Summary
여기에서 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 개발하여 착상 기간 동안 유산이 재발한 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있도록 검증했습니다.
Abstract
재발성 유산(RM) 환자의 자궁내막 면역 미세환경을 평가하기 위해 황체 중기 동안 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있는 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 개발 및 검증했습니다. 모든 자궁내막 샘플은 월경 주기의 황체 중기에 수집되었습니다. 파라핀이 포매된 자궁내막 조직을 4μm 두께의 슬라이드로 절단하고, CD56+ uNK 세포, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2 대식세포, CD1a+ DC, CD8+ T 세포를 포함한 자궁내막 면역 세포를 검출하기 위해 면역조직화학(IHC) 염색을 수행했습니다. 파노라마 슬라이드는 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 스캔했으며 정량 분석을 위해 상용 이미지 분석 시스템을 사용했습니다. 자궁내막 면역세포의 비율은 전체 자궁내막세포의 면역세포 수를 나누어 계산하였다. 상용 영상 분석 시스템을 이용하면 기존의 영상 분석으로는 분석이 어렵거나 불가능했던 자궁내막 면역세포의 정량 평가를 쉽고 정확하게 분석할 수 있습니다. 이 방법론은 면역 세포 간의 상호 작용과 다양한 생식 부전 환자에 대한 이질성을 포함하여 자궁 내막 미세 환경을 정량적으로 특성화하는 데 적용할 수 있습니다. 자궁내막 면역 세포의 정량적 평가를 위한 플랫폼은 RM 환자의 진단 및 치료에 중요한 임상적 중요성을 가질 수 있습니다.
Introduction
재발성 유산(RM)은 두 번 이상의 연속적인 임신을 상실하는 것으로, 최근 몇 년 동안 임상의들의 관심을 끌고 있는 복잡한 질병입니다. 가임기 여성의 RM 발생률은 1%-5%입니다 1. 이전 연구의 결과는 면역 요인이 RM 2,3,4,5의 발병과 밀접한 관련이 있음을 보여줍니다. 모체-태아 계면에서 면역 항상성을 유지하는 것은 배아 착상과 발달에 필요합니다. 자궁내막 면역세포는 영양세포 침범 촉진, 나선형 동맥 개조, 태반 발달에 기여하는 등 이러한 항상성을 유지하기 위해 여러 가지 조절 역할을 수행합니다 6,7,8,9.
RM이 있는 여성의 비정상적인 자궁내막 면역 세포는 이전에 보고된 바 있습니다. 결과는 자궁 자연 살해 세포(uNK)의 고밀도와 RM10,11,12의 발생 사이에 밀접한 연관성이 있음을 보여줍니다. RM을 가진 여성의 자궁내막에서 대식세포의 수가 증가한 것으로 보고되었는데, 이는 출산을 한 여성에 비해 증가한 수치이다13. 조절 T 세포(Treg)는 배아에 대한 모계의 면역 관용에 중요한 역할을 하며, RM 환자의 데시두아에서 그 수준과 기능이 감소한다14. 세포독성 T 세포(CTL)와 수지상 세포(DC)도 임신의 면역 조절에 중요한 역할을 합니다15,16. 따라서 황체 중기 동안 국소 자궁내막 면역 세포에 대한 포괄적인 정량 분석은 RM의 발병 기전을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 자궁내막 면역 세포의 정량적 분석을 위한 일부 현재 방법은 여러 마커를 가진 면역 세포를 정확하게 표지할 수 있는 유세포 분석을 사용합니다17,18. 그러나 유세포 분석의 임상적 적용은 신선한 조직에서만 수행할 수 있기 때문에 제한적입니다. 신선한 조직을 얻는 것은 자궁내막에서 드물게 발생하는 많은 양의 과도한 종양을 사용할 수 있을 때만 가능합니다. 면역조직화학은 조직 형태를 현장에서 잘 관찰할 수 있고 다양한 면역 세포를 표지할 수 있는 반면, 기존의 면역조직화학 기법은 면역 세포의 정량 분석을 수행할 수 없습니다.
기존의 면역조직화학 실험과 비교했을 때, 자궁내막의 면역세포에 대한 정량적 면역조직화학적 분석은 임상적으로 중요한 의미를 지닙니다. IHC 강도 점수는 일반적으로 병리학적 진단 및 연구에서 4점 척도 또는 강하고 약한 것으로 평가됩니다 19,20,21. 그러나 이 반정량적 기법은 주관적이고, 매우 부정확하며, 관찰자 내 및 관찰자 간 변동성이 크다22. 한 가지 가능한 해결책은 기계 학습의 적용이며, 이는 디지털 이미지 분석에서 가치 있는 것입니다23,24. 정량적 측정을 제공함으로써 이 접근법은 자궁 조직 내 면역 세포 침투, 분포 및 밀도를 보다 정확하게 평가할 수 있습니다. 이 정량적 정보는 월경 주기 및 다양한 병리학적 조건에서 면역 세포 집단의 동적 변화를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전반적으로, 면역조직화학을 통해 자궁내막의 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있는 능력은 자궁의 면역 미세환경에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
따라서 이 프로토콜은 RM 환자의 황체 중기 동안 uNK 세포, Tregs, 대식세포, DC 및 세포독성 T 세포를 포함한 자궁내막 면역 세포를 정량적으로 분석하기 위한 디지털 면역조직화학 이미지 분석 플랫폼을 개발하고 검증하는 것을 목표로 했습니다.
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Protocol
연구 내용과 프로토콜은 Shenzhen Zhongshan Urology Hospital의 연구 윤리 위원회에서 윤리적으로 검토하고 승인했습니다. 연구에 참여한 모든 여성(20-40세)은 샘플 수집 및 사용에 대해 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.
1. 병리조직의 획득
- 조직 채취를 위한 도구, 즉 측정 자, 핀셋, 임베딩 카세트, 임베딩 용지 및 티슈 바구니를 준비합니다.
- 피펠 카테터와 함께 표준 접근법을 사용하여 수집된 자궁내막 조직(녹두보다 큼)의 양이 충분한지 관찰합니다.
- 포르말린에서 자궁내막 조직을 핀셋으로 임베딩 페이퍼에 옮기고 자로 자궁내막 조직 치수를 측정합니다.
- 자궁내막 조직을 임베딩 페이퍼로 감싸고 임베딩 카세트에 넣습니다.
- 탈수를 위해 임베딩 카세트를 티슈 바스켓에 넣습니다.
2. 조직 탈수
- 티슈 바스켓을 탈수기의 반응 챔버에 넣고 ( 재료 표 참조) 일상적인 조직 탈수 절차를 시작합니다 : 포르말린 100 분; 100분 동안 포르말린; 60분 동안 75% 알코올; 60분 동안 85% 알코올; 60분 동안 95% 알코올; 60분 동안 100% 알코올; 60분 동안 100% 알코올; 60분 동안 100% 알코올; 35분 동안 크실렌; 20분 동안 크실렌; 20분 동안 크실렌; 80 분 동안 왁스; 80 분 동안 왁스; 80분 동안 왁스를 바릅니다. 이 과정은 약 15 시간이 걸립니다.
- 조직 탈수 절차가 끝나면 탈수기의 반응 챔버를 열고 티슈 바스켓을 제거합니다.
3. 조직 임베딩
- 시편의 크기에 따라 적절한 매립 금형을 꺼내 70°C에서 파라핀 왁스를 채운다.
- 티슈를 몰드에 빠르게 넣고 티슈가 몰드 중앙에 오도록 조심스럽게 조정합니다.
- 금형을 냉각판으로 부드럽게 옮기고 바닥의 파라핀이 굳는 동안 티슈를 부드럽게 누릅니다.
- 몰드 위에 임베딩 카세트를 놓고 왁스를 더 얹습니다.
- 냉각판에 금형을 놓고 파라핀이 완전히 응고되면 부착된 카세트가 있는 블록을 금형에서 제거합니다.
4. 조직 단면
- 마이크로톰의 샘플 클립에 블록을 삽입하고 블레이드를 홀더에 놓고 블록 평면과 블레이드 사이의 각도를 조정하고 단면의 두께를 4μm로 조정하고 핸드 휠을 돌리고 슬라이싱을 시작합니다.
- 블록에서 몇 개의 얇은 부분을 잘라 적절한 조직 표면을 노출시킵니다. 브러시로 연속적이고 완전한 섹션을 꺼냅니다.
- 단면이 충분히 절단되면 핸드 휠을 돌리는 것을 멈추고 핀셋으로 앞쪽 끝의 부적격 단면을 제거하고 핀셋과 브러시로 수조의 42°C 물 표면에 단면을 띄웁니다.
