במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיפוח תאי שערת שבלול ראשוניים מעכברים. בתחילה, האיבר של קורטי נותח מהיילוד (בגיל 3-5 ימים) שבלול מורין תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, התאים עוכלו אנזימטית לתרחיף חד-תאי וזוהו באמצעות אימונופלואורסנציה לאחר מספר ימים בתרבית.
תאי שיער שבלול הם קולטני החישה של מערכת השמע. תאים אלה ממוקמים באיבר של קורטי, איבר החישה האחראי על השמיעה, בתוך מבוך הגלוסקמה של האוזן הפנימית. תאי שיער של השבלול מורכבים משני סוגים שונים מבחינה אנטומית ותפקודית: תאי שיער חיצוניים ופנימיים. נזק לכל אחד מהם גורם לאובדן שמיעה. יש לציין כי תאי השערה הפנימיים אינם יכולים להתחדש, והנזק להם הוא קבוע. לפיכך, טיפוח במבחנה של תאי שיער ראשוניים הוא הכרחי לחקר ההשפעות המגינות או המתחדשות של תאי שיער שבלול. מחקר זה נועד לגלות שיטה לבידוד וטיפוח תאי שיער של עכברים.
לאחר הסרה ידנית של דופן השבלול הצידית, אפיתל השמע נותח בקפידה מהמודיולוס השבלול תחת מיקרוסקופ, הודגר בתערובת המורכבת מ-0.25% טריפסין-EDTA למשך 10 דקות ב-37°C, והושעה בעדינות בתווך תרבית באמצעות קצה פיפטה של 200 μL. תרחיף התאים הועבר דרך מסנן תאים, התסנין היה צנטריפוגי, והתאים גודלו בתרבית בלוחות של 24 בארות. תאי השערה זוהו על סמך יכולתם לבטא קומפלקס מכנוטרנסדוקציה, מיוזין-VIIa, המעורב במתחים מוטוריים, ובאמצעות תיוג סלקטיבי של F-אקטין באמצעות פאלואדין. התאים הגיעו למפגש של >90% לאחר 4D בתרבית. שיטה זו יכולה לשפר את הבנתנו את המאפיינים הביולוגיים של תאי שיער בתרבית חוץ גופית ולהדגים את היעילות של תרביות תאי שיער שבלול, ולבסס בסיס מתודולוגי מוצק למחקר שמיעתי נוסף.
תאי שיער של השבלול ממלאים תפקידים חשובים בזיהוי צלילים ובהעברת אותות לעצב השמיעה. תאי שיער הם תאים מכניסטיים המתפקדים כקולטני חישה ראשוניים וממירים תנודות קול לאותות חשמליים בבעלי חוליות. אפיתל החישה של האוזן הפנימית של היונקים מורכב משורה אחת של תאי שיער פנימיים ושלוש שורות של תאי שיער חיצוניים. באזורים בסיסיים שונים בממברנה, תאי השערה קולטים צלילים בתדרים שונים (בין 20 ל-2,000 הרץ)1. תפקידם של תאי השערה החיצוניים הוא תהליך הגברה מכני פעיל המסייע לכוונן את האוזן הפנימית של היונקים, ומעניק רגישות גבוהה לקול. תאי השערה הפנימיים אחראים על זיהוי צלילים. לאחר דפולריזציה מדורגת, מידע אקוסטי מועבר למוח דרך סיבי עצב השמיעה2.
ליקוי שמיעה עלול להיגרם על ידי פגמים גנטיים, הזדקנות, טראומה לרעש או שימוש מופרז בתרופות אוטוטוקסיות, המהוות דאגה בריאותית מרכזית ברחבי העולם 3,4. ליקוי שמיעה נובע בעיקר מנזק בלתי הפיך לתאי השערה5. בנוגע לאובדן שמיעה הנגרם כתוצאה מרעש, למרות שהחוקרים הגיעו להסכמה על מספר פרטים של האטיולוגיה שלו, חסרה הבנה מקיפה של המנגנונים הבסיסיים הרבים. תאי השערה החיצוניים פגיעים במיוחד לחשיפת יתר אקוסטית6. תאי שיער שבלול רגישים למכנו מעורבים באובדן שמיעה הקשור לגיל; עם זאת, המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס ניוון תאי השערה עדיין אינם ידועים. מספר שינויים בתהליכים המולקולריים מובילים להזדקנות תאי שיער, עקה חמצונית, תגובת נזק לדנ”א, אוטופגיה וחוסר ויסות של ביטוי ושעתוק גנים הקשורים להתמחות תאי השערה7.
מכיוון שהאוזן הפנימית עטופה בעצם הרקתית, עמוק בעצם הקשה ביותר בגוף, היא אינה נגישה באופן ניסיוני, מה שמציב אתגר לחקירת מנגנוני התיקון וההתחדשות של תאי השערה. לפיכך, הקמת תרביות חוץ גופיות לחקר תפקודם של תאי השערה הפכה לשיטה אידיאלית למחקר על מנגנוני ההתחדשות והפציעה של האוזן הפנימית. ההליכים להכנת תרביות אורגנוטיפיות שבלול תוארו במחקרים קודמים 8,9,10. חוקרים ברחבי העולם השתמשו בטכניקות שונות של מיקרודיסקציה של שבלול והכנת פני שטח. למרות האתגרים המתמשכים, מערכות שונות של תרביות תאי שיער ראשוניות הוקמו בהצלחה במבחנה. תרביות איברי שבלול מכילות סוגי תאים שונים, כולל תאי שיער, תאי דייטר, תאי הנסן, תאי עמוד וסיבי עצב שמיעתיים. הבנה מעמיקה של השינויים בתאי השערה ברמה התאית והמולקולרית לאחר פציעה תאפשר פיתוח כלי מחקר חזקים יותר. מחקר זה נועד להדגים את השלבים לבידוד איברי השבלול מעכברי יילודים ולניתוק אנזימטי של תאי השערה השופעים לצורך מחקרי מבחנה. אופי התאים בתרבית אושר באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית.
בהשוואה לקו התאים HEI-OC1, תרביות ראשוניות של תאי שיער שכפלו בצורה מדויקת יותר את המצב הפיזיולוגי של תאים in vivo. לכן, שיטת התרבית הראשונית השמיעתית שנקבעה על ידי בידוד תאים חיים מאיברי השבלול וטיפוחם המיידי נראית ככלי רב ערך למחקר מקיף על מערכות שמיעתיות. טכניקות מסוימות חיוניות לתרבות מצליחה….
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NFSC 82101224 to YG)
100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |