Summary
Hierin presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren en kweken van primaire cochleaire haarcellen van muizen. Aanvankelijk werd het orgaan van Corti onder een microscoop ontleed uit neonatale (3-5 dagen oud) muizenslakkenhuis. Vervolgens werden cellen enzymatisch verteerd tot een eencellige suspensie en geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie na enkele dagen in kweek.
Abstract
Cochleaire haarcellen zijn de sensorische receptoren van het auditieve systeem. Deze cellen bevinden zich in het orgaan van Corti, het zintuig dat verantwoordelijk is voor het gehoor, in het botlabyrint van het binnenoor. Cochleaire haarcellen bestaan uit twee anatomisch en functioneel verschillende typen: buitenste en binnenste haarcellen. Schade aan een van beide leidt tot gehoorverlies. Met name omdat de binnenste haarcellen niet kunnen regenereren en de schade aan hen permanent is. Daarom is in vitro kweek van primaire haarcellen onmisbaar voor het onderzoeken van de beschermende of regeneratieve effecten van cochleaire haarcellen. Deze studie had tot doel een methode te ontdekken voor het isoleren en kweken van haarcellen van muizen.
Na handmatige verwijdering van de cochleaire zijwand werd het auditieve epitheel onder een microscoop minutieus uit de cochleaire modiolus ontleed, gedurende 10 minuten bij 37 °C geïncubeerd in een mengsel bestaande uit 0,25% trypsine-EDTA en voorzichtig gesuspendeerd in kweekmedium met behulp van een pipetpunt van 200 μl. De celsuspensie werd door een celfilter geleid, het filtraat werd gecentrifugeerd en de cellen werden gekweekt in platen met 24 putjes. Haarcellen werden geïdentificeerd op basis van hun vermogen om een mechanotransductiecomplex, myosine-VIIa, tot expressie te brengen, dat betrokken is bij motorische spanningen, en via selectieve labeling van F-actine met behulp van phalloidine. Cellen bereikten >90% samenvloeiing na 4 dagen in kweek. Deze methode kan ons begrip van de biologische kenmerken van in vitro gekweekte haarcellen vergroten en de efficiëntie van cochleaire haarcelculturen aantonen, waardoor een solide methodologische basis wordt gelegd voor verder auditief onderzoek.
Introduction
Cochleaire haarcellen spelen een belangrijke rol bij de detectie van geluid en de signaaloverdracht naar de gehoorzenuw. Haarcellen zijn mechanistische cellen die functioneren als primaire sensorische receptoren en geluidstrillingen omzetten in elektrische signalen bij gewervelde dieren. Het sensorische epitheel van het binnenoor van zoogdieren bestaat uit een enkele rij binnenste haarcellen en drie rijen buitenste haarcellen. In verschillende basische membraangebieden nemen haarcellen geluiden waar op verschillende frequenties (tussen 20 en 2.000 Hz)1. De functie van buitenste haarcellen is een actief mechanisch versterkingsproces dat helpt bij het verfijnen van het binnenoor van zoogdieren, waardoor een hoge gevoeligheid voor geluid ontstaat. Interne haarcellen zijn verantwoordelijk voor het detecteren van geluiden. Na graduele depolarisatie wordt akoestische informatie via de gehoorzenuwvezels naar de hersenen verzonden2.
Gehoorverlies kan worden veroorzaakt door genetische defecten, veroudering, lawaaitrauma of overmatig gebruik van ototoxische geneesmiddelen, die wereldwijd een groot gezondheidsprobleem vormen 3,4. Gehoorverlies is voornamelijk het gevolg van onomkeerbare schade aan haarcellen5. Hoewel onderzoekers het eens zijn geworden over verschillende details van de etiologie ervan, ontbreekt het aan een alomvattend begrip van de talrijke onderliggende mechanismen, hoewel onderzoekers het eens zijn geworden over verschillende details van de etiologie. Buitenste haarcellen zijn bijzonder kwetsbaar voor akoestische overbelichting6. Mechanosensitieve cochleaire haarcellen zijn betrokken bij leeftijdsgebonden gehoorverlies; De moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de degeneratie van haarcellen blijven echter onbekend. Verschillende veranderingen in de moleculaire processen leiden tot veroudering van haarcellen, oxidatieve stress, reactie op DNA-schade, autofagie en ontregeling van de expressie en transcriptie van genen die verband houden met haarcelspecialisatie7.