- 섹션이 완전히 평평해지면 분리 방지 슬라이드에서 섹션을 선택하고 65°C의 슬라이드 워머로 옮겨 60분 동안 굽습니다.
- 베이킹이 끝나면 슬라이드 워머에서 유리 슬라이드를 꺼냅니다.
5. 면역조직화학적 염색
- 1차 항체를 항체 희석제가 있는 작업 용액에 희석합니다. 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오.
- 희석된 항체 용액을 특수 시약 병에 넣고 검출 키트를 자동 IHC 염색기의 시약 구획에 넣습니다( 재료 표 참조).
- 특수 커버타일로 덮인 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓고 기기의 실험 반응 구획에 삽입합니다.
- 기기가 슬라이드의 시약 및 실험 정보를 자동으로 인식한 후 시작 버튼을 클릭하여 면역조직화학적 염색을 시작합니다. 실험은 약 3시간 동안 지속됩니다.
6. 활주의 탈수함 그리고 바다표범 어업
- 면역조직화학적 염색 후 슬라이드 홀더를 꺼내고 특수 커버타일을 제거하고 염색된 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 슬라이드에 남아 있는 염료를 깨끗한 물로 씻어냅니다.
- 슬라이드 홀더를 자동 커버슬리퍼( 재료 표 참조)로 옮기고 탈수 및 밀봉 절차를 선택하고 실행합니다.
- 탈수 및 밀봉 후 슬라이드를 꺼냅니다.
7. 슬라이드 스캔
- 슬라이드를 파노라마 병리학적 이미지 스캐너의 슬라이드 랙에 놓고( 재료 표 참조) 파노라마 병리학적 이미지 스캔을 위해 기기 슬라이드 스캔 구획에 놓습니다. 스캔하는 데 2분이 걸립니다. 그림 1을 참조하십시오.
8. 이미지 분석
- 이미지 가져오기
- 병리학적 이미지 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 열고 새 폴더를 만듭니다. 분석할 면역조직화학적 이미지를 가져옵니다.
- 조직 분류기 구축
- 여러 조직과 빈 주석을 표시하여 조직과 빈 영역을 각각 식별하기 위한 분류기를 훈련하고 설정합니다.
- 실시간 튜닝을 사용하여 마크 주석을 추가하는 동안 소프트웨어의 인식 용량을 실시간으로 관찰할 수 있습니다. 인식이 적시에 이루어지지 않으면 주석을 달고 조직 인식이 정확해질 때까지 다시 훈련하십시오.
- 분석 알고리즘 구축
- 실험 유형에 따라 소프트웨어에서 표준 알고리즘을 선택하십시오 : 멀티플렉스 IHC.
- 셀 인식의 색상 매개변수는 일반적인 음수 및 양수 픽셀을 선택하여 설정합니다.
이를 기반으로 핵, 세포질, 세포막의 파라미터를 설정하고, 이미지에 가장 적합한 파라미터를 찾을 때까지 실시간으로 세포 인식 상황을 관찰합니다. - 양성 세포 인식 임계값을 설정하고 적절한 임계값이 조정될 때까지 실시간으로 인식 상황을 관찰합니다.
- 알고리즘에서 조직 분류기를 선택하고 조직 분류기에서 조직 부분을 확인하여 조직을 기반으로 세포를 식별합니다. 이 시점에서 분석 알고리즘 설정이 완료됩니다.
- 이미지 분석 실행
- 분석 영역을 선택합니다. 설정된 알고리즘을 사용하여 이미지를 분석합니다.
- 소프트웨어 분석이 완료되면 조직 인식, 음성 및 양성 세포 인식을 포함하여 이미지 인식이 정확한지 수동으로 확인합니다.
- 이미지 인식이 정확하지 않으면 알고리즘과 파라미터 임계값을 다시 조정하고 성공할 때까지 이미지 분석을 다시 실행합니다. 분석 결과를 내보냅니다. 그림 1을 참조하십시오.
- 위의 단계에 따라 다른 면역 세포도 분석할 수 있습니다(그림 1 참조). 다양한 자궁내막 면역 마커(CD56+uNK 세포, Foxp3+Tregs, CD68+ 대식세포, CD163+M2 대식세포, CD1a+DC 및 CD8+T 세포25,26)의 실제 발현에 따라 다양한 분석 파라미터를 설정합니다.
