Summary
В данной статье мы представляем подробный протокол выделения и культивирования первичных волосковых клеток улитки у мышей. Первоначально орган корти препарировали из неонатальных (в возрасте 3-5 дней) мышиных улиток под микроскопом. Впоследствии клетки ферментативно переваривали в одноклеточную суспензию и идентифицировали с помощью иммунофлуоресценции через несколько дней в культуре.
Abstract
Волосковые клетки улитки являются сенсорными рецепторами слуховой системы. Эти клетки расположены в кортиевом органе, органе чувств, отвечающем за слух, в костном лабиринте внутреннего уха. Кохлеарные волосковые клетки состоят из двух анатомически и функционально различных типов: наружных и внутренних волосковых клеток. Повреждение любого из них приводит к потере слуха. Примечательно, что внутренние волосковые клетки не могут регенерировать, и их повреждение является необратимым. Следовательно, культивирование первичных волосковых клеток in vitro необходимо для изучения защитных или регенеративных эффектов волосковых клеток улитки. Это исследование было направлено на поиск метода выделения и культивирования волосковых клеток мышей.
После ручного удаления боковой стенки улитки слуховой эпителий тщательно отделяли от кохлеарного модиолы под микроскопом, инкубировали в смеси, состоящей из 0,25% трипсина-ЭДТА, в течение 10 мин при 37 °С и осторожно суспендировали в питательной среде с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл. Клеточную суспензию пропускали через клеточный фильтр, фильтрат центрифугировали, а клетки культивировали в 24-луночных планшетах. Волосковые клетки были идентифицированы на основе их способности экспрессировать механотрансдукционный комплекс, миозин-VIIa, который участвует в двигательном напряжении, а также путем селективного мечения F-актина с помощью фаллоидина. Клетки достигали >90% слияния через 4 дня в культуре. Этот метод может улучшить наше понимание биологических характеристик культивируемых волосковых клеток in vitro и продемонстрировать эффективность культур кохлеарных волосковых клеток, создавая прочную методологическую основу для дальнейших слуховых исследований.
Introduction
Волосковые клетки улитки играют важную роль в обнаружении звука и передаче сигнала к слуховому нерву. Волосковые клетки — это механистические клетки, которые функционируют как первичные сенсорные рецепторы и преобразуют звуковые колебания в электрические сигналы у позвоночных. Сенсорный эпителий внутреннего уха млекопитающих состоит из одного ряда внутренних волосковых клеток и трех рядов наружных волосковых клеток. В разных основных участках мембраны волосковые клетки воспринимают звуки на разных частотах (от 20 до 2000 Гц)1. Функция наружных волосковых клеток заключается в активном механическом процессе усиления, который помогает тонко настроить внутреннее ухо млекопитающих, обеспечивая высокую чувствительность к звуку. Внутренние волосковые клетки отвечают за распознавание звуков. После ступенчатой деполяризации акустическая информация передается в мозг через слуховые нервные волокна2.
Потеря слуха может быть вызвана генетическими дефектами, старением, шумовой травмой или чрезмерным использованием ототоксических препаратов, которые представляют собой серьезную проблему для здоровья во всем мире 3,4. Потеря слуха в основном возникает в результате необратимого повреждения волосковых клеток5. Что касается потери слуха, вызванной шумом, то, несмотря на то, что исследователи достигли консенсуса по некоторым деталям ее этиологии, отсутствует всестороннее понимание многочисленных механизмов, лежащих в ее основе. Наружные волосковые клетки особенно уязвимы к акустическому передержанию6. Механочувствительные волосковые клетки улитки участвуют в возрастной тугоухости; Однако молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе дегенерации волосковых клеток, остаются неизвестными. Некоторые изменения в молекулярных процессах приводят к старению волосяных клеток, окислительному стрессу, реакции на повреждение ДНК, аутофагии и дисрегуляции экспрессии и транскрипции генов, связанных со специализацией волосяных клеток7.
Поскольку внутреннее ухо заключено в височную кость, глубоко в самой твердой кости тела, оно экспериментально недоступно, что создает проблему для исследований механизмов восстановления и регенерации волосковых клеток. Таким образом, создание культур in vitro для изучения функции волосковых клеток стало идеальным методом для исследования механизмов регенерации и повреждения внутреннего уха. Процедуры приготовления кохлеарных органотипических культур были описаны в более ранних работах 8,9,10. Исследователи по всему миру используют различные методы кохлеарной микродиссекции и подготовки поверхности. Несмотря на сохраняющиеся проблемы, различные системы первичных культивирования волосяных клеток были успешно созданы in vitro. Культуры кохлеарных органов содержат различные типы клеток, включая волосковые клетки, клетки Дейтера, клетки Хенсена, столбчатые клетки и волокна слухового нерва. Глубокое понимание изменений в волосковых клетках на клеточном и молекулярном уровнях после травмы позволит разработать более мощные исследовательские инструменты. Это исследование было направлено на демонстрацию шагов по изоляции кохлеарных органов от новорожденных мышей и ферментативному отделению обильных волосковых клеток для исследований in vitro. Природу культивируемых клеток подтверждали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены (No 2021-847) Комитетом по использованию животных и уходу за животными Сианьского университета Цзяотун.
1. Стерилизация и подготовка материала
- Стерилизуйте инструменты для препарирования с помощью паровой дезинфекции при высокой температуре и высоком давлении и высушите их в инкубаторе при температуре 50 °C в течение ночи.
- Заранее приготовьте 100 мл питательной среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10 мг/мл пенициллина/стрептомицина (добавьте 10 мл FBS и 10 мкл исходного раствора пенициллина к 90 мл модифицированной орлиной среды (EMEM)) Dulbecco и храните при 4 °C.
2. Рассечение и удаление височной кости для забора слухового эпителия
- Усыпить в общей сложности 10 новорожденных мышей (в возрасте от P3 до P5) путем обезглавливания на льду. При необходимости используйте альтернативную, этически одобренную методологию.
- Удерживая голову на месте, раскройте кожу головы по сагиттальному шву с помощью микроножниц, а затем отделите и зафиксируйте кожу головы с обеих сторон пальцами, как показано на рисунке 1А.
- Удалите мозг с помощью небольшого надкостничного лифта и разделите пополам базальный череп. Разрежьте череп ножницами и переверните вперед, чтобы открыть череп; Кончиком ножниц соскребите мозг и обнажите основание черепа.
- Обратите внимание на двусторонние височные кости у основания черепа (рис. 1С). С помощью ножниц разрежьте основание черепа по средней линии, соскребите кожу и удалите все ненужные кости (рис. 1D, D').
- Сохраните и перенесите височные кости в стерильные чашки Петри диаметром 35 мм, содержащие свежий сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS) (Рисунок 1E).
- Используйте два щипца #5, чтобы удалить буллу и окружающие ткани из каменистой части височной кости (Рисунок 1E).
Примечание: На этой стадии костный лабиринт в височной кости мышей не будет полностью кальцинирован и будет легко рассечен с помощью щипцов. - Одной рукой придерживают щипцы, чтобы зафиксировать полукруглую часть височной кости, а другой рукой воткнуть нижнюю ножку щипцов в круглую оконную нишу, чтобы отделить латеральную кость улитки от преддверия. Осторожно удалите каменистую часть височной кости, не касаясь эпителия ОК. Затем осторожно отделяют и удаляют костный лабиринт улитки от базального конца до апикального конца (рис. 1F).
- Тщательно микроизолируют орган сенсорного эпителия Корти от модиолуса с помощью щипцов #5 (рис. 1G).
- Удерживают спиральную связку, осторожно отделяют ее от сосудистых стрий с помощью микрооперационных щипцов и переносят чистый слуховой эпителий в 3-миллиметровую стерильную культуральную чашку, содержащую HBSS, с помощью пипетки на 200 мкл (рис. 1H).
- Соберите 20 образцов у каждого животного и быстро перенесите их в стерильную чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую HBSS, для следующего этапа подготовки (рис. 1).
3. Ферментативная дезагрегация для получения слуховых волосковых клеток
- Переносят слуховой эпителий в 10 мл свежего ДМЭМ, содержащего 0,25% трипсина, и инкубируют при 37 °С в течение 12 мин.
- С помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл аккуратно отделите волосковые клетки от базальной пластинки и другие клетки под операционным микроскопом.
- Добавьте еще 10 мл питательной среды, чтобы ингибировать дезагрегацию.
- Взвешенные клетки в питательной среде фильтруют через фильтр 70 мкм, собирают фильтрат в чистую пробирку объемом 50 мл и центрифугируют при 300 × г в течение 5 мин.
- Ресуспендируйте волосковые клетки не менее чем в 5 мл питательной среды, осторожно пипетируя их вверх и вниз с помощью наконечника пипетки объемом 1000 мкл. Избегайте появления пузырей.
- Заранее положите покровный стебель на дно шестилуночной тарелки. Подсчитайте клетки и культивируйте их при плотности 106 клеток/мл в шестилуночных планшетах.
- Выращивают адгезивные клетки в 2 мл DMEM (содержащего 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) при 37 °C и 5% CO2. Меняйте питательную среду каждый день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что использование этого протокола не приводит к получению чистых волосковых клеток. Основываясь на этом методе первичного культивирования клеток, мы рекомендуем использовать клетки d2 или d3 для дальнейших исследований, так как волосковые клетки могут составлять примерно 70% клеток в культуре и быть в хорошем состоянии.
4. Иммунофлуоресцентное окрашивание
- Заготавливают культивируемые клетки от d1 до d6 (по одной лунке в день). Аспирируйте питательную среду и промойте клетки 2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS).
- Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
- Снимите фиксатор и промойте ячейки в течение 3 x 3 мин с помощью PBS.
- Пермеабилизацию клеток PBS, содержащей 0,2% Triton X-100, в течение 10 мин при RT.
- Инкубируют пермеабилизированные клетки с блокирующим раствором, состоящим из 10% FBS, в PBS в течение 20 мин при RT.
- Окрасьте клетки моноклональным антителом против миозина (разведенным в соотношении 1:200 в PBS) при 4 °C в течение ночи.
- Промывают клетки 3 раза стерильным PBS и инкубируют их со вторичными антителами (Alexa Fluor 594 козий антикроличий MYO7A, разбавленный 1:500 в PBS) и флуоресцеин-меченным фаллоидином (Alexa Fluor 488, для определения клеточной структуры) в течение 2 ч при RT.
- Промойте клетки 3 раза PBS, чтобы удалить вторичные антитела.
- Добавьте 1-2 капли монтажной среды с DAPI на предметные стекла, закрепите покровные стекла и поместите их под лазерный сканирующий конфокальный микроскоп для получения фотографий клеток.
5. Статистический анализ
- Выполните двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим тестом Тьюки post hoc для анализа изменений серых значений миозина-VIIa и фаллоидина с течением времени. Используйте метод буквенной маркировки для обозначения статистических различий.
- Выполните дополнительные односторонние тесты ANOVA с последующим тестированием по методу Тьюки, чтобы сравнить соотношение фаллоидин-положительных клеток между образцами клеток с 1-го по 6-й день и соотношение миозин-VII-положительных клеток в те же дни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следуя этому протоколу, мы засеяли изолированные клетки. Первичные семена волосковых клеток улитки считались успешными, если клетки не плавали в питательной среде и распространялись в течение 24 ч. Мы определили количество волосковых клеток после того, как они прилипли и распределились в плоские агрегаты на дне чашки. Через 1 сутки живые волосковые клетки плотно приклеивали ко дну чашки для культивирования, а неприлипшие клетки удаляли путем промывания ПБС. Как правило, количество клеток удваивается через 3 дня культивирования (рис. 2).
Иммунофлюоресценция (ИФ) выявила экспрессию миозина-VIIa и фаллоидина до d6 (рис. 3А). Мы наблюдали, что серое значение миозина-VIIa и положительное соотношение клеток уменьшались со временем, в то время как серое значение фаллоидина и положительное соотношение клеток оставались прежними по сравнению с таковыми при d1 после культивирования (рис. 3B-D). Мы использовали органическую культуру в качестве положительного контроля, чтобы убедиться, что миозин-VIIa-положительные клетки действительно являются волосковыми клетками. На дополнительном рисунке S1 показано иммунофлуоресцентное окрашивание миозина-VIIa (зеленый), фаллоидина (зеленый) и 4'6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, синий) в слуховом эпителии после 2 дней культивирования.
С помощью ИФ мы подтвердили, что полученные клетки являются волосковыми. В частности, мы заметили, что большинство культивируемых клеток показали положительное окрашивание на маркер слуховых клеток миозин-VIIa (красный) белок, а также демонстрировали удлиненный вид под флуоресцентным микроскопом (рис. 3А). Эти результаты свидетельствуют о том, что культивируемые клетки были в основном волосковыми клетками.
Рисунок 1: Рассечение и удаление височной кости для забора слухового эпителия. (А) обезглавливание и вскрытие черепной коробки по сагиттальному шву; (Б) удаление мозга. (C) Вид билатеральных височных костей, расположенных в основании черепа. Правая височная кость (D) после удаления костей и перевязь, окружающих височную кость (D'), маркируется OC и PSD. (E) Пересадить височные кости в свежий сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS), удалить стремечко и поместить овальной стороной вверх. (F) Осторожно отделите и удалите костный лабиринт улитки от базального до апикального конца. Орган кортиевского сенсорного эпителия (G) прилегал к сосудистой полосе, (H) отделялся от сосудистой полосы. Масштабные линейки = 1 000 мкм (C-H). Сокращения: OC = орган Корти; PSD = задний полукружный канал; SV = сосудистые полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Волосковые клетки через 4 дня после культивирования. Световое микроскопическое исследование через 4 дня после культивирования. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Обнаружение маркеров поверхности волосковых клеток с помощью иммунофлуоресценции . (A) Иммунофлюоресцентное окрашивание миозином-VIIa (красным), фаллоидином (зеленым) и DAPI (синим) с 1-го по 6-й день после культивирования клеток. (В, В) Анализ миозина-VIIa и фаллоидина по шкале Грея; Статистические различия обозначаются буквами. (D) Сравнение соотношения фаллоидин-положительных клеток между образцами клеток с 1-го по 6-й день и миозином-VII в те же дни. Заглавные буквы обозначают статистические результаты для фаллоидина, в то время как строчные буквы представляют статистические результаты для миозина-VIIa. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего значения. N = 5; Масштабная линейка = 50 мкм. Двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим тестом Тьюки был проведен для анализа серых значений миозина-VIIa и фаллоидина. Для сравнения соотношения фаллоидина и миозина-VII-положительных клеток между образцами клеток от d1 до d 6 проводили однофакторную ANOVA. Разные буквы указывают на статистические различия в окрашивании фаллоидином, в то время как строчные буквы указывают на статистические различия в окрашивании миозина-VIIa. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Иммунофлуоресцентное обнаружение маркеров поверхности волосковых клеток в органической культуре. Иммунофлуоресцентное окрашивание миозина-VIIa (зеленый), фаллоидина (зеленый) и DAPI (синий) проводили на d2 органической культуры. Масштабная линейка = 10 мкм. Сокращения: IHC, внутренняя волосковая клетка; OHC, наружная волосковая клетка; DAPI, 4′,6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Иммунофлуоресцентное обнаружение поверхностных маркеров в пассажных волосковых клетках. (A) Иммунофлуоресцентное окрашивание миозина-VIIa (красный), фаллоидина (зеленый) и DAPI (синий) проводили на органических культурах в пассажах 2 и 3. (B) Сравнение количества фаллоидин-позитивных клеток, миозин-VIIa-положительных клеток и общего количества клеток от первичных клеток до пассажа 3. N = 3; Масштабная линейка = 100 мкм. Данные отображаются в виде среднего ± стандартного отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
По сравнению с клеточной линией HEI-OC1 первичные культуры волосковых клеток более точно воспроизводили физиологическое состояние клеток in vivo. Таким образом, метод первичного культивирования слуховых клеток, основанный на выделении живых клеток из органов улитки и их немедленном культивировании, представляется ценным инструментом для обширных исследований слуховых систем. Определенные методы имеют решающее значение для успешной культуры. Во-первых, минимизация длительности отделения кортиевого органа от височной кости повышает вероятность устойчивой активности волосковых клеток. Следовательно, исследователям крайне важно свести к минимуму временной интервал между вскрытием и погружением органов в PBS. Основываясь на наших экспериментальных наблюдениях, продолжительность примерно 2-3 ч достаточна для препарирования 10 мышей и получения 20 внутренних ушей за один раз. В процессе ферментативной дезагрегации целесообразно ограничить продолжительность до 12 мин и переложить кохлеарные органы в пипетки после инкубационного периода 8 мин. Органы наблюдали под микроскопом примерно после 10 циклов пипетирования, и ферментативная дезагрегация прекращалась, когда почти все клетки отделялись от базилярной мембраны. В противном случае органы возвращали в инкубатор еще на 4 мин. Выбор антибиотика также важен. Мы рекомендуем использовать пенициллин/стрептомицин в дозе 10 мг/мл, чтобы предотвратить потенциальные проблемы с контаминацией, поскольку некоторые аминогликозидные антибиотики могут быть ототоксичными и приводить к гибели волосяных клеток.
Хотя миозины VII класса широко экспрессируются в тканях животных, миозин-VIIa экспрессируется только в волосковых клетках вестибулярного и кохлеарного органов внутреннего уха. Миозины класса VIIa играют важную роль в поддержании структуры стереоцилий, поскольку они помогают соединять стереоцилии в области звеньев лодыжки в волосковых клетках11. После увеличения продолжительности первичной клеточной культуры и количества клеточных пассажей деградация миозина-VIIa также увеличивалась с течением времени, в то время как фаллоидин оставался стабильным, что указывает на то, что функция слуховых клеток уменьшалась со временем. Основным ограничением этого протокола является то, что слуховые клетки могут быть использованы только в течение 6-7 дней, и для их роста требуется больше времени, чем для роста клеток HEI-OC112. Более того, первичные клетки неизбежно стареют и умирают, демонстрируя ограниченный потенциал роста. Кроме того, временные и экономические затраты на выделение и культивирование волосковых клеток часто высоки и требуют обширных знаний. Кортийский орган содержит множество нейросенсорных клеток, включая внутренние волосы, внешние волосы и поддерживающие клетки. В этом протоколе был введен метод разделения и культивирования этих клеток in vitro. Первичные клетки можно отличить от волосяных и поддерживающих путем окрашивания на миозин-VIIa и Sox2 соответственно13,14. Наружные и внутренние волосковые клетки выполняют разные функции. Наружные волосковые клетки быстро изменяют свою длину и жесткость в ответ на изменения мембранного потенциала и трансдуцируются во внутренние волосковые клетки. Престин является моторным белком наружных волосковых клеток, в то время как Slc17a8 (vGlut3) специфически экспрессируется в ИГХ и может быть использован для различения внутренних волосковых клеток in vitro15,16,17,18.
По сравнению с органическими культурами, морфология волосковых клеток значительно изменяется в первичных культурах волосковых клеток, что приводит к различным морфологиям и механотрансдукционным функциям. Органические культуры представляют собой трехмерные первичные клеточные культуры, которые демонстрируют стереотипный клеточный рисунок, полярность, образование волосяных пучков и нейронные связи в органах корти. Напротив, первичные клетки HEI-OC1 имеют типичную полигональную форму и растут плоскими за счет статической адгезии в двумерной культуральной среде19. Органические культуры и первичные клетки непосредственно выделяются из тканей и демонстрируют нормальную морфологию клеток и важные маркеры, связанные с функцией. Однако, в отличие от клеток HEI-OC1, которые, как правило, обладают высокой пролиферативностью, легче культивируются и трансфицируются и могут поддерживаться в течение десятилетий, эти клетки имеют конечную продолжительность жизни и ограниченную способность к расширению.
Первичные клетки имеют много преимуществ в клеточной культуре. Поскольку первичные клетки получают из тканей организма и культивируют в оптимальных условиях роста, они точно имитируют тканевую среду in vivo . Использование первичных клеток позволяет избежать многих этических возражений, связанных с экспериментами на животных, и дает более релевантные результаты, чем клеточные линии. Предварительно отобранные первичные клетки являются адекватными моделями, которые точно представляют молекулярную сигнализацию in vivo. Клетки разных доноров по-разному реагируют на провоспалительные цитокины. Затраты на изоляцию и культивирование часто высоки, хотя они и менее затратны, чем затраты на животных моделях. Материалы и животные, используемые в первичной культуре волосяных клеток, описанные здесь, были простыми, их стоимость была относительно низкой, а система была проста в эксплуатации. При несоблюдении оптимальных условий культивирования характеристики первичных клеток могут изменяться при последующих пассажах. По мере увеличения числа пассажей клеточное состояние также ослабевало (дополнительный рисунок S2). Поскольку они были получены непосредственно из нативных тканей организма без модификации, полученные слуховые волосковые клетки очень точно имитировали их состояние in vivo и физиологию. Таким образом, первичные волосковые клетки представляют собой прекрасную модельную систему для изучения физиологии и биохимии волосковых клеток, включая клеточный метаболизм и лекарственную токсичность. Хотя первичные клетки могут поддерживаться только в течение нескольких дней in vitro, они могут быть иммортализированы и разделены на неопределенный срок после генетической трансформации для получения вторичных клеточных линий.
В заключение следует отметить, что в настоящем протоколе описана изоляция слуховых волосковых клеток из височной кости с помощью микродиссекции и ферментативной дезагрегации. Весь протокол занял примерно 3 часа, от вскрытия мыши до нанесения покрытия клеток. Культивируемые клетки поддерживались в высокой чистоте и оставались здоровыми в течение 6-7 дней. Несмотря на ограничения, присущие первичным культурам волосковых клеток, которые ограничены всего двумя проходами, в этом протоколе использовались простые методологии и материалы, тем самым представляя новый путь для проведения высокоэффективных исследований кохлеарных волосковых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (NFSC 82101224 YG)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
- Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
- Nieman, C. L., Oh, E. S.
- Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).
- Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
- Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).
- Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
- Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).
- Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).
- Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
- Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046 (2017).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
- Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