Omdat het binnenoor is ingekapseld in het slaapbeen, diep in het hardste bot van het lichaam, is het experimenteel ontoegankelijk, wat een uitdaging vormt voor onderzoek naar de mechanismen van herstel en regeneratie van haarcellen. Daarom is het opzetten van in vitro culturen voor het onderzoeken van de functie van haarcellen een ideale methode geworden voor onderzoek naar de regeneratie- en letselmechanismen van het binnenoor. De procedures voor het bereiden van cochleaire organotypische culturen zijn beschreven in eerdere studies 8,9,10. Onderzoekers over de hele wereld hebben verschillende cochleaire microdissectie- en oppervlaktevoorbereidingstechnieken gebruikt. Ondanks de aanhoudende uitdagingen zijn verschillende primaire haarcelkweeksystemen met succes in vitro opgezet. Cochleaire orgaanculturen bevatten verschillende celtypen, waaronder haarcellen, Deiters-cellen, Hensen-cellen, pilaarcellen en gehoorzenuwvezels. Een diepgaand begrip van de veranderingen in haarcellen op cellulair en moleculair niveau na letsel zal de ontwikkeling van krachtigere onderzoeksinstrumenten mogelijk maken. Deze studie had tot doel de stappen aan te tonen voor het isoleren van cochleaire organen van neonatale muizen en het enzymatisch losmaken van de overvloedige haarcellen voor in vitro studies. De aard van de gekweekte cellen werd bevestigd met behulp van immunofluorescentiekleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven zijn goedgekeurd (nr. 2021-847) door de Xi'an Jiaotong University Committee on the Use and Care of Animals.
1. Sterilisatie en materiaalvoorbereiding
- Steriliseer de dissectie-instrumenten met stoomdesinfectie op hoge temperatuur en onder hoge druk en droog ze een nacht in een incubator van 50 °C.
- Bereid van tevoren 100 ml van het kweekmedium met 10% foetaal runderserum (FBS) en 10 mg/ml penicilline/streptomycine (voeg 10 ml FBS en 10 μl penicilline-bouillonoplossing toe aan 90 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (EMEM) en bewaar bij 4 °C.
2. Dissectie en verwijdering van het slaapbeen voor het verzamelen van auditieve epitheel
- Euthanaseer in totaal 10 pasgeboren muizen (tussen P3 en P5) door onthoofding op ijs. Gebruik indien nodig een alternatieve, ethisch goedgekeurde methodologie.
- Houd het hoofd op zijn plaats, open de hoofdhuid langs de sagittale hechting met behulp van een micro-operatieschaar en scheid en fixeer de hoofdhuid bilateraal met de vingers, zoals weergegeven in figuur 1A.
- Verwijder de hersenen met behulp van een kleine periostale lift en snijd de basale schedel in tweeën. Knip de schedel met een schaar en klap naar voren om de schedel te openen; Gebruik de punt van de schaar om de hersenen te schrapen en de basis van de schedel bloot te leggen.
- Observeer de bilaterale slaapbeenderen aan de basis van de schedel (Figuur 1C). Gebruik een schaar om de basis van de schedel langs de middellijn door te knippen, schraap de huid weg en verwijder onnodig bot (Figuur 1D,D').
- Bewaar de slaapbeenderen en breng ze over in steriele petrischalen van 35 mm met verse Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) (Figuur 1E).
- Gebruik twee #5-puntige pincetten om de bulla en het omliggende weefsel uit het petrousachtige deel van het slaapbeen te verwijderen (Figuur 1E).
OPMERKING: In dit stadium zou het benige labyrint in het slaapbeen van de muizen niet volledig verkalkt zijn en gemakkelijk kunnen worden ontleed met een pincet. - Houd de tang met één hand vast om het halfronde deel van het slaapbeen vast te zetten en steek met de andere hand de onderste voet van de pincet in de ronde vensternis om het laterale bot van het slakkenhuis te scheiden van de vestibule van de scala. Verwijder voorzichtig het petroeuze deel van het slaapbeen zonder het OC-epitheel aan te raken. Scheid en verwijder vervolgens voorzichtig het benige labyrint van het slakkenhuis van het basale uiteinde tot het apicale uiteinde (Figuur 1F).
- Micro-isoleer het orgaan van het sensorische epitheel van Corti zorgvuldig van de modiolus met behulp van een #5-puntige pincet (Figuur 1G).
- Houd het spiraalvormige ligament vast, scheid het voorzichtig van de stria vascularis met een micro-operatietang en breng het schone auditieve epitheel over in een steriel kweekschaaltje van 3 mm met HBSS met behulp van een pipet van 200 μl (Figuur 1H).
- Verzamel 20 monsters van elk dier en breng ze snel over naar een steriele petrischaal van 100 mm met HBSS voor de volgende bereidingsstap (Figuur 1).
3. Enzymatische desaggregatie voor het verkrijgen van auditieve haarcellen
- Breng het auditieve epitheel over in 10 ml verse DMEM met 0,25% trypsine en incubeer gedurende 12 minuten bij 37 °C.
- Scheid met behulp van een pipetpunt van 200 μl de haarcellen voorzichtig van de basale lamina en andere cellen onder een operatiemicroscoop.
- Voeg nog eens 10 ml kweekmedium toe om de desaggregatie te remmen.
- Filtreer de zwevende cellen in het kweekmedium door een filter van 70 μm, vang het filtraat op in een schoon buisje van 50 ml en centrifugeer het gedurende 5 minuten bij 300 × g .
- Resuspendeer de haarcellen in ten minste 5 ml kweekmedium door ze voorzichtig op en neer te pipetteren met behulp van een pipetpunt van 1.000 μl. Vermijd het introduceren van bubbels.
- Plaats van tevoren een dekglaasje op de bodem van een bord met zes putjes. Tel de cellen en kweek ze met een dichtheid van 106 cellen/ml in platen met zes putjes.
- Kweek de aanhangende cellen in 2 ml DMEM (met 10% FBS, 100 eenheden/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine) bij 37 °C en 5% CO2. Verander het cultuurmedium elke dag.
OPMERKING: Er moet worden vermeld dat het gebruik van dit protocol niet resulteert in het verkrijgen van pure haarcellen. Op basis van deze primaire celkweekmethode raden we aan om d2- of d3-cellen te gebruiken voor verder onderzoek, aangezien haarcellen ongeveer 70% van de cellen in kweek kunnen uitmaken en in een goede staat kunnen verkeren.
4. Immunofluorescerende kleuring
- Oogst de gekweekte cellen van d1 tot d6 (één putje per dag). Zuig het kweekmedium op en spoel de cellen 2x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Fixeer cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder het fixeermiddel en spoel de cellen gedurende 3 x 3 minuten met PBS.
- Permeabiliseer de cellen met PBS met 0,2% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij RT.
- Incubeer de gepermeabiliseerde cellen met een blokkerende oplossing bestaande uit 10% FBS in PBS gedurende 20 minuten bij RT.
- Kleuring van de cellen met anti-myosine monoklonaal antilichaam (verdund bij 1:200 in PBS) bij 4 °C gedurende een nacht.
- Was de cellen 3x met steriel PBS en incubeer ze met secundair antilichaam (Alexa Fluor 594 geit anti-konijn MYO7A, verdund 1:500 in PBS) en fluoresceïne-gelabeld phalloidine (Alexa Fluor 488, om de celstructuur te identificeren) gedurende 2 uur bij RT.
- Spoel de cellen 3x met PBS om de secundaire antilichamen te verwijderen.
- Voeg 1-2 druppels montagemedium met DAPI toe aan de objectglaasjes, monteer de dekglaasjes en plaats ze onder een confocale laserscanmicroscoop om foto's van de cellen te maken.
5. Statistische analyse
- Voer een tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA) uit, gevolgd door Tukey's post-hoctests om de veranderingen in de grijze waarden van myosine-VIIa en falloidine in de loop van de tijd te analyseren. Gebruik de lettermarkeringsmethode om statistische verschillen te markeren.
- Voer aanvullende eenrichtings-ANOVA's uit, gevolgd door Tukey's post-hoctests om de phalloidine-positieve celverhouding tussen celmonsters van dag 1 tot dag 6 en de myosine-VII-positieve celverhouding op dezelfde dagen te vergelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens dit protocol hebben we de geïsoleerde cellen gezaaid. Primaire cochleaire haarcelzaden werden als succesvol beschouwd als de cellen niet in het kweekmedium dreven en zich binnen 24 uur verspreidden. We bepaalden het aantal haarcellen nadat ze zich hadden gehecht en zich op de bodem van de schaal in platte aggregaten hadden verspreid. Na 1 dag werden levende haarcellen stevig aan de bodem van de kweekschaal gehecht en werden niet-klevende cellen verwijderd door te spoelen met PBS. Doorgaans verdubbelde het aantal cellen na 3 dagen cultuur (figuur 2).
Immunofluorescentie (IF) toonde de expressie van myosine-VIIa en falloidine tot d6 (Figuur 3A). We zagen dat de myosine-VIIa-grijswaarde en de positieve celverhouding in de loop van de tijd afnamen, terwijl de phalloidine-grijswaarde en de positieve celverhouding hetzelfde bleven in vergelijking met die op d1 na kweek (Figuur 3B-D). We gebruikten een organische kweek als positieve controle om te verifiëren dat de myosine-VIIa-positieve cellen inderdaad haarcellen waren. Aanvullende figuur S1 toont de immunofluorescentiekleuring van myosine-VIIa (groen), falloidine (groen) en 4′6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, blauw) in het auditieve epitheel na 2 dagen kweek.
Met behulp van IF bevestigden we dat de verkregen cellen haarcellen waren. In het bijzonder zagen we dat de meeste gekweekte cellen een positieve kleuring vertoonden voor de auditieve celmarker myosine-VIIa (rood) eiwit, en ook een langwerpig uiterlijk vertoonden onder een fluorescentiemicroscoop (Figuur 3A). Deze resultaten suggereerden dat de gekweekte cellen voornamelijk haarcellen waren.
Figuur 1: Dissectie en verwijdering van het slaapbeen voor het verzamelen van auditieve epitheel. (A) Onthoofding en opening van de schedel langs de sagittale hechting; (B) het verwijderen van de hersenen. (C) Zicht op de bilaterale slaapbeenderen in de schedelbasis. De rechter slaapbeenderen (D) na het verwijderen van botten en tissuren rond het slaapbeen (D') gemarkeerd met OC en PSD. (E) Breng de slaapbeenderen over in verse Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), verwijder de stijgbeugels en plaats ze met de ovale vensterzijde naar boven. (F) Scheid en verwijder voorzichtig het benige labyrint van het slakkenhuis van het basale tot het apicale uiteinde. Het orgaan van het sensorische epitheel van Corti (G) hechtte zich aan de stria vascularis, (H) gescheiden van de stria vascularis. Schaalbalken = 1.000 μm (C-H). Afkortingen: OC = orgaan van Corti; PSD = achterste halfcirkelvormig kanaal; SV = stria vascularis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Haarcellen 4 dagen na kweek. Licht microscopisch onderzoek 4 dagen na kweek. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Detectie van markers op het oppervlak van haarcellen met behulp van immunofluorescentie. (A) Myosine-VIIa (rood), phalloidine (groen) en DAPI (blauw) immunofluorescentiekleuring van dag 1 tot dag 6 na celkweek. (B, C) Grijswaarde-analyse van myosine-VIIa en phalloidine; Statistische verschillen worden aangegeven met letters. (D) Vergelijking van de phalloidine-positieve celverhouding tussen celmonsters van dag 1 tot dag 6 en myosine-VII op dezelfde dagen. Hoofdletters vertegenwoordigen statistische resultaten voor phalloidine, terwijl kleine letters statistische resultaten voor myosine-VIIa vertegenwoordigen. Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde. N = 5; schaalbalk = 50 μm. Tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey's post-hoctest werd uitgevoerd voor grijswaardeanalyse van myosine-VIIa en phalloidine. One-way ANOVA werd uitgevoerd voor vergelijking van de verhouding tussen phalloidine en myosine-VII-positieve cellen tussen celmonsters van d 1 tot d 6. Verschillende letters duiden op statistische verschillen in falloidinekleuring, terwijl kleine letters statistische verschillen in myosine-VIIa-kleuring aangeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Immunofluorescentiedetectie van markers op het oppervlak van haarcellen in organische kweek. Immunofluorescentiekleuring van myosine-VIIa (groen), phalloidine (groen) en DAPI (blauw) werd uitgevoerd op d 2 van organische kweek. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: IHC, inner hair cell; OHC, buitenste haarcel; DAPI, 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Immunofluorescentiedetectie van oppervlaktemarkers in gepasseerde haarcellen. (A) Immunofluorescentiekleuring van myosine-VIIa (rood), phalloidine (groen) en DAPI (blauw) werd uitgevoerd op organische culturen in passages 2 en 3. (B) Vergelijking van het aantal phalloïdine-positieve cellen, myosine-VIIa-positieve cellen en het totale aantal cellen van primaire cellen tot passage 3. N = 3; schaalbalk = 100 μm. De gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± standaarddeviatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vergeleken met de HEI-OC1-cellijn repliceerden primaire culturen van haarcellen nauwkeuriger de fysiologische toestand van cellen in vivo. Daarom lijkt de auditieve primaire kweekmethode die is ontwikkeld door levende cellen uit cochleaire organen te isoleren en ze onmiddellijk te kweken, een waardevol hulpmiddel te zijn voor uitgebreid onderzoek naar auditieve systemen. Bepaalde technieken zijn cruciaal voor een succesvolle cultuur. Ten eerste vergroot het minimaliseren van de duur van de scheiding van het orgaan van Corti van het slaapbeen de kans op aanhoudende activiteit van haarcellen. Daarom is het absoluut noodzakelijk voor onderzoekers om het tijdsinterval tussen de dissectie en onderdompeling van organen in PBS te minimaliseren. Op basis van onze experimentele waarnemingen is een duur van ongeveer 2-3 uur voldoende voor het ontleden van 10 muizen en het verkrijgen van de 20 binnenoren per keer. Tijdens het enzymatische desaggregatieproces is het raadzaam om de duur te beperken tot 12 minuten en de cochleaire organen na een incubatietijd van 8 minuten over te brengen naar pipetten. De organen werden na ongeveer 10 pipetteercycli onder een microscoop waargenomen en de enzymatische desaggregatie werd gestopt toen bijna alle cellen waren losgekomen van het basilaire membraan. Anders werden de organen nog eens 4 minuten teruggebracht naar de couveuse. De keuze van het antibioticum is ook belangrijk. We raden aan om 10 mg/ml penicilline/streptomycine te gebruiken om mogelijke besmettingsproblemen te voorkomen, omdat sommige aminoglycoside-antibiotica ototoxisch kunnen zijn en tot haarceldood kunnen leiden.
Hoewel myosines van klasse VII op grote schaal tot expressie komen in dierlijke weefsels, komt myosine-VIIa alleen tot expressie in de haarcellen van de vestibulaire en cochleaire organen van het binnenoor. Klasse VIIa-myosines spelen een belangrijke rol bij het in stand houden van de stereociliastructuur, omdat ze helpen bij het verbinden van stereocilia in het enkelverbindingsgebied in haarcellen11. Na een toename van de duur van de primaire celkweek en het aantal celpassages, nam ook de afbraak van myosine-VIIa in de loop van de tijd toe, terwijl falloidine stabiel bleef, wat aangeeft dat de functie van de auditieve cellen in de loop van de tijd afnam. De belangrijkste beperking van dit protocol is dat auditieve cellen alleen binnen 6-7 dagen kunnen worden gebruikt en er langer over doen om te groeien dan HEI-OC1-cellen12. Bovendien is het onvermijdelijk dat primaire cellen uiteindelijk verouderen en afsterven, met een beperkt groeipotentieel. Bovendien zijn de tijd en de economische kosten van het isoleren en kweken van haarcellen vaak hoog en vereisen ze uitgebreide expertise. Het orgaan van Corti bevat een verscheidenheid aan neurosensorische cellen, waaronder binnenhaar, buitenhaar en ondersteunende cellen. Dit protocol introduceerde een methode om deze cellen in vitro te scheiden en te kweken. Primaire cellen kunnen worden onderscheiden tussen haar en ondersteunende cellen door te kleuren voor respectievelijk myosine-VIIa en Sox213,14. Buiten- en binnenste haarcellen vervullen verschillende functies. Buitenste haarcellen veranderen snel hun lengte en stijfheid als reactie op veranderingen in membraanpotentiaal en worden omgezet in binnenste haarcellen. Prestin is een motoreiwit van de buitenste haarcellen, terwijl Slc17a8 (vGlut3) specifiek tot expressie wordt gebracht in IHC's en kan worden gebruikt voor het onderscheiden van de binnenste haarcellen in vitro15,16,17,18.
In vergelijking met organische culturen verandert de morfologie van haarcellen aanzienlijk in primaire haarcelculturen, wat resulteert in verschillende morfologieën en mechanotransductiefuncties. Organische culturen zijn driedimensionale primaire celculturen die stereotiepe cellulaire patronen, polariteit, haarbundelvorming en neurale verbindingen vertonen in de organen van Corti. Primaire HEI-OC1-cellen daarentegen hebben een typische veelhoekige vorm en groeien plat door statische hechting in een tweedimensionale kweekomgeving19. Organische culturen en primaire cellen worden rechtstreeks geïsoleerd uit weefsels en vertonen een normale celmorfologie en belangrijke functiegerelateerde markers. In tegenstelling tot HEI-OC1-cellen, die over het algemeen zeer proliferatief zijn, gemakkelijker te kweken en te transfecteren en tientallen jaren kunnen worden onderhouden, hebben deze cellen echter een eindige levensduur en een beperkte expansiecapaciteit.
Primaire cellen hebben veel voordelen bij celkweek. Omdat primaire cellen worden verkregen uit lichaamsweefsels en gekweekt onder optimale groeiomstandigheden, bootsen ze de in vivo weefselomgeving nauw na. Het gebruik van primaire cellen vermijdt veel ethische bezwaren tegen dierproeven en levert relevantere resultaten op dan cellijnen. Voorgeselecteerde primaire cellen zijn adequate modellen die moleculaire signalering in vivo nauw weergeven. Cellen van verschillende donoren reageren verschillend op pro-inflammatoire cytokines. De kosten van isolatie en kweek zijn vaak hoog, hoewel ze minder duur zijn dan die van diermodellen. De materialen en dieren die werden gebruikt in de primaire haarcelkweek die hier wordt beschreven, waren eenvoudig, hun kosten waren relatief laag en het systeem was eenvoudig te bedienen. Als er geen optimale kweekomstandigheden worden gehandhaafd, kunnen de kenmerken van de primaire cellen veranderen met volgende passages. Naarmate het aantal passages toenam, verzwakte ook de celtoestand (aanvullende figuur S2). Omdat ze rechtstreeks en zonder modificatie afkomstig waren van inheemse lichaamsweefsels, bootsten de verkregen auditieve haarcellen hun in vivo toestand en fysiologie nauw na. Daarom bieden primaire haarcellen een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van de fysiologie en biochemie van haarcellen, inclusief celmetabolisme en geneesmiddeltoxiciteit. Hoewel primaire cellen slechts een paar dagen in vitro kunnen worden onderhouden, kunnen ze na genetische transformatie voor onbepaalde tijd worden vereeuwigd en gedeeld om secundaire cellijnen te verkrijgen.
Concluderend beschreef het huidige protocol de isolatie van auditieve haarcellen uit het slaapbeen met behulp van microdissectie en enzymatische desaggregatie. Het hele protocol duurde ongeveer 3 uur, van muisdissectie tot celplating. Gekweekte cellen werden op hoge zuiverheid gehouden en bleven 6-7 dagen gezond. Ondanks de inherente beperkingen van primaire haarcelculturen, die beperkt zijn tot slechts twee passages, maakte dit protocol gebruik van eenvoudige methodologieën en materialen, waardoor een nieuwe weg werd geboden voor het uitvoeren van zeer efficiënt onderzoek naar cochleaire haarcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 aan YG)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
- Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
- Nieman, C. L., Oh, E. S.
- Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).
- Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
- Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).
- Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
- Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).
- Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).
- Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
- Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046 (2017).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
- Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