- 소프트웨어의 계산을 통해 자궁내막 면역 세포의 비율을 얻습니다( 표 2 참조). 이를 사용하여 재발성 유산 환자의 자궁내막에 있는 다양한 면역 세포의 수준을 평가합니다.
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Representative Results
자궁내막 면역세포를 정량적으로 평가하고 인위적인 조작 실수로 인한 불안정성을 줄이기 위해 자동 면역조직화학적 검출 및 디지털 정량 평가 시스템을 사용하여 자궁내막 면역세포에 대한 디지털 정량 분석 플랫폼을 구축했습니다. 이식 기간 동안 재발성 유산(RM) 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석하기 위해 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 구축하였습니다. 모든 자궁내막 조직은 생리 주기의 황체 중기 동안 수집되었습니다. 파라핀이 포매된 자궁내막 조직을 4μm 두께의 슬라이드로 분할하고, CD56+uNK 세포, Foxp3+Tregs, CD163+M2 대식세포, CD1a+ DC, CD8+ T 세포를 포함한 자궁내막 면역 세포를 검출하기 위해 IHC 염색을 수행했습니다. 파노라마 슬라이드는 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 스캔하고 디지털 이미지 분석 시스템을 사용하여 정량 분석을 수행했습니다. 자궁내막 면역세포의 비율을 계산하기 위해서는 면역세포의 수를 자궁내막세포의 총 수로 나눕니다. (그림 1 및 그림 2). RM(N=30)이 있는 여성의 다양한 자궁내막 면역세포의 비율은 표 2에 나와 있습니다.
그림 1: 황체 중간 자궁내막 면역 세포 분석을 위한 개략도 워크플로우. 샘플 수집은 황체 형성 호르몬(LH) 급증 후 7-9일 후인 월경 주기의 황체 중간 단계에서 수행되었습니다. 고정은 실온에서 4-6시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 수행한 후 파라핀 왁스에 매립시켰다. IHC 염색은 CD56+uNK 세포, Foxp3+Tregs, CD68+ 대식세포, CD163+M2 대식세포, CD1a+DC 및 CD8+T 세포를 포함하여 황체 중기 동안 자궁내막에서 면역 세포를 검출하기 위해 수행되었습니다25,26. 상용 스캐너를 사용하여 조직을 스캔하고 면역조직화학 이미지 분석 시스템을 사용하여 정량 분석을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 양성 면역 세포 식별을 위한 자궁내막 세포의 면역염색. RM 환자의 자궁내막에서 CD56+uNK 세포, Foxp3+Tregs, CD68+ 대식세포, CD163+M2 대식세포, CD1a+DC 및 CD8+T 세포의 면역염색. 갈색은 양성 면역 세포를 나타내고 파란색은 핵을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 1차 항체 | 클론 | 희석 |
| CD56 시리즈 | 123C3 시리즈 | 1/800 |
| 폭스피3 | 236A/E7 | 1/100 |
| CD163 시리즈 | 10D6 시리즈 | 1/1200 |
| CD1a (CD1a) | 10 | 1/200 |
| CD8 시리즈 | 4나11 | 1/300 |
표 1: 면역조직화학적 염색 중에 사용된 1차 항체. 표는 1차 항체의 클론 및 희석을 보여줍니다.
| 면역 마커 | 중앙값(%) | 최소(%) | 최대(%) | 평균(%) | 5번째 백분위수(%) | 95번째 백분위수(%) |
| CD56 시리즈 | 4.83 | 1.8 | 16.76 | 6.03 | 2.04 | 13.63 |
| 폭스피3 | 0.05 | 0.02 | 0.12 | 0.06 | 0.02 | 0.11 |
| CD68 시리즈 | 0.78 | 0.37 | 3.62 | 0.99 | 0.44 | 2.67 |
| CD163 시리즈 | 0.84 | 0.35 | 2.38 | 0.93 | 0.38 | 2.13 |
| CD1a (CD1a) | 0.04 | 0.01 | 0.11 | 0.05 | 0.01 | 0.1 |
| CD8 시리즈 | 1.69 | 0.76 | 4.1 | 1.85 | 0.81 | 3.72 |
표 2: RM이 있는 여성의 다양한 자궁내막 면역 세포의 비율. RM 환자에서 CD56+uNK 세포, Foxp3+Tregs, CD68+ 대식세포, CD163+M2 대식세포, CD1a+DC 및 CD8+T 세포의 비율은 면역조직화학 이미지 분석 플랫폼으로 계산되었습니다.
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Discussion
이 프로토콜은 RM 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석하기 위한 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 구축했습니다. 여기에서 RM 환자의 자궁내막 면역 미세환경을 평가하기 위해 6개의 자궁내막 면역 마커를 검출했습니다.
황체 중기의 수용성 자궁내막은 성공적인 착상과 임신의 핵심이다27,28. 따라서 자궁내막 면역세포의 비율은 자궁내막 수용성을 추정하는 데 중요한 역할을 합니다. 자궁내막 면역 세포 분석은 기존의 병리학적 방법으로 예측하기 때문에 임상 적용에 도움이 되지 않습니다. 현재 면역 세포 비율을 측정하기 위한 표준화된 방법이 없어 임신 중 면역 세포 비율의 역할을 이해하는 데 장벽이 되고 있습니다. 기존의 IHC 분석은 선택된 시야와 수동 카운팅을 기반으로 합니다. 면역 세포의 정확한 조직 분할 및 국소화는 수동 분석이 주관적이기 때문에 기존 IHC로 평가할 수 없습니다29.
선택한 분야의 면역세포 분포 분석에 비해 자궁내막 면역세포의 분포를 분석하는 데 조직의 파노라마 분석이 더 정확합니다. 기계 기반 학습 알고리즘을 활용하는 디지털 병리학 접근법은 큰 조직 영역과 복잡한 세포 표현형을 평가하기 위해 여러 종양에서 테스트되었습니다30,31. 본 연구에서는 자궁내막 샘플의 파노라마 이미지를 얻기 위한 상용 시스템을 도입하였다. 자궁내막 면역세포의 비율은 면역조직화학 영상 분석 시스템을 기반으로 한 자동 정량 분석을 사용하여 이후에 측정되었습니다.
여기서 사용하는 면역조직화학 영상분석 시스템은 인공지능을 이용한 조직 분할이 가능한 병리조직에 특화된 영상분석 플랫폼이다. 이 시스템과 함께 다양한 모듈을 사용하는 많은 연구가 보고되었습니다32,33,34. 이 시스템은 기존의 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 분석하기 어려웠던 다양한 조직 병리학적 변화와 결과를 정량화하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, CD56+NK 세포의 수는 황체 중기에 자궁 내막에 있는 전체 세포의 약 5%를 차지합니다. 기존의 면역조직화학적 분석은 CD56+ NK 세포의 수를 정확하게 계산하기 어렵고, 전체 절편의 총 양성 세포 수를 계산하는 데 최소 30분이 소요될 수 있지만, 여기에 사용된 시스템에서는 2-3분이 소요됩니다. 따라서 여기에 사용된 면역조직화학 영상 분석 시스템을 이용하면 자궁내막 면역세포를 쉽고 정확하게 분석할 수 있습니다. 영상 분석을 통한 병리학적 소견의 정량화는 자궁내막 면역환경 평가의 객관성, 정밀도 및 설득력을 높이는 데 기여할 수 있습니다.
그러나 설명된 방법에는 한계가 있습니다. 자궁내막은 임신 결과와 관련이 있는 다양한 면역세포로 구성되어 있습니다. 따라서 하나 또는 두 개의 면역 마커만 정의하는 것만으로는 충분하지 않을 수 있습니다. 따라서 세포의 면역 프로파일링을 종합적으로 평가하기 위해 다중 파라미터 접근법이 필요합니다.
요약하면, 이 프로토콜은 RM 환자의 황체기 중기에 자궁내막 절편에 디지털 이미지 분석을 성공적으로 적용하여 면역세포의 정량화를 성공적으로 수행했으며, 본 연구에서는 자궁내막 CD56+ uNK, Foxp3+Tregs, CD68+ 대식세포, CD163+ M2 대식세포, CD1a+ iDC 및 CD8+의 분포를 결정하기 위해 파노라마 분석을 수행했다고 결론지을 수 있습니다황체기 중기의 T 세포. 자궁내막 면역 세포와 RM 환자의 임신 결과 사이의 연관성을 뒷받침하기 위해서는 더 많은 증거가 필요하며, 향후 연구에서는 이에 초점을 맞출 것이다. 이번 연구는 RM 환자의 자궁내막 면역 환경을 디지털 병리학을 이용하여 조사한 최초의 연구였다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 이 연구에 동의하고 샘플을 기증한 모든 여성들에게 감사한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
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