Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att isolera och odla primära cochleahårceller från möss. Inledningsvis dissekerades Cortis organ från neonatala (3-5 dagar gamla) murina cochleae under ett mikroskop. Därefter rötades cellerna enzymatiskt till en encellssuspension och identifierades med hjälp av immunofluorescens efter flera dagars odling.
Abstract
Cochleafärgade hårceller är hörselsystemets sensoriska receptorer. Dessa celler finns i Cortis organ, det sensoriska organ som ansvarar för hörseln, i innerörats osseösa labyrint. Cochleafärgade hårceller består av två anatomiskt och funktionellt distinkta typer: yttre och inre hårceller. Skador på någon av dem leder till hörselnedsättning. Särskilt eftersom inre hårceller inte kan regenerera, och skador på dem är permanenta. Därför är in vitro-odling av primära hårceller oumbärlig för att undersöka de skyddande eller regenerativa effekterna av cochleahårceller. Denna studie syftade till att upptäcka en metod för att isolera och odla hårceller från möss.
Efter att cochleans sidovägg avlägsnats manuellt dissekerades hörselepitelet noggrant från cochleans modiolus under ett mikroskop, inkuberades i en blandning bestående av 0,25 % trypsin-EDTA i 10 minuter vid 37 °C och suspenderades försiktigt i odlingsmedium med hjälp av en 200 μL pipettspets. Cellsuspensionen leddes genom ett cellfilter, filtratet centrifugerades och cellerna odlades i 24-hålsplattor. Hårceller identifierades baserat på deras förmåga att uttrycka ett mekanotransduktionskomplex, myosin-VIIa, som är involverat i motoriska spänningar, och via selektiv märkning av F-aktin med hjälp av falloidin. Cellerna nådde >90 % sammanflöde efter 4 dagar i odling. Denna metod kan öka vår förståelse för de biologiska egenskaperna hos in vitro-odlade hårceller och demonstrera effektiviteten hos cochleära hårcellskulturer, vilket skapar en solid metodologisk grund för vidare hörselforskning.
Introduction
Cochlea-hårceller spelar en viktig roll i ljuddetektering och signalöverföring till hörselnerven. Hårceller är mekanistiska celler som fungerar som primära sensoriska receptorer och omvandlar ljudvibrationer till elektriska signaler hos ryggradsdjur. Det sensoriska epitelet i innerörat hos däggdjur består av en enda rad av inre hårceller och tre rader av yttre hårceller. I olika grundläggande membranområden uppfattar hårcellerna ljud vid olika frekvenser (mellan 20 och 2 000 Hz)1. De yttre hårcellernas funktion är en aktiv mekanisk förstärkningsprocess som hjälper till att finjustera innerörat hos däggdjur, vilket ger hög känslighet för ljud. Inre hårceller är ansvariga för att upptäcka ljud. Efter graderad depolarisering överförs akustisk information till hjärnan genom de auditiva nervfibrerna2.
Hörselnedsättning kan orsakas av genetiska defekter, åldrande, bullertrauma eller överdriven användning av ototoxiska läkemedel, som utgör ett stort hälsoproblem över hela världen 3,4. Hörselnedsättning beror främst på irreversibla skador på hårcellerna5. När det gäller bullerinducerad hörselnedsättning saknas en omfattande förståelse för de många underliggande mekanismerna, även om forskarna har nått konsensus om flera detaljer i dess etiologi. Yttre hårceller är särskilt känsliga för akustisk överexponering6. Mekanokänsliga cochleahårceller är involverade i åldersrelaterad hörselnedsättning; De molekylära och cellulära mekanismerna bakom hårcellsdegeneration är dock fortfarande okända. Flera förändringar i de molekylära processerna leder till hårcellers åldrande, oxidativ stress, DNA-skaderespons, autofagi och dysreglering av uttrycket och transkriptionen av gener relaterade till hårcellsspecialisering7.
Eftersom innerörat är inneslutet i tinningbenet, djupt inne i kroppens hårdaste ben, är det experimentellt otillgängligt, vilket utgör en utmaning för undersökningar av mekanismerna för reparation och regenerering av hårceller. Att etablera in vitro-kulturer för att undersöka hårcellernas funktion har därför blivit en idealisk metod för forskning om innerörats regenererings- och skademekanismer. Procedurerna för beredning av cochleaorganotypiska kulturer har beskrivits i tidigare studier 8,9,10. Forskare över hela världen har använt olika tekniker för mikrodissektion och ytbehandling av cochlear. Trots de ihållande utmaningarna har olika primära hårcellsodlingssystem framgångsrikt etablerats in vitro. Cochleaorgankulturer innehåller olika celltyper, inklusive hårceller, Deiters-celler, Hensens celler, pelarceller och hörselnervfibrer. En fördjupad förståelse av förändringar i hårceller på cellulär och molekylär nivå efter skada kommer att möjliggöra utveckling av mer kraftfulla forskningsverktyg. Denna studie syftade till att demonstrera stegen för att isolera cochleaorgan från neonatala möss och enzymatiskt lossa de rikligt förekommande hårcellerna för in vitro-studier. De odlade cellernas beskaffenhet bekräftades med hjälp av immunofluorescensfärgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes (nr 2021-847) av Xi'an Jiaotong University Committee on the Use and Care of Animals.
1. Sterilisering och materialberedning
- Sterilisera dissektionsverktygen med högtemperatur- och högtrycksångdesinfektion och torka dem i en 50 °C inkubator över natten.
- Bered 100 ml odlingsmedium som innehåller 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 10 mg/ml penicillin/streptomycin (tillsätt 10 ml FBS och 10 μl stamlösning av penicillin till 90 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (EMEM)) i förväg och förvara vid 4 °C.
2. Dissektion och avlägsnande av tinningbenet för insamling av auditiv epitel
- Avliva totalt 10 nyfödda möss (mellan P3 och P5) genom halshuggning på is. Använd en alternativ, etiskt godkänd metod, om så krävs.
- Håll huvudet på plats, öppna hårbotten längs sagittalsuturen med en mikrosax och separera och fixera hårbotten bilateralt med fingrarna, som visas i figur 1A.
- Ta bort hjärnan med hjälp av en liten periosteal hiss och dela den basala skallen i två delar. Klipp kraniet med en sax och vänd framåt för att öppna skallen; Använd spetsen på saxen för att skrapa hjärnan och exponera skallbasen.
- Observera de bilaterala temporalbenen vid skallbasen (Figur 1C). Använd en sax för att klippa skallbasen längs mittlinjen, skrapa bort huden och ta bort onödigt ben (Figur 1D,D').
- Behåll och överför tinningbenen till 35 mm sterila petriskålar som innehåller färsk Hanks balanserade saltlösning (HBSS) (Figur 1E).
- Använd två #5-spetsiga pincetter för att ta bort bullan och omgivande vävnad från den petrösa delen av tinningbenet (Figur 1E).
OBS: I detta skede skulle den beniga labyrinten i mössens tinningben inte vara helt förkalkad och skulle lätt dissekeras med hjälp av en pincett. - Håll pincetten med ena handen för att fixera den halvcirkelformade delen av tinningbenet och stick in den nedre delen av pincen i den runda fönsternischen med den andra handen för att separera sidobenet i cochlean från scala vestibulen. Ta försiktigt bort den petrösa delen av tinningbenet utan att vidröra OC-epitelet. Separera sedan försiktigt och ta bort snäckans benlabyrint från den basala änden till den apikala änden (Figur 1F).
- Mikroisolera försiktigt Cortis sensoriska epitelorgan från modiolus med hjälp av #5-spetsig pincett (Figur 1G).
- Håll i spiralligamentet, separera det försiktigt från stria vascularis med en mikroverkande pincett och överför det rena hörselepitelet till en 3 mm steril odlingsskål innehållande HBSS med hjälp av en 200 μL pipett (Figur 1H).
- Samla in 20 prover från varje djur och överför dem snabbt till en 100 mm steril petriskål som innehåller HBSS för nästa beredningssteg (figur 1).
3. Enzymatisk disaggregering för att erhålla hörselhårceller
- Överför hörselepitelet till 10 ml färskt DMEM innehållande 0,25 % trypsin och inkubera vid 37 °C i 12 minuter.
- Använd en 200 μL pipettspets och separera försiktigt hårcellerna från basallaminan och andra celler under ett operationsmikroskop.
- Tillsätt ytterligare 10 ml odlingsmedium för att hämma uppdelningen.
- Filtrera de suspenderade cellerna i odlingsmediet genom ett 70 μm-filter, samla upp filtratet i ett rent 50 ml rör och centrifugera det vid 300 × g i 5 minuter.
- Återsuspendera hårcellerna i minst 5 ml odlingsmedium genom att försiktigt pipettera dem upp och ner med en 1 000 μL pipettspets. Undvik att introducera bubblor.
- Placera ett täckglas i botten av en tallrik med sex brunnar i förväg. Räkna cellerna och odla dem med en densitet av 106 celler/ml i plattor med sex brunnar.
- Odla de vidhäftande cellerna i 2 ml DMEM (innehållande 10 % FBS, 100 enheter/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin) vid 37 °C och 5 % CO2 . Byt odlingsmedium varje dag.
OBS: Det bör nämnas att användning av detta protokoll inte resulterar i att man får rena hårceller. Baserat på denna primära cellodlingsmetod rekommenderar vi att man använder d2- eller d3-celler för vidare studier, eftersom hårceller kan utgöra cirka 70 % av cellerna i odling och vara i gott skick.
4. Immunofluorescerande färgning
- Skörda de odlade cellerna från d1 till d6 (en brunn per dag). Aspirera odlingsmediet och skölj cellerna 2x med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Fixera cellerna med 4 % paraformaldehyd i 15 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort fixeringsmedlet och skölj cellerna i 3 x 3 minuter med PBS.
- Permeabilisera cellerna med PBS innehållande 0,2% Triton X-100 i 10 min vid RT.
- Inkubera de permeabiliserade cellerna med en blockerande lösning bestående av 10% FBS i PBS i 20 minuter vid RT.
- Färga cellerna med monoklonal antikropp mot myosin (utspädd vid 1:200 i PBS) vid 4 °C över natten.
- Tvätta cellerna 3 gånger med steril PBS och inkubera dem med sekundär antikropp (Alexa Fluor 594 get anti-rabbit MYO7A, utspädd 1:500 i PBS) och fluoresceinmärkt falloidin (Alexa Fluor 488, för att identifiera cellstrukturen) i 2 timmar vid RT.
- Skölj cellerna 3 gånger med PBS för att ta bort de sekundära antikropparna.
- Tillsätt 1-2 droppar monteringsmedium med DAPI på objektglasen, montera täckglasen och placera dem under ett laserskanningskonfokalmikroskop för att ta bilder av cellerna.
5. Statistisk analys
- Utför tvåvägsanalys av varians (ANOVA) följt av Tukeys post hoc-tester för att analysera förändringarna i gråvärdena för myosin-VIIa och falloidin över tid. Använd bokstavsmarkeringsmetoden för att markera statistiska differenser.
- Utför ytterligare envägs ANOVAs följt av Tukeys post-hoc-tester för att jämföra det falloidinpositiva cellförhållandet mellan cellprover från dag 1 till dag 6 och det myosin-VII-positiva cellförhållandet på samma dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter detta protokoll sådde vi de isolerade cellerna. Primära cochleafrön ansågs vara framgångsrika om cellerna inte flöt i odlingsmediet och spred sig inom 24 timmar. Vi bestämde antalet hårceller efter att de fastnat och spridit sig till platta aggregat i botten av skålen. Efter 1 dag fästes levande hårceller tätt på botten av odlingsskålen och icke-vidhäftande celler avlägsnades genom sköljning med PBS. Vanligtvis fördubblades antalet celler efter 3 dagars odling (figur 2).
Immunofluorescens (IF) avslöjade uttrycket av myosin-VIIa och falloidin fram till d6 (Figur 3A). Vi observerade att gråvärdet och förhållandet mellan myosin-VIIa och positiva celler minskade med tiden, medan falloidingråvärdet och förhållandet mellan positiva celler förblev desamma jämfört med dem vid d1 efter odling (Figur 3B-D). Vi använde en ekologisk odling som en positiv kontroll för att verifiera att de myosin-VIIa-positiva cellerna verkligen var hårceller. Kompletterande figur S1 visar immunofluorescensfärgning av myosin-VIIa (grön), falloidin (grön) och 4′6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, blå) i hörselepitelet efter 2 dagars odling.
Med hjälp av IF bekräftade vi att de erhållna cellerna var hårceller. I synnerhet observerade vi att de flesta odlade celler uppvisade positiv färgning för hörselcellsmarkören myosin-VIIa (rött) protein, som också uppvisade ett långsträckt utseende under ett fluorescensmikroskop (Figur 3A). Dessa resultat tydde på att de odlade cellerna huvudsakligen var hårceller.
Figur 1: Dissektion och avlägsnande av tinningbenet för insamling av hörselepitel. A) Halshuggning och öppning av kraniet längs den sagittala suturen. (B) avlägsnande av hjärnan. (C) Bild av de bilaterala temporalbenen i skallbasen. De högra temporalbenen (D) efter att ha tagit bort ben och tissurer som omger tinningbenet (D') markerade med OC och PSD. (E) Överför temporalbenen till färsk Hanks balanserade saltlösning (HBSS), ta bort stapes och placera med den ovala fönstersidan uppåt. (F) Separera försiktigt och ta bort snäckans benlabyrint från basalen till den apikala änden. Corti sensoriska epitel (G) fäste vid stria vascularis, (H) separerade från stria vascularis. Skalstaplar = 1 000 μm (C-H). Förkortningar: OC = Cortis organ; PSD = bakre halvcirkelformad kanal; SV = stria vascularis. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Hårceller 4 dagar efter odling. Ljusmikroskopisk undersökning 4 dagar efter odling. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Detektion av hårcellsytmarkörer med hjälp av immunofluorescens . (A) Myosin-VIIa (röd), falloidin (grön) och DAPI (blå) immunofluorescensfärgning från dag 1 till dag 6 efter cellodling. (B, C) Gråvärdesanalys av myosin-VIIa och falloidin; Statistiska differenser anges med bokstäver. (D) Jämförelse av förhållandet mellan falloidinpositiva celler mellan cellprover från dag 1 till dag 6 och myosin-VII samma dagar. Stora bokstäver representerar statistiska resultat för falloidin, medan små bokstäver representerar statistiska resultat för myosin-VIIa. Uppgifterna presenteras som medelvärdet ± medelfelet för medelvärdet. N = 5; skalstapel = 50 μm. Tvåvägsanalys av varians (ANOVA) följt av Tukeys post hoc-test utfördes för gråvärdesanalys av myosin-VIIa och falloidin. Envägs ANOVA utfördes för jämförelse av falloidin- och myosin-VII-positiva cellförhållanden mellan cellprover från d 1 till d 6. Olika bokstäver indikerar statistiska skillnader i falloidinfärgning, medan små bokstäver indikerar statistiska skillnader i myosin-VIIa-färgning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Immunofluorescensdetektion av hårcellsytmarkörer i organisk kultur. Immunofluorescensfärgning av myosin-VIIa (grön), falloidin (grön) och DAPI (blå) utfördes på d 2 av ekologisk kultur. Skalstapel = 10 μm. Förkortningar: IHC, inre hårcell; OHC, yttre hårcell; DAPI, 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Immunofluorescensdetektion av ytmarkörer i passerade hårceller. (A) Immunofluorescensfärgning av myosin-VIIa (röd), falloidin (grön) och DAPI (blå) utfördes på organiska kulturer vid passage 2 och 3. (B) Jämförelse av antalet falloidinpositiva celler, myosin-VIIa-positiva celler och totalt antal celler från primära celler till passage 3. N = 3; skalstapel = 100 μm. Data visas som medelvärdet ± standardavvikelsen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jämfört med HEI-OC1-cellinjen replikerade primära kulturer av hårceller mer exakt det fysiologiska tillståndet hos celler in vivo. Därför verkar den auditiva primära odlingsmetoden, som etablerats genom att isolera levande celler från cochleaorgan och omedelbart odla dem, vara ett värdefullt verktyg för omfattande forskning om hörselsystem. Vissa tekniker är avgörande för en framgångsrik kultur. För det första, att minimera varaktigheten av separationen av Corti-organet från tinningbenet ökar sannolikheten för ihållande aktivitet hos hårcellerna. Följaktligen är det absolut nödvändigt för forskare att minimera tidsintervallet mellan dissektion och nedsänkning av organ i PBS. Baserat på våra experimentella observationer räcker det med en varaktighet på cirka 2-3 timmar för att dissekera 10 möss och få fram de 20 innerören åt gången. Under den enzymatiska sönderdelningsprocessen är det lämpligt att begränsa varaktigheten till 12 minuter och överföra cochleaorganen till pipetter efter en inkubationstid på 8 minuter. Organen observerades i mikroskop efter cirka 10 pipetteringscykler, och den enzymatiska sönderdelningen avbröts när nästan alla celler hade lossnat från basilarmembranet. I annat fall fördes organen tillbaka till kuvösen i ytterligare 4 minuter. Valet av antibiotika är också viktigt. Vi rekommenderar att du använder 10 mg/ml penicillin/streptomycin för att förhindra potentiella kontamineringsproblem eftersom vissa aminoglykosidantibiotika kan vara ototoxiska och leda till hårcellsdöd.
Även om myosiner av klass VII uttrycks i stor utsträckning i djurvävnader, uttrycks myosin-VIIa endast i hårcellerna i innerörats vestibulära organ och cochleaorgan. Klass VIIa-myosiner spelar en viktig roll för att upprätthålla stereocilistrukturen, eftersom de hjälper till att koppla samman stereocilier vid fotledslänkregionen i hårcellerna11. Efter en ökning av varaktigheten av den primära cellodlingen och antalet cellpassager ökade också nedbrytningen av myosin-VIIa med tiden, medan falloidin förblev stabilt, vilket tyder på att hörselcellernas funktion minskade med tiden. Den största begränsningen med detta protokoll är att hörselceller endast kan användas inom 6-7 dagar och tar längre tid att växa än HEI-OC1-celler12. Dessutom är det oundvikligt att primära celler så småningom dör och uppvisar begränsad tillväxtpotential. Dessutom är de tidsmässiga och ekonomiska kostnaderna för isolering och odling av hårceller ofta höga och kräver omfattande expertis. Cortis organ innehåller en mängd olika neurosensoriska celler, inklusive inre hår, yttre hår och stödceller. Detta protokoll introducerade en metod för att separera och odla dessa celler in vitro. Primära celler kan skiljas mellan hår och stödjeceller genom färgning för myosin-VIIa respektive Sox213,14. Yttre och inre hårceller utför olika funktioner. Yttre hårceller ändrar snabbt sin längd och styvhet som svar på förändringar i membranpotentialen och transduceras till inre hårceller. Prestin är ett motorprotein i de yttre hårcellerna, medan Slc17a8 (vGlut3) uttrycks specifikt i IHC och kan användas för att särskilja inre hårceller in vitro15,16,17,18.
Jämfört med organiska kulturer förändras hårcellernas morfologi avsevärt i primära hårcellskulturer, vilket resulterar i olika morfologier och mekanotransduktionsfunktioner. Organiska kulturer är tredimensionella primära cellkulturer som uppvisar stereotypa cellulära mönster, polaritet, hårbuntbildning och neurala förbindelser inom Cortis organ. Däremot har primära HEI-OC1-celler en typisk polygonal form och växer platt genom statisk vidhäftning i en tvådimensionell odlingsmiljö19. Organiska kulturer och primära celler isoleras direkt från vävnader och uppvisar normal cellmorfologi och viktiga funktionsrelaterade markörer. Men till skillnad från HEI-OC1-celler, som i allmänhet är mycket proliferativa, lättare att odla och transfektera och kan underhållas i årtionden, har dessa celler en begränsad livslängd och begränsad expansionskapacitet.
Primära celler har många fördelar vid cellodling. Eftersom primära celler erhålls från kroppsvävnader och odlas under optimala tillväxtförhållanden, efterliknar de nära vävnadsmiljön in vivo . Genom att använda primära celler undviker man många etiska invändningar mot djurförsök och ger mer relevanta resultat än cellinjer. Förvalda primära celler är adekvata modeller som nära representerar molekylär signalering in vivo. Celler från olika donatorer svarar olika på proinflammatoriska cytokiner. Kostnaderna för isolering och odling är ofta höga, även om de är billigare än för djurmodeller. Materialen och djuren som användes i den primära hårcellsodlingen som beskrivs här var enkla, deras kostnad var relativt låg och systemet var lätt att använda. Om optimala odlingsbetingelser inte upprätthålls kan egenskaperna hos de primära cellerna förändras med efterföljande passager. När antalet passager ökade, försvagades också celltillståndet (kompletterande figur S2). Eftersom de härrörde direkt från naturliga kroppsvävnader utan modifiering, efterliknade de erhållna hörselhårcellerna nära deras in vivo-tillstånd och fysiologi. Därför ger primära hårceller ett utmärkt modellsystem för att studera hårcellernas fysiologi och biokemi, inklusive cellmetabolism och läkemedelstoxicitet. Även om primära celler bara kan upprätthållas i några dagar in vitro, kan de förevigas och delas på obestämd tid efter genetisk transformation för att erhålla sekundära cellinjer.
Sammanfattningsvis beskrev det nuvarande protokollet isoleringen av auditiva hårceller från tinningbenet med hjälp av mikrodissektion och enzymatisk disaggregering. Hela protokollet tog cirka 3 timmar, från musdissektion till cellplätering. De odlade cellerna bibehölls vid hög renhet och förblev friska i 6-7 dagar. Trots de inneboende begränsningarna hos primära hårcellskulturer, som är begränsade till endast två passager, använde detta protokoll enkla metoder och material, vilket presenterade en ny väg för att bedriva mycket effektiv forskning på cochleahårceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 till YG)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
- Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
- Nieman, C. L., Oh, E. S.
- Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).
- Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
- Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).
- Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
- Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).
- Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).
- Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
- Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046 (2017).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
- Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
