Summary
ここでは、マウスから初代蝸牛有毛細胞を単離して培養するための詳細なプロトコルを紹介します。最初に、コルチの器官は、顕微鏡下で新生児(3〜5日齢)のマウス蝸牛から解剖されました。その後、細胞を酵素的に消化して単一細胞懸濁液とし、数日間培養した後に免疫蛍光法を用いて同定しました。
Abstract
蝸牛有毛細胞は、聴覚系の感覚受容器です。これらの細胞は、内耳の骨迷路内の聴覚を司る感覚器官であるコルチの器官にあります。蝸牛有毛細胞は、解剖学的にも機能的にも異なる2つのタイプ、すなわち外有毛細胞と内有毛細胞で構成されています。どちらかが損傷すると、難聴になります。特に、内有毛細胞は再生できず、損傷は永久的です。したがって、初代有毛細胞の in vitro 培養は、蝸牛有毛細胞の保護効果または再生効果を調べるために不可欠です。本研究は、マウス有毛細胞の単離・培養方法の発見を目的としています。
蝸牛側壁を手作業で除去した後、顕微鏡下で蝸牛モディオルスから聴覚上皮を細心の注意を払って解剖し、0.25%トリプシン-EDTAからなる混合物中で37°Cで10分間インキュベートし、200μLのピペットチップを使用して培地に静かに懸濁した。細胞懸濁液を細胞フィルターに通し、濾液を遠心分離し、細胞を24ウェルプレートで培養した。有毛細胞は、運動緊張に関与するメカノトランスダクション複合体であるミオシン-VIIaを発現する能力と、ファロイジンを用いたF-アクチンの選択的標識に基づいて同定されました。細胞は、培養で4d後に>90%のコンフルエントに達しました。この方法は、in vitro培養有毛細胞の生物学的特性の理解を深め、蝸牛有毛細胞培養の効率を実証し、さらなる聴覚研究のための確固たる方法論的基盤を確立することができます。
Introduction
蝸牛有毛細胞は、音の検出と聴覚神経への信号伝達に重要な役割を果たします。有毛細胞は、脊椎動物の一次感覚受容器として機能し、音の振動を電気信号に変換する機構的な細胞です。哺乳類の内耳の感覚上皮は、1列の内有毛細胞と3列の外有毛細胞で構成されています。有毛細胞は、さまざまな基本膜領域で、異なる周波数(20〜2,000Hz)の音を知覚します1。外有毛細胞の機能は、哺乳類の内耳を微調整するのに役立つ活発な機械的増幅プロセスであり、音に対する高い感度を与えます。内有毛細胞は音を検出する役割を担っています。段階的な脱分極の後、音響情報は聴覚神経線維2を介して脳に伝達される。
難聴は、遺伝的欠陥、加齢、騒音トラウマ、または耳毒性薬の過剰使用によって引き起こされる可能性があり、これらは世界中で主要な健康上の懸念を構成しています3,4。難聴は、主に有毛細胞への不可逆的な損傷に起因します5.騒音性難聴に関しては、研究者はその病因のいくつかの詳細についてコンセンサスに達していますが、多くの根本的なメカニズムの包括的な理解が欠けています。外側の有毛細胞は、音響の過露出に対して特に脆弱です6。機械感受性蝸牛有毛細胞は加齢性難聴に関与しています。しかし、有毛細胞の変性の根底にある分子的および細胞的メカニズムは不明のままです。分子プロセスにおけるいくつかの変化は、有毛細胞の老化、酸化ストレス、DNA損傷応答、オートファジー、および有毛細胞の特殊化に関連する遺伝子の発現と転写の調節不全につながります7。
内耳は側頭骨に包まれているため、体の最も硬い骨の奥深くにあるため、実験的にはアクセスできず、有毛細胞の修復と再生のメカニズムの研究に課題を投げかけています。したがって、有毛細胞の機能を調べるためのin vitro培養を確立することは、内耳の再生と損傷のメカニズムを研究するための理想的な方法となっています。蝸牛器官型培養を調製する手順は、以前の研究で説明されています8,9,10。世界中の研究者は、さまざまな蝸牛の顕微解剖および表面調製技術を採用しています。根強い課題にもかかわらず、さまざまな初代有毛細胞培養システムがin vitroで成功裏に確立されています。蝸牛器官の培養には、有毛細胞、ダイター細胞、ヘンセン細胞、柱細胞、聴覚神経線維など、さまざまな種類の細胞が含まれています。受傷後の有毛細胞の変化を細胞レベルや分子レベルで深く理解することで、より強力な研究ツールの開発が可能になります。この研究は、新生児マウスから蝸牛器官を分離し、豊富な有毛細胞を酵素的に剥離してin vitro研究を行う手順を実証することを目的としていました。培養細胞の性質は、免疫蛍光染色を用いて確認した。
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Protocol
すべての動物実験は、西安交通大学動物の使用と管理に関する委員会によって承認されました(No.2021-847)。
1.滅菌と材料の準備
- 解剖器具を高温高圧蒸気消毒で滅菌し、50°Cのインキュベーターで一晩乾燥させます。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン/ストレプトマイシン10 mg/mLを含む培地100 mLを事前に調製し(10 mLのFBSと10 μLのペニシリン原液をダルベッコ修正イーグル培地(EMEM)90 mLに加える)し、4°Cで保存します。
2.聴覚上皮採取のための側頭骨の解剖と除去
- 合計10匹の新生児マウス(P3からP5)を氷上で首を切って安楽死させる。必要に応じて、倫理的に承認された別の方法論を使用します。
- 図1Aに示すように、頭を所定の位置に保持し、マイクロ操作ハサミを使用して矢状縫合糸に沿って頭皮を開き、指で頭皮を両側に分離して固定します。
- 小さな骨膜エレベーターを使用して脳を取り除き、基底頭蓋骨を二等分します。はさみで頭蓋骨を切り、前方にひっくり返して頭蓋骨を開きます。ハサミの先で脳を削り、頭蓋骨の付け根を露出させます。
- 頭蓋骨の基部にある両側側頭骨を観察します(図1C)。ハサミを使用して頭蓋骨の基部を正中線に沿って切り、皮膚をこすり落とし、不要な骨を取り除きます(図1D、D')。
- 側頭骨を保持し、新鮮なハンク平衡塩溶液(HBSS)を含む35mmの滅菌ペトリ皿に移します(図1E)。
- 2つの#5尖った鉗子を使用して、側頭骨の錐体部分から水疱と周囲の組織を取り除きます(図1E)。
注:この段階では、マウスの側頭骨の骨迷路は完全に石灰化しておらず、鉗子を使用して簡単に解剖できます。 - 片手で鉗子を持って側頭骨の半円形部分を固定し、もう一方の手で鉗子の下部を丸い窓のニッチに突き刺して、蝸牛の外側骨をスカラ前庭から分離します。OC上皮に触れずに側頭骨の錐体部分を慎重に取り除きます。続いて、蝸牛の骨迷路を基底端から頂端まで慎重に分離して除去します(図1F)。
- #5尖った鉗子を使用して、コルチ感覚上皮の器官をモディオルスから慎重にマイクロ分離します(図1G)。
- らせん靭帯を保持し、微小手術鉗子で脈理血管から慎重に分離し、200 μLのピペットを使用して、清潔な聴覚上皮をHBSSを含む3 mmの滅菌培養皿に移します(図1H)。
- 各動物から20個の検体を採取し、次の調製ステップのためにHBSSを含む100 mm滅菌シャーレにすばやく移します(図1)。
3. 聴覚有毛細胞を得るための酵素解離
- 0.25%トリプシンを含む10 mLの新鮮DMEMに聴覚上皮を移し、37°Cで12分間インキュベートします。
- 200 μLのピペットチップを使用して、手術顕微鏡下で有毛細胞を基底層および他の細胞から静かに分離します。
- さらに10 mLの培地を加えて、凝集を阻害します。
- 培地中の懸濁細胞を70μmフィルターでろ過し、濾液を清潔な50mLチューブに回収し、300× g で5分間遠心分離します。
- 有毛細胞を少なくとも5 mLの培養培地に再懸濁し、1,000 μLのピペットチップを使用してゆっくりと上下にピペッティングします。気泡の発生は避けてください。
- あらかじめ6ウェルプレートの底にカバーガラスを置きます。細胞をカウントし、6ウェルプレートで106 細胞/mLの密度で培養します。
- 接着細胞を2 mLのDMEM(FBS10%、ペニシリン100ユニット/mL、ストレプトマイシン100 μg/mLを含む)で37°Cおよび5%CO2で増殖させます。培地は毎日交換してください。
注:このプロトコルを使用しても、純粋な有毛細胞は得られないことに注意してください。この初代細胞培養法に基づくと、有毛細胞が培養細胞の約70%を占め、良好な状態にある可能性があるため、さらなる研究にはd2またはd3細胞を使用することをお勧めします。
4. 免疫蛍光染色
- 培養細胞をd1からd6まで(1日1ウェル)収穫します。培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2回すすぎます。
- 細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温(RT)で15分間固定します。
- 固定液を取り除き、PBSで3 x 3分間細胞をすすぎます。
- 0.2% Triton X-100 を含む PBS で細胞を室温で 10 分間透過処理します。
- 透過処理した細胞を、PBS中の10%FBSからなるブロッキング溶液と室温で20分間インキュベートします。
- 抗ミオシンモノクローナル抗体(PBSで1:200に希釈)で4°Cで一晩細胞を染色します。
- 細胞を滅菌PBSで3回洗浄し、二次抗体(Alexa Fluor 594ヤギ抗ウサギMYO7A、PBSで1:500希釈)およびフルオレセイン標識ファロイジン(Alexa Fluor 488、細胞構造を同定)とともに室温で2時間インキュベートします。
- 細胞をPBSで3回すすぎ、二次抗体を除去します。
- DAPIを含む封入剤を1〜2滴スライドに加え、カバーガラスをマウントし、レーザー走査型共焦点顕微鏡の下に置いて細胞の写真を撮ります。
5. 統計解析
- 二元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くテューキーの事後検定を実行して、ミオシン-VIIaとファロイジンの灰色値の経時的な変化を分析します。文字マーキング方法を使用して、統計的な差異をマークします。
- 追加の一元配置分散分析を実行し、続いてテューキーの事後検定を実行して、1日目から6日目までの細胞サンプル間のファロイジン陽性細胞比と、同じ日のミオシン-VII陽性細胞比を比較します。
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Representative Results
このプロトコルに続いて、単離された細胞に播種しました。初代蝸牛有毛細胞の種子は、細胞が培地中に浮遊せず、24時間以内に拡散した場合に成功したと見なされました。有毛細胞が付着し、皿の底で平らな凝集体に広がった後の有毛細胞の数を決定しました。1日後、生きた有毛細胞を培養皿の底にしっかりと接着させ、PBSでリンスすることにより非接着細胞を除去した。通常、細胞数は3d培養後に2倍になります(図2)。
免疫蛍光法(IF)により、ミオシン-VIIaおよびファロイジンの発現がd6まで明らかになりました(図3A)。その結果、ミオシン-VIIaのグレー値と陽性細胞比は時間とともに減少するのに対し、ファロイジンのグレー値と陽性細胞比は培養後のd1のものと比較して変わらないことが観察されました(図3B-D)。有機培養をポジティブコントロールとして使用し、ミオシン-VIIa陽性細胞が実際に有毛細胞であることを確認しました。補足図S1は、2日間の培養後の聴覚上皮におけるミオシン-VIIa(緑)、ファロイジン(緑)、および4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、青)の免疫蛍光染色を示しています。
IFを用いて、得られた細胞が有毛細胞であることを確認しました。特に、ほとんどの培養細胞は、聴覚細胞マーカーであるミオシン-VIIa(赤)タンパク質の陽性染色を示し、蛍光顕微鏡下でも細長い外観を示すことが観察されました(図3A)。これらの結果から、培養細胞は有毛細胞が中心であることが示唆された。
図1:聴覚上皮採取のための側頭骨の解剖と除去。 (A)矢状縫合糸に沿って頭蓋骨を斬首して開く。(B)脳を切除する。(C)頭蓋底に位置する両側側頭骨の図。側頭骨(D')を取り囲む骨と亀裂を除去した後の右側頭骨(D)は、OCとPSDでマークされています。(E)側頭骨を新鮮なハンク平衡塩溶液(HBSS)に移し、茎を取り除き、楕円形の窓側を上にして置きます。(F)蝸牛の骨迷路を基底から頂端まで慎重に分離して取り除きます。コルチ感覚上皮(G)の器官は線条血管に付着し、(H)は脈理血管から分離した。スケールバー = 1,000 μm (C-H)。略語:OC =コルチの器官。PSD =後部半規管;SV =線条血管。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:培養4日後の有毛細胞。 培養4日後の光学顕微鏡検査。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:免疫蛍光法を用いた有毛細胞表面マーカーの検出 。 (A)細胞培養後1日目から6日目までのミオシン-VIIa(赤)、ファロイジン(緑)、およびDAPI(青)免疫蛍光染色。(B、C)ミオシン-VIIaおよびファロイジンのグレーバリュー分析;統計的な違いは文字で示されます。(D)1日目から6日目までの細胞サンプルと同日のミオシンVIIのファロイジン陽性細胞比の比較。大文字はファロイジンの統計結果を表し、小文字はミオシン-VIIaの統計結果を表します。データは、平均の平均±平均の標準誤差として表されます。N = 5です。スケールバー = 50 μm。ミオシン-VIIaおよびファロイジンのグレー値分析について、2元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くテューキーの事後検定を実施しました。d 1 から d 6 までの細胞サンプル間のファロイジンとミオシン-VII 陽性細胞比を比較するために、一元配置 ANOVA を実施しました。異なる文字はファロイジン染色の統計的差を示し、小文字はミオシン-VIIa染色の統計的差を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図S1:有機培養における有毛細胞表面マーカーの免疫蛍光検出。 ミオシン-VIIa(緑)、ファロイジン(緑)、およびDAPI(青)の免疫蛍光染色を有機培養のd 2で行いました。スケールバー = 10 μm。略語:IHC、内有毛細胞;OHC、外有毛細胞;DAPI、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:継代有毛細胞における表面マーカーの免疫蛍光検出。 (A)ミオシン-VIIa(赤)、ファロイジン(緑)、DAPI(青)の免疫蛍光染色を、継代2および3の有機培養物で行いました。(B)ファロイジン陽性細胞数、ミオシンVIIa陽性細胞数、初代細胞から継代3までの全細胞数の比較。N = 3です。スケールバー = 100 μm。データは標準偏差±平均値として表示されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
HEI-OC1細胞株と比較して、有毛細胞の初代培養は、in vivoでの細胞の生理学的状態をより正確に再現しました。したがって、蝸牛器官から生細胞を単離し、直ちに培養する聴覚初代培養法は、聴覚系を広く研究する上で貴重なツールとなると考えられます。成功する文化には、特定のテクニックが不可欠です。第一に、側頭骨からコルチの器官が分離する期間を最小限に抑えることで、有毛細胞の活動が持続する可能性が高まります。したがって、研究者は臓器の解剖とPBSへの浸漬の間の時間間隔を最小限に抑えることが不可欠です。私たちの実験的観察に基づくと、約2〜3時間の持続時間は、10匹のマウスを解剖し、一度に20個の内耳を得るのに十分です。酵素解離プロセス中は、持続時間を12分に制限し、8分のインキュベーション期間後に蝸牛器官をピペットに移すことをお勧めします。約10回のピペッティングサイクル後に臓器を顕微鏡で観察し、ほぼすべての細胞が基底膜から剥離した時点で酵素的解離を停止しました。そうでなければ、臓器はさらに4分間インキュベーターに戻された。抗生物質の選択も重要です。一部のアミノグリコシド系抗生物質は耳毒性があり、有毛細胞死につながる可能性があるため、潜在的な汚染問題を防ぐために、10 mg/mLのペニシリン/ストレプトマイシンの使用を推奨します。
クラスVIIミオシンは動物組織で広く発現していますが、ミオシン-VIIaは内耳の前庭器官および蝸牛器官の有毛細胞のみで発現しています。クラスVIIaミオシンは、有毛細胞の足首リンク領域で立体繊毛を相互接続するのを助けるため、立体繊毛構造の維持に重要な役割を果たします11。初代細胞培養期間と細胞継代数の増加に続いて、ミオシン-VIIaの分解も時間の経過とともに増加しましたが、ファロイジンは安定しており、聴覚細胞の機能が時間とともに低下していることが示されました。このプロトコルの主な制限は、聴覚細胞が6〜7日以内にしか使用できず、HEI-OC1細胞12よりも成長に時間がかかることです。さらに、初代細胞は最終的に老化して死滅し、限られた成長能力を示すことは避けられません。さらに、有毛細胞の単離と培養には時間と経済的なコストがかかることが多く、広範な専門知識が必要です。コルチの器官には、内毛、外毛、支持細胞など、さまざまな神経感覚細胞が含まれています。このプロトコルはこれらのセルを生体外で分け、培養するための方法をもたらした。初代細胞は、ミオシン-VIIaとSox2をそれぞれ染色することで、毛髪細胞と支持細胞を区別することができます13,14。外有毛細胞と内有毛細胞は異なる機能を果たします。外側の有毛細胞は、膜電位の変化に応じて長さと硬さを急速に変化させ、内側の有毛細胞に形質導入されます。プレスチンは外有毛細胞のモータータンパク質であるのに対し、Slc17a8(vGlut3)はIHCに特異的に発現しており、in vitroで内有毛細胞を区別するために使用できます15,16,17,18。
有機培養と比較して、初代有毛細胞培養では有毛細胞の形態が大きく変化し、その結果、形態と機械伝達機能が異なります。有機培養は、コルチの器官内でステレオタイプな細胞パターン形成、極性、毛束形成、および神経接続を示す3次元の初代細胞培養です。対照的に、初代HEI−OC1細胞は典型的な多角形をしており、2次元培養環境における静的接着によって平坦に成長する19。有機培養物および初代細胞は、組織から直接単離され、正常な細胞形態と重要な機能関連マーカーを示します。しかし、HEI-OC1細胞は一般的に増殖性が高く、培養やトランスフェクションが容易で、何十年も維持できるのに対し、寿命が限られており、増殖能力も限られています。
初代細胞は、細胞培養において多くの利点があります。初代細胞は体組織から採取され、最適な増殖条件下で培養されるため、 in vivo 組織環境を忠実に模倣します。初代細胞の使用は、動物実験について提起された多くの倫理的異議を回避し、細胞株よりも適切な結果を提供します。事前に選択された初代細胞は、 in vivoでの分子シグナル伝達を厳密に表す適切なモデルです。異なるドナー由来の細胞は、炎症誘発性サイトカインに対して異なる反応を示します。単離と培養のコストは、動物モデルよりも安価ですが、多くの場合、高くなります。ここで説明した初代有毛細胞培養に用いた材料や動物はシンプルで、コストも比較的安く、操作も容易でした。最適な培養条件が維持されないと、その後の継代で初代細胞の特性が変化する可能性があります。継代数が増えると、細胞の状態も弱まりました(補足図S2)。得られた聴覚有毛細胞は、天然の体組織から直接得られたもので、改変されていないため、in vivoの状態や生理機能を忠実に模倣していました。したがって、初代有毛細胞は、細胞代謝や薬物毒性など、有毛細胞の生理学と生化学を研究するための優れたモデルシステムを提供します。初代細胞はin vitroで数日間しか維持できませんが、遺伝子形質転換後に不死化および無期限に分裂させて二次細胞株を得ることができます。
結論として、現在のプロトコルでは、微小解剖と酵素解離を使用して側頭骨から聴覚有毛細胞を分離することが説明されています。マウスの解剖から細胞のプレーティングまで、プロトコル全体に約3時間かかりました。培養細胞は高純度に維持され、6〜7日間健康に保たれました。初代有毛細胞培養には、わずか2継代に限定されるという固有の制限があるにもかかわらず、このプロトコルは単純な方法論と材料を採用し、それによって蝸牛有毛細胞の高効率研究を行うための新しい道を提示しました。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(NFSC 82101224 to YG)の支援を受けました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
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