Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

منصة للكشف الكمي عن الخلايا المناعية البطانية على أساس الكيمياء المناعية وتحليل الصور الرقمية

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65643
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Shenzhen Key Laboratory of Reproductive Immunology for Peri-implantation, Shenzhen Zhongshan Institute for Reproduction and Genetics, Fertility Center, Shenzhen Zhongshan Urology Hospital, 2Shenzhen Jinxin Medical Technology Innovation Center, Co., Ltd.

Summary

هنا ، تم تطوير منصة رقمية لتحليل صور الكيمياء المناعية والتحقق من صحتها لتحليل الخلايا المناعية البطانية للمرضى الذين يعانون من الإجهاض المتكرر في نافذة الزرع كميا.

Abstract

لتقييم البيئة الدقيقة المناعية لبطانة الرحم للمرضى الذين يعانون من الإجهاض المتكرر (RM) ، تم تطوير منصة رقمية لتحليل صور الكيمياء المناعية المناعية والتحقق من صحتها لتحليل الخلايا المناعية البطانية كميا خلال المرحلة المتوسطة الصفراء. تم جمع جميع عينات بطانة الرحم خلال المرحلة المتوسطة الصفراء من الدورة الشهرية. تم تقسيم أنسجة بطانة الرحم المضمنة في البارافين إلى شرائح بسمك 4 ميكرومتر ، وتم إجراء تلطيخ الكيمياء المناعية (IHC) للكشف عن الخلايا المناعية البطانية الرحمية ، بما في ذلك خلايا CD56 + uNK ، و Foxp3 + Tregs ، و CD163 + M2 البلاعم ، و CD1a + DCs ، وخلايا CD8 + T. تم مسح الشرائح البانورامية ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي رقمي للشرائح وتم استخدام نظام تحليل الصور التجارية للتحليل الكمي. تم حساب النسبة المئوية للخلايا المناعية البطانية بقسمة عدد الخلايا المناعية في إجمالي خلايا بطانة الرحم. باستخدام نظام تحليل الصور التجارية ، يمكن تحليل التقييم الكمي للخلايا المناعية البطانية الرحمية ، والتي يصعب أو يستحيل تحليلها باستخدام تحليل الصور التقليدي ، بسهولة وبدقة. يمكن تطبيق هذه المنهجية لتوصيف البيئة المكروية بطانة الرحم كميا ، بما في ذلك التفاعل بين الخلايا المناعية ، وعدم تجانسها لمرضى الفشل التناسلي المختلفين. قد تكون منصة التقييم الكمي للخلايا المناعية البطانية ذات أهمية سريرية مهمة لتشخيص وعلاج مرضى RM.

Introduction

الإجهاض المتكرر (RM) هو فقدان حملين متتاليين أو أكثر وهو مرض معقد يجذب انتباه الأطباء في السنوات الأخيرة. معدل حدوث RM في النساء في سن الإنجاب هو 1٪ -5٪ 1. تظهر نتائج الدراسات السابقة أن العوامل المناعية ترتبط ارتباطا وثيقا بالتسبب في RM2،3،4،5. الحفاظ على التوازن المناعي في واجهة الأم والجنين مطلوب لزرع الجنين وتطوره. تؤدي الخلايا المناعية البطانية الرحمية عدة أدوار تنظيمية للحفاظ على هذا التوازن ، مثل تعزيز غزو الأرومة الغاذية ، وإعادة تشكيل الشرايين الحلزونية ، والمساهمة في نمو المشيمة6،7،8،9.

تم الإبلاغ سابقا عن خلايا مناعية بطانة الرحم الشاذة لدى النساء المصابات ب RM. تظهر النتائج ارتباطا وثيقا بين الكثافة العالية للخلايا القاتلة الطبيعية للرحم (uNKs) وحدوثRM 10،11،12. تم الإبلاغ عن عدد متزايد من البلاعم في بطانة الرحم للنساء المصابات ب RM ، مقارنة بأولئك الذين ولدوا أحياء13. تلعب الخلايا التائية التنظيمية (Treg) دورا في تحمل الأم المناعي تجاه الجنين ، وينخفض مستواها ووظيفتها في نفضي مرضى RM14. تلعب الخلايا التائية السمية الخلوية (CTL) والخلايا المتغصنة (DCs) أيضا دورا في التنظيم المناعي للحمل15,16. لذلك ، يمكن أن يساعد التحليل الكمي الشامل للخلايا المناعية البطانية المحلية خلال المرحلة المتوسطة الصفراء على فهم التسبب في RM بشكل أفضل. تستخدم بعض الطرق الحالية للتحليل الكمي للخلايا المناعية البطانية قياس التدفق الخلوي الذي يمكنه تسمية الخلايا المناعية بدقة بعلامات متعددة17,18. ومع ذلك ، فإن التطبيق السريري لقياس التدفق الخلوي محدود لأنه لا يمكن إجراؤه إلا على الأنسجة الطازجة. لا يمكن الحصول على أنسجة جديدة إلا عند توفر كمية كبيرة من الورم الزائد ، وهو أمر نادر الحدوث لبطانة الرحم. يمكن للكيمياء الهيستولوجية المناعية مراقبة مورفولوجيا الأنسجة جيدا في الموقع ويمكنها أيضا تسمية الخلايا المناعية المختلفة ، في حين أن التقنيات الكيميائية المناعية التقليدية لا يمكنها إجراء تحليل كمي للخلايا المناعية.

بالمقارنة مع تجارب الكيمياء المناعية التقليدية ، فإن التحليل الكيميائي المناعي الكمي للخلايا المناعية في بطانة الرحم له أهمية سريرية مهمة. عادة ما يتم تصنيف درجات كثافة IHC على مقياس من أربع نقاط أو قوي وضعيف في التشخيص المرضي والبحوث19،20،21. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية شبه الكمية ذاتية وغير دقيقة إلى حد كبير ، وتوضح تباينا كبيرا داخل المراقب وبينالمراقبين 22. أحد الحلول الممكنة هو تطبيق التعلم الآلي ، وهو تحليل الصور الرقميةالقيمة 23,24. من خلال توفير قياسات كمية ، يتيح هذا النهج تقييما أكثر دقة لتسلل الخلايا المناعية وتوزيعها وكثافتها داخل أنسجة الرحم. يمكن أن تساعد هذه المعلومات الكمية في توضيح التغيرات الديناميكية في مجموعات الخلايا المناعية أثناء دورة الطمث وفي الحالات المرضية المختلفة. بشكل عام ، توفر القدرة على التحليل الكمي للخلايا المناعية في بطانة الرحم من خلال الكيمياء الهيستولوجية المناعية رؤى قيمة في البيئة المكروية المناعية للرحم.

لذلك ، يهدف البروتوكول إلى تطوير والتحقق من صحة منصة رقمية لتحليل صور الكيمياء المناعية المناعية لتحليل الخلايا المناعية البطانية الرحمية كميا بما في ذلك خلايا uNK و Tregs والبلاعم و DCs والخلايا التائية السامة للخلايا خلال المرحلة المتوسطة الصفراء في مرضى RM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت مراجعة محتوى البحث والبروتوكول بشكل أخلاقي والموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات البحث في مستشفى شنتشن تشونغشان لجراحة المسالك البولية. قدمت جميع النساء (20-40 سنة) المشاركات في الدراسة موافقة مستنيرة لجمع العينات واستخدامها.

1. اكتساب الأنسجة المرضية

  1. قم بإعداد أدوات حصاد الأنسجة وهي مسطرة القياس ، والملقط ، وتضمين الكاسيت ، وورق التضمين ، وسلة المناديل.
  2. لاحظ ما إذا كانت كمية أنسجة بطانة الرحم (أكبر من حبة مونج) ، التي تم جمعها باستخدام نهج قياسي مع قسطرة pipelle ، كافية.
  3. نقل أنسجة بطانة الرحم من الفورمالين إلى ورقة التضمين مع ملقط وقياس أبعاد أنسجة بطانة الرحم مع المسطرة.
  4. لف أنسجة بطانة الرحم بورق التضمين وضعها في شريط التضمين.
  5. ضع علبة التضمين في سلة المناديل للجفاف.

2. جفاف الأنسجة

  1. ضع سلة الأنسجة في غرفة تفاعل المجفف (انظر جدول المواد) وابدأ إجراء تجفيف الأنسجة الروتيني: الفورمالين لمدة 100 دقيقة ؛ الفورمالين لمدة 100 دقيقة ؛ 75٪ كحول لمدة 60 دقيقة ؛ 85٪ كحول لمدة 60 دقيقة ؛ 95٪ كحول لمدة 60 دقيقة ؛ كحول 100٪ لمدة 60 دقيقة ؛ كحول 100٪ لمدة 60 دقيقة ؛ كحول 100٪ لمدة 60 دقيقة ؛ زيلين لمدة 35 دقيقة ؛ زيلين لمدة 20 دقيقة ؛ زيلين لمدة 20 دقيقة ؛ الشمع لمدة 80 دقيقة ؛ الشمع لمدة 80 دقيقة ؛ الشمع لمدة 80 دقيقة. تستغرق العملية حوالي 15 ساعة.
  2. في نهاية إجراء تجفيف الأنسجة ، افتح غرفة تفاعل المجفف ، وأزل سلة الأنسجة.

3. تضمين الأنسجة

  1. أخرج قالب تضمين مناسب وفقا لحجم العينة ، واملأه بشمع البارافين عند 70 درجة مئوية.
  2. ضع الأنسجة بسرعة في القالب واضبطها بعناية بحيث يقع النسيج في وسط القالب.
  3. حرك القالب بسلاسة إلى لوحة التبريد واضغط برفق على المنديل بينما يثبت البارافين في الأسفل.
  4. ضع شريط التضمين أعلى القالب وقم بتعبئته بمزيد من الشمع.
  5. ضع القالب على لوحة التبريد ، وعندما يتم ترسيخ البارافين تماما ، قم بإزالة الكتلة مع الكاسيت المرفق بها بعيدا عن القالب.

4. أقسام الأنسجة

  1. أدخل الكتلة على مشبك عينة الميكروتوم ، ضع الشفرة في الحامل ، اضبط الزاوية بين مستوى الكتلة والشفرة ، اضبط سمك القسم إلى 4 ميكرومتر ، أدر عجلة اليد ، وابدأ التقطيع.
  2. فضح سطح الأنسجة المناسب عن طريق قطع بضعة أقسام رقيقة من الكتلة. أخرج الأقسام المستمرة والكاملة بالفرشاة.
  3. عندما يتم قطع أقسام كافية ، توقف عن تدوير عجلة اليد ، وقم بإزالة الأقسام غير المؤهلة في الواجهة الأمامية بملاقط ، وقم بتعويم الأقسام على سطح ماء 42 درجة مئوية في حمام مائي بملاقط وفرشاة.
  4. بعد تسطيح الأقسام بالكامل ، اختر الأقسام الموجودة على الشرائح المضادة للانفصال وانقلها إلى جهاز تدفئة منزلق عند 65 درجة مئوية للخبز لمدة 60 دقيقة.
  5. عند الانتهاء من الخبز ، أخرج الشرائح الزجاجية من جهاز تدفئة المنزلق.

5. تلطيخ كيميائي مناعي

  1. تمييع الجسم المضاد الأساسي في حل العمل مع مخفف الأجسام المضادة. انظر الجدول 1 للحصول على التفاصيل.
  2. ضع محلول الأجسام المضادة المخفف في زجاجة كاشف خاصة ومجموعة الكشف في حجرة الكاشف لأداة تلطيخ IHC الأوتوماتيكية (انظر جدول المواد).
  3. ضع الشرائح على حامل منزلق ، مغطى بغطاء خاص ، وأدخلها في حجرة التفاعل التجريبي للأداة.
  4. بعد أن يتعرف الجهاز تلقائيا على الكاشف والمعلومات التجريبية على الشريحة ، انقر فوق الزر "ابدأ " لبدء التلوين الكيميائي المناعي. تستمر التجربة لمدة 3 ساعات.

