמטרים, והפעל שוב את ניתוח התמונה עד להצלחה. ייצא את תוצאות הניתוח. ראו איור 1.
  7. תאים חיסוניים אחרים יכולים גם להיות מנותחים על פי השלבים לעיל (ראו איור 1). הגדר פרמטרי ניתוח שונים בהתאם לביטוי בפועל של סמנים חיסוניים שונים של רירית הרחם (CD56 + תאי uNK, Foxp3 + Tregs, מקרופאגים CD68+, מקרופאגים CD163 + M2, CD1a + DCs ותאי CD8 + T25,26).
  8. באמצעות חישוב התוכנה, קבל את חלקם של תאי מערכת החיסון של רירית הרחם (ראה טבלה 2). השתמש בזה כדי להעריך את רמות תאי החיסון השונים ברירית הרחם של חולים עם הפלות חוזרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על מנת להעריך כמותית את תאי מערכת החיסון של רירית הרחם ולהפחית את חוסר היציבות הנגרם כתוצאה מטעויות תפעוליות מעשה ידי אדם, הקמנו פלטפורמת ניתוח כמותית דיגיטלית לתאי מערכת החיסון של רירית הרחם באמצעות זיהוי אוטומטי של אימונוהיסטוכימיקלים ומערכת הערכה כמותית דיגיטלית. פלטפורמת ניתוח תמונה אימונוהיסטוכימית הוקמה כדי לנתח כמותית תאים חיסוניים רירית הרחם של חולים עם הפלה חוזרת (RM) בחלון ההשתלה. כל רקמות רירית הרחם נאספו במהלך השלב האמצעי-לוטאלי של המחזור החודשי. רקמות רירית הרחם המשובצות בפרפין חולקו לשקופיות בעובי 4 מיקרומטר, ובוצע צביעת IHC לאיתור תאי חיסון רירית הרחם, כולל תאי CD56+uNK, Foxp3+Tregs, מקרופאגים CD163+M2, DC1a+ ותאי T CD8+. השקופיות הפנורמיות נסרקו באמצעות סורק השקופיות הדיגיטלי, והניתוח הכמותי בוצע באמצעות מערכת ניתוח תמונה דיגיטלית. לחישוב אחוז תאי החיסון של רירית הרחם, מחלקים את מספר תאי החיסון במספר הכולל של תאי רירית הרחם. (איור 1 ואיור 2). חלקם של תאי חיסון שונים של רירית הרחם אצל נשים עם RM (N=30) מוצג בטבלה 2.

Figure 1
איור 1: תהליך עבודה סכמטי לניתוח של תאי מערכת החיסון של רירית הרחם האמצעית. איסוף הדגימות נעשה במהלך השלב האמצעי-לוטאלי של המחזור החודשי, 7-9 ימים לאחר זינוק ההורמון luteinizing (LH). הקיבוע נעשה בפורמלין חוצץ 10% נייטרלי למשך 4-6 שעות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הוטמע בשעוות פרפין. צביעת IHC בוצעה לאיתור תאי מערכת החיסון ברירית הרחם בשלב האמצעי-לוטאלי, כולל תאי CD56+uNK, Foxp3+Tregs, מקרופאגים CD68+, מקרופאגים CD163+M2, CD1a+DCs ותאי CD8+T25,26. רקמות נסרקו באמצעות סורק מסחרי וניתוח כמותי בוצע באמצעות מערכת ניתוח תמונה אימונוהיסטוכימית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צביעה חיסונית של תאי רירית הרחם לצורך זיהוי תאי חיסון חיוביים. אימונוסטיין של תאי CD56+uNK, Foxp3+Tregs, מקרופאגים CD68+, מקרופאגים CD163+M2, CD1a + DCs ותאי CD8+T ברירית הרחם מחולי RM. חום מייצג תאי חיסון חיוביים וכחול מייצג את הגרעין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

נוגדן ראשוני שיבוט דילול
CD56 123ג3 1/800
Foxp3 236A/E7 1/100
CD163 10D6 1/1200
CD1a 10 1/200
CD8 4ב11 1/300

טבלה 1: נוגדנים ראשוניים המשמשים במהלך צביעה אימונוהיסטוכימית. הטבלה מציגה את השיבוט והדילול של הנוגדנים הראשוניים.

סמנים חיסוניים חציון (%) מינימום (%) מקסימום (%) ממוצע (%) אחוזון 5 (%) אחוזון 95 (%)
CD56 4.83 1.8 16.76 6.03 2.04 13.63
Foxp3 0.05 0.02 0.12 0.06 0.02 0.11
CD68 0.78 0.37 3.62 0.99 0.44 2.67
CD163 0.84 0.35 2.38 0.93 0.38 2.13
CD1a 0.04 0.01 0.11 0.05 0.01 0.1
CD8 1.69 0.76 4.1 1.85 0.81 3.72

טבלה 2: אחוז תאי חיסון רירית הרחם השונים בנשים עם RM. אחוז תאי CD56+uNK, Foxp3+Tregs, מקרופאגים CD68+, מקרופאגים CD163+M2, CD1a + DCs ותאי CD8+T בחולי RM חושב על ידי פלטפורמת ניתוח תמונה אימונוהיסטוכימית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה הקים פלטפורמת ניתוח תמונה דיגיטלית של אימונוהיסטוכימיה לניתוח כמותי של תאי חיסון רירית הרחם של חולי RM. כאן, שישה סמנים חיסוניים רירית הרחם זוהו כדי להעריך את microenvironment החיסון רירית הרחם בחולי RM.

רירית הרחם הפתוחה בשלב האמצעי-לוטאלי היא המפתח להשתרשות מוצלחות ולהריון27,28. לכן, הערכה של אחוז תאי מערכת החיסון רירית הרחם ממלאת תפקיד חשוב בהערכת קליטת רירית הרחם. ניתוח תאי חיסון רירית הרחם, בשיטות פתולוגיות קונבנציונליות, הוא ניבוי ולכן אינו מסייע ביישום קליני. כיום, אין שיטה סטנדרטית למדידת אחוז תאי החיסון אשר מהווה מחסום להבנת תפקידם של תאים אלה בהריון. ניתוח IHC קונבנציונלי מבוסס על שדות ראייה נבחרים וספירה ידנית. פילוח רקמות מדויק ולוקליזציה של תאי מערכת החיסון אינם ניתנים להערכה באמצעות IHC קונבנציונלי מכיוון שניתוח ידני הוא סובייקטיבי המוביל להטיית צופה29.

בהשוואה לניתוח התפלגות תאי החיסון בתחום הנבחר, ניתוח פנורמי של רקמות מדויק יותר לניתוח התפלגות תאי מערכת החיסון של רירית הרחם. גישות פתולוגיות דיגיטליות המשתמשות באלגוריתמי למידה מבוססי מכונה נבדקו בגידולים מרובים כדי להעריך אזורי רקמות גדולים ופנוטיפים מורכביםשל תאים 30,31. במחקר הנוכחי הוצגה מערכת מסחרית לקבלת תמונה פנורמית של דגימות רירית הרחם. אחוז תאי החיסון של רירית הרחם נקבע לאחר מכן באמצעות ניתוח כמותי אוטומטי המבוסס על מערכת ניתוח התמונה האימונוהיסטוכימית.

מערכת ניתוח התמונה האימונוהיסטוכימית המשמשת כאן היא פלטפורמת ניתוח תמונה המתמחה ברקמות פתולוגיות, המאפשרת פילוח רקמות באמצעות בינה מלאכותית. מחקרים רבים המשתמשים במודולים שונים עם מערכת זו דווחו32,33,34. המערכת שימשה לכימות שינויים וממצאים היסטופתולוגיים שונים שקשה היה לנתח באמצעות תוכנת עיבוד תמונה קונבנציונלית. לדוגמה, מספר תאי CD56+NK מהווה כ -5% מכלל התאים ברירית הרחם במהלך השלב האמצעי-לוטאלי. ניתוח אימונוהיסטוכימי מסורתי קשה לחשב במדויק את מספר תאי CD56+ NK, וזה עשוי לקחת לפחות 30 דקות כדי לחשב את המספר הכולל של תאים חיוביים על כל הקטע, אבל זה לוקח 2-3 דקות עם המערכת המשמשת כאן. לכן, באמצעות מערכת ניתוח התמונה האימונוהיסטוכימית המשמשת כאן, תאי חיסון רירית הרחם יכולים להיות מנותחים בקלות, ובמדויק. כימות ממצאים פתולוגיים על ידי ניתוח תמונה יכול לתרום לשיפור האובייקטיביות, הדיוק והשכנוע של הערכת הסביבה החיסונית של רירית הרחם.

עם זאת, קיימת מגבלה של השיטה המתוארת. אנדומטריום מורכב מאימונוציטים שונים שיש להם קשר עם תוצאות הריון. לכן, הגדרת סמן חיסוני אחד או שניים בלבד עשויה להיות בלתי מספקת. לפיכך, יש צורך בגישות רב-פרמטריות כדי להעריך באופן מקיף פרופיל חיסוני של תאים.

לסיכום, ניתן להסיק כי פרוטוקול זה יישם בהצלחה ניתוח תמונה דיגיטלית בקטעי רירית הרחם במהלך שלב אמצע לוטאלי של חולי RM לכימות תאי מערכת החיסון וניתוח פנורמי נערך במחקר הנוכחי כדי לקבוע את התפלגות רירית הרחם CD56+ uNKs, Foxp3 + Tregs, מקרופאגים CD68+, מקרופאגים CD163+ M2, CD1a+ iDCs ו- CD8+תאי T בשלב האמצעי-לוטאלי. נדרשות ראיות נוספות כדי לתמוך בקשר בין תאי מערכת החיסון של רירית הרחם לבין תוצאות הריון של חולות עם RM ומחקרים עתידיים יתמקדו בכך. זה היה המחקר הראשון שחקר את הסביבה החיסונית של רירית הרחם בחולי RM באמצעות פתולוגיה דיגיטלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים אסירי תודה לכל הנשים שהסכימו ותרמו דגימות למחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated coverslipper Sakuraus DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163 GrowGn Biotechnology NCL-L-CD163
CD1a Gene Tech GM357129
CD56 Gene Tech GT200529
CD8 Novocastra NCL-L-CD8-4B11
Dehydrator Thermo Fisher Excelsior ES
Digital pathology and Indica labs HALO
Foxp3 YILIFANG biological 14-477-82
IHC stainer Leica BOND III
Image analysis platform Indica labs HALO
Slide Scanner Olympus life science VS200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Practice Committee of the American Society for Reproductive. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).
  2. Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. Recurrent pregnancy loss. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98 (2020).
  3. Kavvadas, D., et al. Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss. 12 (2), 177-193 (2022).
  4. Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).
  5. Du, M., et al. Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss. Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).
  6. Faas, M. M., de Vos, P. Uterine NK cells and macrophages in pregnancy. Placenta. 56, 44-52 (2017).
  7. Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).
  8. Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106 (2017).
  9. Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy. American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).
  10. Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study. Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).
  11. Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).
  12. Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF. Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).
  13. Laird, S. M., et al. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).
  14. Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review. Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).
  15. Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. The endometrial immune environment of women with endometriosis. Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).
  16. Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface. Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).
  17. Hey-Cunningham, A. J., et al. Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis. Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).
  18. Zhong, Q., et al. Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages. Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).
  19. Attems, J., et al. Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study. Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).
  20. Kovacs, G. G., et al. Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG). Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).
  21. Modis, L. V., et al. Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology. Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).
  22. Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
  23. Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2. Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).
  24. Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).
  25. Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion. Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).
  26. Diao, L., et al. New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI. Placenta. 99, 180-188 (2020).
  27. Hewitt, S. C., Korach, K. S. Cell biology. A hand to support the implantation window. Science. 331 (6019), 863-864 (2011).
  28. Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).
  29. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).
  30. Algars, A., et al. Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients. International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).
  31. Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
  32. Ascierto, M. L., et al. Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy. Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).
  33. O'Rourke, D. M., et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).
  34. Canesin, G., et al. Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).

Tags

תאי חיסון רירית הרחם אימונוהיסטוכימיה ניתוח תמונה דיגיטלית הפלות חוזרות שלב אמצע לוטאלי רקמות רירית הרחם CD56+ תאי UNC Foxp3+ Tregs מקרופאגים CD163+ M2 CD1a+ DCs תאי T CD8+ ניתוח כמותי מערכת ניתוח תמונה מסחרית חולי אי ספיקת רבייה
פלטפורמה לזיהוי כמותי של תאי מערכת החיסון ברירית הרחם על בסיס אימונוהיסטוכימיה וניתוח תמונה דיגיטלית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C., Huang, C., Wu, Y., Li, Z., … More

Chen, C., Huang, C., Wu, Y., Li, Z., Yu, S., Chen, X., Lian, R., Lin, R., Diao, L., Zeng, Y., Li, Y. Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. J. Vis. Exp. (200), e65643, doi:10.3791/65643 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter