Summary
Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et la culture des cellules ciliées cochléaires primaires de souris. Initialement, l’organe de Corti a été disséqué à partir de cochlées murines néonatales (âgées de 3 à 5 jours) au microscope. Par la suite, les cellules ont été digérées enzymatiquement dans une suspension unicellulaire et identifiées par immunofluorescence après plusieurs jours de culture.
Abstract
Les cellules ciliées cochléaires sont les récepteurs sensoriels du système auditif. Ces cellules sont situées dans l’organe de Corti, l’organe sensoriel responsable de l’audition, dans le labyrinthe osseux de l’oreille interne. Les cellules ciliées cochléaires se composent de deux types anatomiquement et fonctionnellement distincts : les cellules ciliées externes et internes. Les dommages causés à l’un ou l’autre d’entre eux entraînent une perte auditive. Notamment, car les cellules ciliées internes ne peuvent pas se régénérer et les dommages qui leur sont causés sont permanents. Par conséquent, la culture in vitro de cellules ciliées primaires est indispensable pour étudier les effets protecteurs ou régénérateurs des cellules ciliées cochléaires. Cette étude visait à découvrir une méthode d’isolement et de culture des cellules ciliées de souris.
Après l’ablation manuelle de la paroi latérale cochléaire, l’épithélium auditif a été méticuleusement disséqué du modiolus cochléaire au microscope, incubé dans un mélange composé de 0,25 % de trypsine-EDTA pendant 10 min à 37 °C, et délicatement suspendu dans un milieu de culture à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL. La suspension cellulaire a été passée à travers un filtre cellulaire, le filtrat a été centrifugé et les cellules ont été cultivées dans des plaques à 24 puits. Les cellules ciliées ont été identifiées en fonction de leur capacité à exprimer un complexe de mécanotransduction, la myosine-VIIa, qui est impliquée dans les tensions motrices, et par marquage sélectif de la F-actine à l’aide de la phalloïdine. Les cellules ont atteint >90% de confluence après 4 jours de culture. Cette méthode peut améliorer notre compréhension des caractéristiques biologiques des cellules ciliées cultivées in vitro et démontrer l’efficacité des cultures de cellules ciliées cochléaires, établissant ainsi une base méthodologique solide pour la recherche auditive ultérieure.
Introduction
Les cellules ciliées cochléaires jouent un rôle important dans la détection des sons et la transmission du signal au nerf auditif. Les cellules ciliées sont des cellules mécanistes qui fonctionnent comme des récepteurs sensoriels primaires et convertissent les vibrations sonores en signaux électriques chez les vertébrés. L’épithélium sensoriel de l’oreille interne des mammifères comprend une seule rangée de cellules ciliées internes et trois rangées de cellules ciliées externes. Dans différentes zones membranaires de base, les cellules ciliées perçoivent des sons à différentes fréquences (entre 20 et 2 000 Hz)1. La fonction des cellules ciliées externes est un processus d’amplification mécanique actif qui aide à affiner l’oreille interne des mammifères, conférant une grande sensibilité au son. Les cellules ciliées internes sont responsables de la détection des sons. Après une dépolarisation graduée, l’information acoustique est transmise au cerveau par les fibres nerveuses auditives2.
La perte auditive peut être causée par des défauts génétiques, le vieillissement, les traumatismes sonores ou l’utilisation excessive de médicaments ototoxiques, qui constituent un problème de santé majeur dans le monde entier 3,4. La perte auditive résulte principalement de dommages irréversibles aux cellules ciliées5. En ce qui concerne la perte auditive induite par le bruit, bien que les chercheurs soient parvenus à un consensus sur plusieurs détails de son étiologie, une compréhension globale des nombreux mécanismes sous-jacents fait défaut. Les cellules ciliées externes sont particulièrement vulnérables à la surexposition acoustique6. Les cellules ciliées cochléaires mécanosensibles sont impliquées dans la perte auditive liée à l’âge ; Cependant, les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à la dégénérescence des cellules ciliées restent inconnus. Plusieurs changements dans les processus moléculaires conduisent au vieillissement des cellules ciliées, au stress oxydatif, à la réponse aux dommages de l’ADN, à l’autophagie et à la dérégulation de l’expression et de la transcription des gènes liés à la spécialisation des cellules ciliées7.
Comme l’oreille interne est enfermée dans l’os temporal, profondément dans l’os le plus dur du corps, elle est expérimentalement inaccessible, ce qui pose un défi aux recherches sur les mécanismes de réparation et de régénération des cellules ciliées. Par conséquent, l’établissement de cultures in vitro pour étudier la fonction des cellules ciliées est devenu une méthode idéale pour la recherche sur les mécanismes de régénération et de lésion de l’oreille interne. Les procédures de préparation des cultures organotypiques cochléaires ont été décrites dans des études antérieures 8,9,10. Les chercheurs du monde entier ont utilisé diverses techniques de microdissection cochléaire et de préparation de surface. Malgré les défis persistants, divers systèmes de culture de cellules ciliées primaires ont été établis avec succès in vitro. Les cultures d’organes cochléaires contiennent divers types de cellules, notamment des cellules ciliées, des cellules de Deiters, des cellules de Hensen, des cellules piliers et des fibres nerveuses auditives. Une compréhension approfondie des changements dans les cellules ciliées aux niveaux cellulaire et moléculaire après une blessure permettra de développer des outils de recherche plus puissants. Cette étude visait à démontrer les étapes permettant d’isoler les organes cochléaires de souris néonatales et de détacher enzymatiquement les cellules ciliées abondantes pour des études in vitro. La nature des cellules cultivées a été confirmée par coloration par immunofluorescence.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées (n° 2021-847) par le Comité sur l’utilisation et le soin des animaux de l’Université Jiaotong de Xi’an.
1. Stérilisation et préparation du matériel
- Stérilisez les outils de dissection à l’aide d’une désinfection à la vapeur à haute température et à haute pression et séchez-les dans un incubateur à 50 °C pendant la nuit.
- Préparer à l’avance 100 mL du milieu de culture contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 10 mg/mL de pénicilline/streptomycine (ajouter 10 mL de FBS et 10 μL de solution mère de pénicilline à 90 mL de milieu Eagle modifié (EMEM) de Dulbecco) et conserver à 4 °C.
2. Dissection et ablation de l’os temporal pour le prélèvement d’épithéliums auditifs
- Euthanasier un nombre total de 10 souris nouveau-nées (âgées entre P3 et P5) par décapitation sur glace. Utiliser une autre méthodologie approuvée par l’éthique, si nécessaire.
- Maintenez la tête en place, ouvrez le cuir chevelu le long de la suture sagittale à l’aide de ciseaux micro-opératoires, et séparez et fixez le cuir chevelu bilatéralement avec les doigts, comme indiqué à la figure 1A.
- Retirez le cerveau à l’aide d’un petit élévateur périosté et coupez le crâne basal en deux. Coupez le crâne avec des ciseaux et retournez-le vers l’avant pour ouvrir le crâne ; Utilisez la pointe des ciseaux pour gratter le cerveau et exposer la base du crâne.
- Observez les os temporaux bilatéraux à la base du crâne (Figure 1C). À l’aide de ciseaux, coupez la base du crâne le long de la ligne médiane, grattez la peau et retirez tout os inutile (Figure 1D,D').
- Conserver et transférer les os temporaux dans des boîtes de Pétri stériles de 35 mm contenant une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) fraîche (Figure 1E).
- Utilisez deux pinces à pointes #5 pour retirer la bulle et les tissus environnants de la partie pétreuse de l’os temporal (Figure 1E).
REMARQUE : À ce stade, le labyrinthe osseux dans l’os temporal des souris ne serait pas complètement calcifié et serait facilement disséqué à l’aide de pinces. - Tenez la pince d’une main pour fixer la partie semi-circulaire de l’os temporal et collez le pied inférieur de la pince dans la niche ronde de la fenêtre avec l’autre main pour séparer l’os latéral de la cochlée du vestibule de la sscale. Retirez délicatement la partie pétreuse de l’os temporal sans toucher l’épithélium OC. Par la suite, séparez et retirez soigneusement le labyrinthe osseux de la cochlée de l’extrémité basale à l’extrémité apicale (Figure 1F).
- Micro-isoler soigneusement l’organe de l’épithélium sensoriel Corti du modiolus à l’aide d’une pince à pointes #5 (Figure 1G).
- Tenir le ligament spiralé, le séparer soigneusement de la strie vasculaire à l’aide d’une pince microopératoire et transférer l’épithélium auditif propre dans une boîte de culture stérile de 3 mm contenant du HBSS à l’aide d’une pipette de 200 μL (Figure 1H).
- Prélever 20 échantillons de chaque animal et les transférer rapidement dans une boîte de Pétri stérile de 100 mm contenant de l’HBSS pour l’étape de préparation suivante (figure 1).
3. Désagrégation enzymatique pour l’obtention de cellules ciliées auditives
- Transférer l’épithélium auditif dans 10 mL de DMEM frais contenant 0,25 % de trypsine et incuber à 37 °C pendant 12 min.
- À l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, séparez délicatement les cellules ciliées de la lame basale et des autres cellules sous un microscope opératoire.
- Ajouter 10 mL de milieu de culture pour inhiber la désagrégation.
- Filtrer les cellules en suspension dans le milieu de culture à travers un filtre de 70 μm, recueillir le filtrat dans un tube propre de 50 ml et le centrifuger à 300 × g pendant 5 min.
- Remettre les cellules ciliées en suspension dans au moins 5 mL de milieu de culture en les pipetant doucement de haut en bas à l’aide d’un embout de pipette de 1 000 μL. Évitez d’introduire des bulles.
- Placez une lamelle au fond d’une plaque à six puits à l’avance. Comptez les cellules et cultivez-les à une densité de 10 à 6 cellules/mL dans des plaquesà six puits.
- Cultiver les cellules adhérentes dans 2 mL de DMEM (contenant 10 % de FBS, 100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) à 37 °C et 5 % de CO2. Changez le milieu de culture tous les jours.
REMARQUE : Il convient de mentionner que l’utilisation de ce protocole n’entraîne pas l’obtention de cellules ciliées pures. Sur la base de cette méthode de culture cellulaire primaire, nous recommandons d’utiliser des cellules d2 ou d3 pour d’autres études, car les cellules ciliées peuvent constituer environ 70 % des cellules en culture et être en bon état.
4. Coloration immunofluorescente
- Prélever les cellules cultivées de j1 à j6 (un puits par jour). Aspirer le milieu de culture et rincer les cellules 2 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 15 min à température ambiante (RT).
- Retirez le fixateur et rincez les cellules pendant 3 x 3 min avec du PBS.
- Perméabiliser les cellules avec du PBS contenant 0,2 % de Triton X-100 pendant 10 min à RT.
- Incuber les cellules perméabilisées avec une solution bloquante composée de 10 % de FBS dans du PBS pendant 20 min à RT.
- Colorer les cellules avec un anticorps monoclonal anti-myosine (dilué à 1 :200 dans du PBS) à 4 °C pendant la nuit.
- Lavez les cellules 3 fois avec du PBS stérile et incubez-les avec un anticorps secondaire (Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapin MYO7A, dilué 1 :500 dans du PBS) et de la phalloïdine marquée à la fluorescéine (Alexa Fluor 488, pour identifier la structure cellulaire) pendant 2 h à RT.
- Rincez les cellules 3 fois avec du PBS pour éliminer les anticorps secondaires.
- Ajoutez 1 à 2 gouttes de support de montage avec DAPI sur les lames, montez les lamelles et placez-les sous un microscope confocal à balayage laser pour capturer des photos des cellules.
5. Analyse statistique
- Effectuer une analyse de variance bidirectionnelle (ANOVA) suivie de tests post-hoc de Tukey pour analyser les changements dans les valeurs grises de la myosine-VIIa et de la phalloïdine au fil du temps. Utilisez la méthode de marquage des lettres pour marquer les différences statistiques.
- Effectuer d’autres ANOVA à un facteur suivies des tests post-hoc de Tukey pour comparer le rapport cellulaire positif à la phalloïdine entre les échantillons cellulaires du jour 1 au jour 6 et le rapport cellulaire myosine-VII positif les mêmes jours.
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Representative Results
En suivant ce protocole, nous avons ensemencé les cellules isolées. Les graines primaires de cellules ciliées cochléaires ont été considérées comme réussies si les cellules ne flottaient pas dans le milieu de culture et ne se propageaient pas dans les 24 heures. Nous avons déterminé le nombre de cellules ciliées après qu’elles aient adhéré et se soient répandues en agrégats plats au fond de la boîte. Après 1 jour, les cellules ciliées vivantes ont été étroitement collées au fond de la boîte de culture et les cellules non adhérentes ont été éliminées par rinçage avec du PBS. Typiquement, le nombre de cellules a doublé après 3 jours de culture (Figure 2).
L’immunofluorescence (FI) a révélé l’expression de la myosine-VIIa et de la phalloïdine jusqu’à j6 (Figure 3A). Nous avons observé que la valeur grise de la myosine-VIIa et le rapport cellulaire positif diminuaient avec le temps, tandis que la valeur grise de la phalloïdine et le rapport cellulaire positif restaient les mêmes par rapport à ceux à d1 après culture (Figure 3B-D). Nous avons utilisé une culture organique comme témoin positif pour vérifier que les cellules myosine-VIIa-positives étaient bien des cellules ciliées. La figure supplémentaire S1 montre la coloration par immunofluorescence de la myosine-VIIa (vert), de la phalloïdine (vert) et du 4′6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, bleu) dans l’épithélium auditif après 2 jours de culture.
À l’aide de l’IF, nous avons confirmé que les cellules obtenues étaient des cellules ciliées. En particulier, nous avons observé que la plupart des cellules cultivées présentaient une coloration positive de la protéine myosine-VIIa (rouge) marqueur des cellules auditives, présentant également un aspect allongé au microscope à fluorescence (Figure 3A). Ces résultats suggèrent que les cellules cultivées étaient principalement des cellules ciliées.
Figure 1 : Dissection et ablation de l’os temporal pour le prélèvement d’épithéliums auditifs. (A) Décapitation et ouverture du crâne le long de la suture sagittale ; (B) l’ablation du cerveau. (C) Vue des os temporaux bilatéraux situés à la base du crâne. Les os temporaux droits (D) après l’ablation des os et des tissus entourant l’os temporal (D') marqués d’OC et de PSD. (E) Transfert des os temporaux dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) fraîche, retirer l’étrier et placer avec la fenêtre ovale vers le haut. (F) Séparez et retirez soigneusement le labyrinthe osseux de la cochlée de la base à l’extrémité apicale. L’organe de l’épithélium sensoriel Corti (G) a adhéré à la strie vasculaire (H) séparée de la strie vasculaire. Barres d’échelle = 1 000 μm (C-H). Abréviations : OC = organe de Corti ; PSD = canal semi-circulaire postérieur ; SV = strie vasculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Cellules ciliées 4 jours après la culture. Examen microscopique optique 4 jours après la culture. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Détection des marqueurs de surface des cellules ciliées par immunofluorescence. (A) Coloration par immunofluorescence de la myosine-VIIa (rouge), de la phalloïdine (vert) et du DAPI (bleu) du jour 1 au jour 6 après culture cellulaire. (B, C) Analyse de la valeur grise de la myosine-VIIa et de la phalloïdine ; Les différences statistiques sont indiquées par des lettres. (D) Comparaison du rapport cellulaire positif à la phalloïdine entre les échantillons de cellules du jour 1 au jour 6 et de la myosine-VII les mêmes jours. Les lettres majuscules représentent les résultats statistiques pour la phalloïdine, tandis que les lettres minuscules représentent les résultats statistiques pour la myosine-VIIa. Les données sont présentées sous la forme de la moyenne ± de l’erreur-type de la moyenne. N = 5 ; Barre d’échelle = 50 μm. Une analyse de variance bidirectionnelle (ANOVA) suivie d’un test post-hoc de Tukey a été effectuée pour l’analyse de la valeur grise de la myosine-VIIa et de la phalloïdine. Une ANOVA à un facteur a été réalisée pour comparer le rapport de la phalloïdine et de la myosine-VII positive entre les échantillons cellulaires de d 1 à d 6. Différentes lettres indiquent des différences statistiques dans la coloration de la phalloïdine, tandis que les lettres minuscules indiquent des différences statistiques dans la coloration de la myosine-VIIa. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Détection par immunofluorescence des marqueurs de surface des cellules ciliées en culture organique. La coloration par immunofluorescence de la myosine-VIIa (vert), de la phalloïdine (vert) et du DAPI (bleu) a été réalisée sur d 2 de culture biologique. Barre d’échelle = 10 μm. Abréviations : IHC, cellule ciliée interne ; OHC, cellule ciliée externe ; DAPI, 4′,6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Détection par immunofluorescence de marqueurs de surface dans les cellules ciliées en passage. (A) La coloration par immunofluorescence de la myosine-VIIa (rouge), de la phalloïdine (vert) et du DAPI (bleu) a été réalisée sur des cultures organiques aux passages 2 et 3. (B) Comparaison du nombre de cellules positives pour la phalloïdine, de cellules positives pour la myosine VIIa et de cellules totales depuis les cellules primaires jusqu’au passage 3. N = 3 ; Barre d’échelle = 100 μm. Les données sont présentées sous la forme de la moyenne ±écart-type. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Par rapport à la lignée cellulaire HEI-OC1, les cultures primaires de cellules ciliées ont reproduit plus précisément l’état physiologique des cellules in vivo. Par conséquent, la méthode de culture primaire auditive établie en isolant des cellules vivantes des organes cochléaires et en les cultivant immédiatement semble être un outil précieux pour des recherches approfondies sur les systèmes auditifs. Certaines techniques sont cruciales pour une culture réussie. Tout d’abord, la minimisation de la durée de séparation de l’organe de Corti de l’os temporal augmente la probabilité d’une activité soutenue des cellules ciliées. Par conséquent, il est impératif pour les chercheurs de minimiser l’intervalle de temps entre la dissection et l’immersion des organes dans le PBS. D’après nos observations expérimentales, une durée d’environ 2 à 3 h suffit pour disséquer 10 souris et obtenir les 20 oreilles internes à la fois. Pendant le processus de désagrégation enzymatique, il est conseillé de limiter la durée à 12 min et de transférer les organes cochléaires sur des pipettes après une période d’incubation de 8 min. Les organes ont été observés au microscope après environ 10 cycles de pipetage, et la désagrégation enzymatique a été arrêtée lorsque presque toutes les cellules se sont détachées de la membrane basilaire. Dans le cas contraire, les organes ont été renvoyés dans l’incubateur pendant 4 minutes supplémentaires. Le choix de l’antibiotique est également important. Nous recommandons d’utiliser 10 mg/mL de pénicilline/streptomycine pour prévenir les problèmes de contamination potentiels, car certains antibiotiques aminoglycosides peuvent être ototoxiques et entraîner la mort des cellules ciliées.
Bien que les myosines de classe VII soient largement exprimées dans les tissus animaux, la myosine-VIIa n’est exprimée que dans les cellules ciliées des organes vestibulaires et cochléaires de l’oreille interne seules. Les myosines de classe VIIa jouent un rôle important dans le maintien de la structure des stéréocils, car elles aident à interconnecter les stéréocils au niveau de la région de liaison de la cheville dans les cellules ciliées11. Suite à une augmentation de la durée de la culture cellulaire primaire et du nombre de passages cellulaires, la dégradation de la myosine-VIIa a également augmenté avec le temps, tandis que la phalloïdine est restée stable, indiquant que la fonction des cellules auditives diminuait avec le temps. La principale limite de ce protocole est que les cellules auditives ne peuvent être utilisées que dans les 6 à 7 jours et mettent plus de temps à se développer que les cellules HEI-OC112. De plus, il est inévitable que les cellules primaires finissent par sénesquer et mourir, présentant un potentiel de croissance limité. De plus, les coûts en temps et en argent de l’isolement et de la culture des cellules ciliées sont souvent élevés et nécessitent une expertise approfondie. L’organe de Corti contient une variété de cellules neurosensorielles, y compris les cheveux internes, les cheveux externes et les cellules de soutien. Ce protocole a introduit une méthode de séparation et de culture de ces cellules in vitro. Les cellules primaires peuvent être distinguées entre les cheveux et les cellules de soutien par coloration de la myosine-VIIa et de Sox2, respectivement13,14. Les cellules ciliées externes et internes remplissent des fonctions différentes. Les cellules ciliées externes modifient rapidement leur longueur et leur rigidité en réponse aux changements de potentiel membranaire et sont transformées en cellules ciliées internes. La prestine est une protéine motrice des cellules ciliées externes, tandis que Slc17a8 (vGlut3) est spécifiquement exprimée dans les IHC et peut être utilisée pour distinguer les cellules ciliées internes in vitro15,16,17,18.
Par rapport aux cultures organiques, la morphologie des cellules ciliées change considérablement dans les cultures primaires de cellules ciliées, ce qui entraîne des morphologies et des fonctions de mécanotransduction différentes. Les cultures organiques sont des cultures cellulaires primaires tridimensionnelles qui présentent des motifs cellulaires stéréotypés, une polarité, la formation de faisceaux de cheveux et des connexions neuronales dans les organes de Corti. En revanche, les cellules primaires HEI-OC1 ont une forme polygonale typique et se développent à plat grâce à l’adhérence statique dans un environnement de culture bidimensionnel19. Les cultures organiques et les cellules primaires sont directement isolées des tissus et présentent une morphologie cellulaire normale et d’importants marqueurs liés à la fonction. Cependant, contrairement aux cellules HEI-OC1, qui sont généralement très prolifératives, plus faciles à cultiver et à transfecter, et qui peuvent être maintenues pendant des décennies, ces cellules ont une durée de vie limitée et une capacité d’expansion limitée.
Les cellules primaires présentent de nombreux avantages en culture cellulaire. Comme les cellules primaires sont obtenues à partir de tissus corporels et cultivées dans des conditions de croissance optimales, elles imitent étroitement l’environnement tissulaire in vivo . L’utilisation de cellules primaires permet d’éviter de nombreuses objections éthiques soulevées au sujet de l’expérimentation animale et fournit des résultats plus pertinents que les lignées cellulaires. Les cellules primaires présélectionnées sont des modèles adéquats qui représentent fidèlement la signalisation moléculaire in vivo. Les cellules de différents donneurs réagissent différemment aux cytokines pro-inflammatoires. Les coûts de l’isolement et de la culture sont souvent élevés, bien qu’ils soient moins coûteux que ceux des modèles animaux. Les matériaux et les animaux utilisés dans la culture primaire de cellules ciliées décrite ici étaient simples, leur coût était relativement faible et le système était facile à utiliser. Si les conditions optimales de culture ne sont pas maintenues, les caractéristiques des cellules primaires peuvent changer avec les passages suivants. Au fur et à mesure que le nombre de passages augmentait, l’état cellulaire s’affaiblissait également (figure supplémentaire S2). Comme elles étaient dérivées directement des tissus corporels natifs sans modification, les cellules ciliées auditives obtenues imitaient étroitement leur état in vivo et leur physiologie. Par conséquent, les cellules ciliées primaires constituent un excellent système modèle pour étudier la physiologie et la biochimie des cellules ciliées, y compris le métabolisme cellulaire et la toxicité des médicaments. Bien que les cellules primaires ne puissent être maintenues que quelques jours in vitro, elles peuvent être immortalisées et divisées indéfiniment suite à une transformation génétique pour obtenir des lignées cellulaires secondaires.
En conclusion, le protocole actuel décrit l’isolement des cellules ciliées auditives de l’os temporal par microdissection et désagrégation enzymatique. L’ensemble du protocole a pris environ 3 h, de la dissection de la souris au placage cellulaire. Les cellules cultivées ont été maintenues à une grande pureté et sont restées en bonne santé pendant 6 à 7 jours. Malgré les limites inhérentes aux cultures primaires de cellules ciliées, qui sont limitées à seulement deux passages, ce protocole a utilisé des méthodologies et des matériaux simples, offrant ainsi une nouvelle voie pour mener des recherches très efficaces sur les cellules ciliées cochléaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NFSC 82101224 à YG)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
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