6. الجفاف وختم الشريحة

  1. بعد تلطيخ المواد الكيميائية المناعية ، أخرج حامل الشريحة ، واخلع الغطاء الخاص ، وضع الشريحة الملطخة في حامل الشريحة ، واغسل الصبغة المتبقية على الشريحة بالماء النظيف.
  2. انقل حامل الشريحة إلى شبشب غطاء آلي (انظر جدول المواد) ، وحدد إجراء التجفيف والختم وقم بتشغيله.
  3. أخرج الشرائح بعد الجفاف والختم.

7. مسح الشريحة

  1. ضع الشرائح على رف الشرائح الخاص بماسح الصور المرضية البانورامي (انظر جدول المواد) وضعها في حجرة مسح شرائح الجهاز لمسح الصور المرضية البانورامية. يستغرق المسح 2 دقيقة. انظر الشكل 1.

8. تحليل الصور

  1. استيراد صورة
    1. افتح برنامج تحليل الصور المرضية (انظر جدول المواد) وأنشئ مجلدا جديدا. استيراد الصور المناعية الكيميائية لتحليلها.
  2. بناء مصنف الأنسجة
    1. ضع علامة على العديد من الأنسجة والتعليق التوضيحي الفارغ لتدريب وإنشاء مصنف لتحديد الأنسجة والمنطقة الفارغة ، على التوالي.
    2. استخدم الضبط في الوقت الفعلي لمراقبة قدرة التعرف على البرنامج في الوقت الفعلي أثناء التعليق التوضيحي للعلامة. إذا لم يكن التعرف في الوقت المناسب ، فقم بملاحظة التعليق التوضيحي وتدرب مرة أخرى حتى يصبح التعرف على الأنسجة دقيقا.
  3. بناء خوارزمية التحليل
    1. حدد الخوارزمية القياسية في البرنامج وفقا لنوع التجربة: تعدد الإرسال IHC.
    2. اضبط معلمات اللون للتعرف على الخلايا عن طريق تحديد بكسل سلبي وموجب نموذجي.
      على هذا الأساس ، قم بتعيين معلمات النواة والسيتوبلازم وغشاء الخلية ، ولاحظ حالة التعرف على الخلايا في الوقت الفعلي حتى يتم العثور على المعلمات الأكثر ملاءمة للصورة.
    3. قم بتعيين عتبة التعرف على الخلايا الإيجابية ولاحظ حالة التعرف في الوقت الفعلي حتى يتم ضبط العتبة المناسبة.
    4. حدد مصنف الأنسجة في الخوارزمية ، وتحقق من جزء الأنسجة في مصنف الأنسجة ، وذلك لتحديد الخلايا على أساس الأنسجة. في هذه المرحلة ، يتم الانتهاء من إنشاء خوارزمية التحليل.
  4. تشغيل تحليل الصور
    1. حدد منطقة التحليل. استخدم الخوارزمية المعمول بها لتحليل الصور.
  5. بعد الانتهاء من تحليل البرنامج ، تحقق يدويا مما إذا كان التعرف على الصور دقيقا ، بما في ذلك التعرف على الأنسجة والتعرف على الخلايا السلبية والإيجابية.
  6. إذا لم يكن التعرف على الصورة دقيقا، فاضبط عتبة الخوارزمية والمعلمات مرة أخرى، وأعد تشغيل تحليل الصورة حتى النجاح. تصدير نتائج التحليل. انظر الشكل 1.
  7. يمكن أيضا تحليل الخلايا المناعية الأخرى وفقا للخطوات المذكورة أعلاه (انظر الشكل 1). تعيين معلمات تحليل مختلفة وفقا للتعبير الفعلي لعلامات المناعة البطانية المختلفة (خلايا CD56 + uNK ، Foxp3 + Tregs ، CD68 + البلاعم ، الضامة CD163 + M2 ، CD1a + DCs وخلايا CD8 + T25،26).
  8. من خلال حساب البرنامج ، احصل على نسبة الخلايا المناعية البطانية (انظر الجدول 2). استخدم هذا لتقييم مستويات الخلايا المناعية المختلفة في بطانة الرحم للمرضى الذين يعانون من الإجهاض المتكرر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من أجل تقييم الخلايا المناعية البطانية كميا وتقليل عدم الاستقرار الناجم عن الأخطاء التشغيلية التي من صنع الإنسان ، أنشأنا منصة تحليل كمي رقمية للخلايا المناعية البطانية باستخدام الكشف المناعي الكيميائي التلقائي ونظام التقييم الكمي الرقمي. تم إنشاء منصة تحليل صور الكيمياء المناعية لتحليل الخلايا المناعية البطانية الرحمية للمرضى الذين يعانون من الإجهاض المتكرر (RM) في نافذة الزرع كميا. تم جمع جميع أنسجة بطانة الرحم خلال المرحلة المتوسطة الصفراء من الدورة الشهرية. تم تقسيم أنسجة بطانة الرحم المضمنة في البارافين إلى شرائح بسمك 4 ميكرومتر ، وتم إجراء تلطيخ IHC للكشف عن الخلايا المناعية البطانية الرحمية ، بما في ذلك خلايا CD56 + uNK ، Foxp3 + Tregs ، الضامة CD163 + M2 ، CD1a + DCs ، وخلايا CD8 + T. تم مسح الشرائح البانورامية ضوئيا باستخدام ماسح الشرائح الرقمي ، وتم إجراء التحليل الكمي باستخدام نظام تحليل الصور الرقمية. لحساب النسبة المئوية للخلايا المناعية البطانية ، قسم عدد الخلايا المناعية على إجمالي عدد خلايا بطانة الرحم. (الشكل 1 والشكل 2). يبين الجدول 2 نسبة الخلايا المناعية البطانية المختلفة لدى النساء المصابات ب RM (N = 30).

Figure 1
الشكل 1: سير العمل التخطيطي لتحليل الخلايا المناعية بطانة الرحم في منتصف الجسم الأصفر. تم جمع العينات خلال المرحلة المتوسطة من الدورة الشهرية ، في 7-9 أيام بعد زيادة هرمون اللوتين (LH). تم التثبيت في 10٪ فورمالين مخزن محايد لمدة 4-6 ساعات في درجة حرارة الغرفة ، ثم تم تضمينه في شمع البارافين. تم إجراء تلطيخ IHC للكشف عن الخلايا المناعية في بطانة الرحم خلال المرحلة المتوسطة الصفراء ، بما في ذلك خلايا CD56 + uNK ، Foxp3 + Tregs ، CD68 + البلاعم ، الضامة CD163 + M2 ، CD1a + DCs وخلايا CD8 + T25,26. تم مسح الأنسجة باستخدام ماسح ضوئي تجاري وتم إجراء التحليل الكمي باستخدام نظام تحليل الصور المناعي للكيمياء الهيستولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التلوين المناعي لخلايا بطانة الرحم لتحديد الخلايا المناعية الموجبة. التلوين المناعي لخلايا CD56 + uNK ، Foxp3 + Tregs ، الضامة CD68 + ، الضامة CD163 + M2 ، خلايا CD1a + DCs وخلايا CD8 + T في بطانة الرحم من مرضى RM. يمثل اللون البني الخلايا المناعية الموجبة، ويمثل اللون الأزرق النواة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الأجسام المضادة الأولية استنساخ التخفيف
سي دي 56 123ج3 1/800
فوكسب 3 236 أمبير / ه7 1/100
سي دي 163 10D6 1/1200
CD1a 10 1/200
سي دي 8 4ب11 1/300

الجدول 1: الأجسام المضادة الأولية المستخدمة أثناء التلوين المناعي الكيميائي. يوضح الجدول استنساخ الأجسام المضادة الأولية وتخفيفها.

علامات المناعة المتوسط (٪) الحد الأدنى (٪) الحد الأقصى (٪) المتوسط (٪) 5 في المئة (٪) النسبة المئوية 95 (٪)
سي دي 56 4.83 1.8 16.76 6.03 2.04 13.63
فوكسب 3 0.05 0.02 0.12 0.06 0.02 0.11
سي دي 68 0.78 0.37 3.62 0.99 0.44 2.67
سي دي 163 0.84 0.35 2.38 0.93 0.38 2.13
CD1a 0.04 0.01 0.11 0.05 0.01 0.1
سي دي 8 1.69 0.76 4.1 1.85 0.81 3.72

الجدول 2: النسبة المئوية للخلايا المناعية البطانية المختلفة لدى النساء المصابات ب RM. تم حساب النسبة المئوية لخلايا CD56 + uNK ، Foxp3 + Tregs ، الضامة CD68 + ، الضامة CD163 + M2 ، خلايا CD1a + DCs و CD8 + T في مرضى RM بواسطة منصة تحليل صور الكيمياء المناعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أنشأ هذا البروتوكول منصة رقمية لتحليل صور الكيمياء المناعية لتحليل الخلايا المناعية البطانية لمرضى RM كميا. هنا ، تم الكشف عن ست علامات مناعية بطانة الرحم لتقييم البيئة الدقيقة المناعية بطانة الرحم في مرضى RM.

بطانة الرحم الاستقبالية خلال المرحلة المتوسطة الصفراء هي مفتاح نجاح الزرع والحمل27,28. لذلك ، يلعب تقييم النسبة المئوية للخلايا المناعية البطانية دورا مهما في تقدير تقبل بطانة الرحم. تحليل الخلايا المناعية البطانية الرحمية ، بالطرق المرضية التقليدية ، تنبؤي لذلك لا يساعد في التطبيق السريري. في الوقت الحاضر ، لا توجد طريقة موحدة لقياس نسبة الخلايا المناعية التي تشكل عائقا أمام فهم دور هذه الخلايا في الحمل. يعتمد تحليل IHC التقليدي على مجالات مرئية مختارة والعد اليدوي. لا يمكن تقييم تجزئة الأنسجة الدقيقة وتوطين الخلايا المناعية باستخدام IHC التقليدي لأن التحليل اليدوي شخصي يؤدي إلى تحيز المراقب29.

بالمقارنة مع تحليل توزيع الخلايا المناعية في المجال المحدد ، فإن التحليل البانورامي للأنسجة أكثر دقة لتحليل توزيع الخلايا المناعية البطانية. تم اختبار مناهج علم الأمراض الرقمية التي تستخدم خوارزميات التعلم القائمة على الآلة في أورام متعددة لتقييم مناطق الأنسجة الكبيرة والأنماط الظاهرية للخلايا المعقدة30,31. في هذه الدراسة ، تم إدخال نظام تجاري للحصول على صورة بانورامية لعينات بطانة الرحم. تم تحديد النسبة المئوية للخلايا المناعية البطانية الرحمية لاحقا باستخدام تحليل كمي آلي يعتمد على نظام تحليل صور الكيمياء المناعية.

نظام تحليل الصور في الكيمياء الهيستولوجية المناعية المستخدم هنا هو عبارة عن منصة لتحليل الصور متخصصة في الأنسجة المرضية ، والتي تمكن من تجزئة الأنسجة باستخدام الذكاء الاصطناعي. تم الإبلاغ عن العديد من الدراسات التي تستخدم وحدات مختلفة مع هذا النظام32،33،34. تم استخدام النظام لتحديد التغيرات والنتائج النسيجية المرضية المختلفة التي كان من الصعب تحليلها باستخدام برامج معالجة الصور التقليدية. على سبيل المثال ، يمثل عدد خلايا CD56 + NK حوالي 5٪ من إجمالي الخلايا في بطانة الرحم خلال المرحلة المتوسطة الصفراء. من الصعب حساب التحليل الكيميائي المناعي التقليدي بدقة عدد خلايا CD56 + NK ، وقد يستغرق الأمر 30 دقيقة على الأقل لحساب العدد الإجمالي للخلايا الإيجابية في القسم بأكمله ، ولكن الأمر يستغرق 2-3 دقائق مع النظام المستخدم هنا. لذلك ، باستخدام نظام تحليل الصور المناعية للكيمياء المناعية المستخدم هنا ، يمكن تحليل الخلايا المناعية البطانية بسهولة وبدقة. يمكن أن يساهم القياس الكمي للنتائج المرضية عن طريق تحليل الصور في تحسين الموضوعية والدقة والإقناع لتقييم البيئة المناعية لبطانة الرحم.

ومع ذلك ، هناك قيود على الطريقة الموصوفة. يتكون بطانة الرحم من خلايا مناعية مختلفة لها ارتباط بنتائج الحمل. لذلك ، قد يكون تحديد علامة أو اثنتين فقط من العلامات المناعية غير كاف. وبالتالي ، هناك حاجة إلى نهج متعددة المعلمات لتقييم التنميط المناعي للخلايا بشكل شامل.

باختصار ، يمكن الاستنتاج أن هذا البروتوكول قد طبق بنجاح تحليل الصور الرقمية في أقسام بطانة الرحم خلال المرحلة المتوسطة الصفراء لمرضى RM لتحديد كمية الخلايا المناعية وتم إجراء تحليل بانورامي في الدراسة الحالية لتحديد توزيع بطانة الرحم CD56 + uNKs و Foxp3 + Tregs و CD68 + البلاعم و CD163 + M2 البلاعم و CD1a + iDCs و CD8 +الخلايا التائية خلال المرحلة المتوسطة الصفراء. هناك حاجة إلى مزيد من الأدلة لدعم الارتباط بين الخلايا المناعية البطانية مع نتائج الحمل للمرضى الذين يعانون من RM وستركز الدراسات المستقبلية على هذا. كانت هذه أول دراسة تبحث في بيئة المناعة البطانية في مرضى RM باستخدام علم الأمراض الرقمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

المؤلفون ممتنون لجميع النساء اللواتي وافقن وتبرعن بعينات لهذه الدراسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated coverslipper Sakuraus DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163 GrowGn Biotechnology NCL-L-CD163
CD1a Gene Tech GM357129
CD56 Gene Tech GT200529
CD8 Novocastra NCL-L-CD8-4B11
Dehydrator Thermo Fisher Excelsior ES
Digital pathology and Indica labs HALO
Foxp3 YILIFANG biological 14-477-82
IHC stainer Leica BOND III
Image analysis platform Indica labs HALO
Slide Scanner Olympus life science VS200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Practice Committee of the American Society for Reproductive. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).
  2. Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. Recurrent pregnancy loss. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98 (2020).
  3. Kavvadas, D., et al. Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss. 12 (2), 177-193 (2022).
  4. Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).
  5. Du, M., et al. Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss. Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).
  6. Faas, M. M., de Vos, P. Uterine NK cells and macrophages in pregnancy. Placenta. 56, 44-52 (2017).
  7. Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).
  8. Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106 (2017).
  9. Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy. American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).
  10. Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study. Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).
  11. Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).
  12. Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF. Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).
  13. Laird, S. M., et al. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).
  14. Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review. Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).
  15. Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. The endometrial immune environment of women with endometriosis. Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).
  16. Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface. Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).
  17. Hey-Cunningham, A. J., et al. Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis. Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).
  18. Zhong, Q., et al. Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages. Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).
  19. Attems, J., et al. Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study. Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).
  20. Kovacs, G. G., et al. Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG). Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).
  21. Modis, L. V., et al. Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology. Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).
  22. Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
  23. Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2. Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).
  24. Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).
  25. Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion. Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).
  26. Diao, L., et al. New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI. Placenta. 99, 180-188 (2020).
  27. Hewitt, S. C., Korach, K. S. Cell biology. A hand to support the implantation window. Science. 331 (6019), 863-864 (2011).
  28. Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).
  29. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).
  30. Algars, A., et al. Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients. International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).
  31. Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
  32. Ascierto, M. L., et al. Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy. Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).
  33. O'Rourke, D. M., et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).
  34. Canesin, G., et al. Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).

Tags

الخلايا المناعية البطانية الرحمية ، الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، تحليل الصور الرقمية ، الإجهاض المتكرر ، المرحلة الوسطى الصفراء ، أنسجة بطانة الرحم ، خلايا CD56 + UNK ، Foxp3 + Tregs ، الضامة CD163 + M2 ، CD1a + DCs ، الخلايا التائية CD8 + ، التحليل الكمي ، نظام تحليل الصور التجارية ، مرضى الفشل التناسلي
منصة للكشف الكمي عن الخلايا المناعية البطانية على أساس الكيمياء المناعية وتحليل الصور الرقمية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C., Huang, C., Wu, Y., Li, Z., … More

Chen, C., Huang, C., Wu, Y., Li, Z., Yu, S., Chen, X., Lian, R., Lin, R., Diao, L., Zeng, Y., Li, Y. Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. J. Vis. Exp. (200), e65643, doi:10.3791/65643 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter