Summary
Neste trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento e cultivo de células ciliadas primárias da cóclea de camundongos. Inicialmente, o órgão de Corti foi dissecado de cócleas murinas neonatais (idade 3-5 dias) sob um microscópio. Posteriormente, as células foram digeridas enzimaticamente em uma suspensão unicelular e identificadas por imunofluorescência após vários dias em cultura.
Abstract
As células ciliadas da cóclea são os receptores sensoriais do sistema auditivo. Essas células estão localizadas no órgão de Corti, órgão sensorial responsável pela audição, dentro do labirinto ósseo da orelha interna. As células ciliadas da cóclea consistem em dois tipos anatomicamente e funcionalmente distintos: células ciliadas externas e internas. Danos a qualquer um deles resultam em perda auditiva. Notavelmente, como as células ciliadas internas não podem se regenerar, e os danos a elas são permanentes. Assim, o cultivo in vitro de células ciliadas primárias é indispensável para investigar os efeitos protetores ou regenerativos das células ciliadas da cóclea. Este estudo teve como objetivo descobrir um método para isolar e cultivar células ciliadas de camundongos.
Após a remoção manual da parede lateral da cóclea, o epitélio auditivo foi meticulosamente dissecado do modíolo coclear ao microscópio, incubado em uma mistura composta de tripsina-EDTA a 0,25% por 10 min a 37 °C e suavemente suspenso em meio de cultura com ponta de pipeta de 200 μL. A suspensão celular foi passada através de um filtro de células, o filtrado foi centrifugado e as células foram cultivadas em placas de 24 poços. As células ciliadas foram identificadas com base em sua capacidade de expressar um complexo mecanotransdutor, a miosina-VIIa, que está envolvido em tensões motoras, e via marcação seletiva de F-actina usando faloidina. As células atingiram >90% de confluência após 4 dias em cultura. Este método pode melhorar nossa compreensão das características biológicas de células ciliadas cultivadas in vitro e demonstrar a eficiência das culturas de células ciliadas cocleares, estabelecendo uma base metodológica sólida para futuras pesquisas auditivas.
Introduction
As células ciliadas da cóclea desempenham papéis importantes na detecção do som e na transmissão do sinal para o nervo auditivo. As células ciliadas são células mecanicistas que funcionam como receptores sensoriais primários e convertem vibrações sonoras em sinais elétricos em vertebrados. O epitélio sensorial da orelha interna de mamíferos é composto por uma única fileira de células ciliadas internas e três fileiras de células ciliadas externas. Em diferentes áreas da membrana básica, as células ciliadas percebem sons em diferentes frequências (entre 20 e 2.000 Hz)1. A função das células ciliadas externas é um processo de amplificação mecânica ativa que ajuda a ajustar o ouvido interno dos mamíferos, conferindo alta sensibilidade ao som. As células ciliadas internas são responsáveis pela detecção de sons. Após a despolarização gradual, a informação acústica é transmitida ao cérebro através das fibras do nervoauditivo2.
A perda auditiva pode ser causada por defeitos genéticos, envelhecimento, trauma sonoro ou uso excessivo de drogas ototóxicas, que constituem um grande problema de saúde em todo omundo3,4. A perda auditiva resulta, principalmente, de danos irreversíveis às células ciliadas5. Em relação à perda auditiva induzida por ruído, embora os pesquisadores tenham chegado a um consenso sobre vários detalhes de sua etiologia, falta uma compreensão abrangente dos inúmeros mecanismos subjacentes. As células ciliadas externas são particularmente vulneráveis à superexposição acústica6. As células ciliadas mecanossensíveis da cóclea estão envolvidas na perda auditiva relacionada à idade; no entanto, os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à degeneração das células ciliadas permanecem desconhecidos. Diversas alterações nos processos moleculares levam ao envelhecimento das células ciliadas, estresse oxidativo, resposta a danos ao DNA, autofagia e desregulação da expressão e transcrição de genes relacionados à especialização das células ciliadas7.
Como a orelha interna está envolta no osso temporal, profundamente no osso mais duro do corpo, ela é experimentalmente inacessível, representando um desafio para as investigações sobre os mecanismos de reparação e regeneração das células ciliadas. Assim, o estabelecimento de culturas in vitro para investigação da função das células ciliadas tornou-se um método ideal para pesquisas sobre os mecanismos de regeneração e lesão da orelha interna. Os procedimentos de preparo das culturas organotípicas da cóclea foram descritos em estudos anteriores 8,9,10. Pesquisadores em todo o mundo têm empregado várias técnicas de microdissecção coclear e preparação de superfície. Apesar dos desafios persistentes, vários sistemas primários de cultura de células ciliadas foram estabelecidos com sucesso in vitro. As culturas de órgãos cocleares contêm vários tipos de células, incluindo células ciliadas, células de Deiters, células de Hensen, células pilares e fibras do nervo auditivo. Uma compreensão profunda das mudanças nas células ciliadas em nível celular e molecular após a lesão permitirá o desenvolvimento de ferramentas de pesquisa mais poderosas. Este estudo teve como objetivo demonstrar os passos para isolar órgãos cocleares de camundongos neonatais e desprender enzimaticamente as células ciliadas abundantes para estudos in vitro. A natureza das células cultivadas foi confirmada pela coloração de imunofluorescência.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados (nº 2021-847) pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais da Universidade Xi'an Jiaotong.
1. Esterilização e preparo do material
- Esterilizar as ferramentas de dissecção usando desinfecção a vapor de alta temperatura e alta pressão e secá-las em uma incubadora de 50 °C durante a noite.
- Preparar 100 mL do meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e 10 mg/mL de penicilina/estreptomicina (adicionar 10 mL de SFB e 10 μL de solução estoque de penicilina a 90 mL de meio de águia modificado (EMEM) de Dulbecco e armazenar a 4 °C.
2. Dissecção e remoção do osso temporal para coleta de epitélios auditivos
- Eutanásia de um total de 10 camundongos recém-nascidos (com idade entre P3 e P5) por decapitação em gelo. Use uma metodologia alternativa, eticamente aprovada, se necessário.
- Manter a cabeça posicionada, abrir o couro cabeludo ao longo da sutura sagital com tesoura microoperatória e separar e fixar o couro cabeludo bilateralmente com os dedos, como mostra a Figura 1A.
- Remova o cérebro usando um pequeno elevador periosteal e bissetriz o crânio basal. Corte o crânio com uma tesoura e vire para frente para abrir o crânio; Use a ponta da tesoura para raspar o cérebro e expor a base do crânio.
- Observar os ossos temporais bilaterais na base do crânio (Figura 1C). Use tesoura para cortar a base do crânio ao longo da linha média, raspar a pele e remover qualquer osso desnecessário (Figura 1D,D').
- Reter e transferir os ossos temporais para placas de Petri estéreis de 35 mm contendo solução salina balanceada de Hank fresca (HBSS) (Figura 1E).
- Utilizar duas pinças de pontas #5 para remover a bula e o tecido circundante da porção petrosa do osso temporal (Figura 1E).
OBS: Nesta fase, o labirinto ósseo no osso temporal dos camundongos não estaria completamente calcificado e seria facilmente dissecado com pinças. - Segure a pinça com uma mão para fixar a parte semicircular do osso temporal e enfie o pé inferior da pinça no nicho da janela redonda com a outra mão para separar o osso lateral da cóclea do vestíbulo da escala. Remover cuidadosamente a porção petrosa do osso temporal sem tocar o epitélio OC. Em seguida, separar e remover cuidadosamente o labirinto ósseo da cóclea da extremidade basal para a extremidade apical (Figura 1F).
- Microisolar cuidadosamente o órgão do epitélio sensorial de Corti do modíolo usando pinça de pontas #5 (Figura 1G).
- Segurar o ligamento espiral, separá-lo cuidadosamente da estria vascular com pinças microoperadoras e transferir o epitélio auditivo limpo para uma placa de cultura estéril de 3 mm contendo HBSS usando uma pipeta de 200 μL (Figura 1H).
- Coletar 20 espécimes de cada animal e transferi-los rapidamente para uma placa de Petri estéril de 100 mm contendo HBSS para a próxima etapa de preparação (Figura 1).
3. Desagregado enzimático para obtenção de células ciliadas auditivas
- Transferir o epitélio auditivo para 10 mL de DMEM fresco contendo tripsina a 0,25% e incubar a 37 °C por 12 min.
- Usando uma ponta de pipeta de 200 μL, separe suavemente as células ciliadas da lâmina basal e outras células sob um microscópio cirúrgico.
- Adicionar mais 10 mL de meio de cultura para inibir a desagregação.
- Filtrar as células em suspensão no meio de cultura através de um filtro de 70 μm, recolher o filtrado num tubo limpo de 50 ml e centrifugar a 300 × g durante 5 minutos.
- Ressuspender as células ciliadas em pelo menos 5 mL de meio de cultura, pipetando-as suavemente para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL. Evite introduzir bolhas.
- Coloque uma tampa no fundo de uma placa de seis poços com antecedência. Contar as células e cultivá-las a uma densidade de 10a 6 células/mL em placas de seis poços.
- Cultivar as células aderentes em 2 mL de DMEM (contendo 10% de SFB, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) a 37 °C e 5% de CO2. Mude o meio cultural todos os dias.
OBS: Deve-se mencionar que a utilização deste protocolo não resulta na obtenção de células ciliadas puras. Com base neste método primário de cultura celular, recomendamos o uso de células d2 ou d3 para estudos posteriores, pois as células ciliadas podem constituir aproximadamente 70% das células em cultura e estar em bom estado.
4. Coloração por imunofluorescência
- Colher as células cultivadas de d1 a d6 (um poço por dia). Aspirar o meio de cultura e enxaguar as células 2x com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Fixar as células com paraformaldeído a 4% por 15 min à temperatura ambiente (TR).
- Retire o fixador e enxágue as células por 3 x 3 min com PBS.
- Permeabilizar as células com PBS contendo Triton X-100 a 0,2% por 10 min no TR.
- Incubar as células permeabilizadas com uma solução de bloqueio composta por SFB a 10% em PBS por 20 min no TR.
- Manchar as células com anticorpo monoclonal antimiosina (diluído a 1:200 em PBS) a 4 °C durante a noite.
- Lavar as células 3x com PBS estéril e incubá-las com anticorpo secundário (Alexa Fluor 594 cabra anti-coelho MYO7A, diluído 1:500 em PBS) e faloidina marcada com fluoresceína (Alexa Fluor 488, para identificar a estrutura celular) por 2 h no RT.
- Enxaguar as células 3x com PBS para remover os anticorpos secundários.
- Adicione 1-2 gotas de meio de montagem com DAPI nas lâminas, monte as lamínulas e coloque-as sob um microscópio confocal de varredura a laser para capturar fotos das células.
5. Análise estatística
- Realizar análise de variância (ANOVA) two-way seguida de testes post hoc de Tukey para analisar as mudanças nos valores de cinza de miosina-VIIa e faloidina ao longo do tempo. Use o método de marcação de letras para marcar diferenças estatísticas.
- Realizar ANOVAs unidirecionais adicionais seguidas de testes post-hoc de Tukey para comparar a razão de células positivas para faloidina entre amostras de células do dia 1 ao dia 6 e a razão de células positivas para miosina VII nos mesmos dias.
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Representative Results
Seguindo este protocolo, as células isoladas foram semeadas. Sementes de células ciliadas primárias da cóclea foram consideradas bem-sucedidas se as células não flutuassem no meio de cultura e se espalhassem em 24 h. Determinamos o número de células ciliadas após aderirem e se espalharem em agregados planos no fundo da placa. Após 1 dia, as células ciliadas vivas foram firmemente aderidas ao fundo da placa de cultura e as células não aderentes foram removidas por enxágüe com PBS. Tipicamente, o número de células dobrou após 3 dias de cultura (Figura 2).
A imunofluorescência (IF) revelou a expressão de miosina-VIIa e faloidina até d6 (Figura 3A). Observamos que o valor de cinza de miosina-VIIa e a razão de células positivas diminuíram com o tempo, enquanto o valor de cinza de faloidina e a razão de células positivas permaneceram os mesmos em comparação com aqueles em d1 após o cultivo (Figura 3B-D). Utilizamos uma cultura orgânica como controle positivo para verificar se as células positivas para miosina VIIa eram, de fato, células ciliadas. A Figura S1 suplementar mostra a coloração de imunofluorescência da miosina-VIIa (verde), faloidina (verde) e 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul) no epitélio auditivo após 2 dias de cultura.
Utilizando FI, confirmamos que as células obtidas eram células ciliadas. Em particular, observamos que a maioria das células cultivadas apresentou coloração positiva para a proteína miosina-VIIa (vermelha) do marcador auditivo, também exibindo aspecto alongado ao microscópio de fluorescência (Figura 3A). Esses resultados sugerem que as células cultivadas eram principalmente células ciliadas.
Figura 1: Dissecção e retirada do osso temporal para coleta de epitélios auditivos. (A) Decapitação e abertura do crânio ao longo da sutura sagital; (B) remoção do cérebro. (C) Vista dos ossos temporais bilaterais localizados na base do crânio. Os ossos temporais direitos (D) após a remoção dos ossos e tissuras ao redor do osso temporal (D') marcados com OC e PSD. (E) Transferência dos ossos temporais para solução salina balanceada de Hank fresca (HBSS), retirar o estribo e colocar com a janela oval para cima. (F) Separar e remover cuidadosamente o labirinto ósseo da cóclea da extremidade basal para a apical. O órgão do epitélio sensitivo de Corti (G) aderiu à estria vascular, (H) separado da estria vascular. Barras de escala = 1.000 μm (C-H). Abreviações: OC = órgão de Corti; PSD = canal semicircular posterior; VS = estria vascular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Células ciliadas 4 dias após a cultura. Exame microscópico de luz 4 dias após a cultura. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Detecção de marcadores de superfície das células ciliadas por imunofluorescência . (A) Coloração por imunofluorescência de miosina-VIIa (vermelho), faloidina (verde) e DAPI (azul) do dia 1 ao dia 6 após a cultura celular. (B, C) Análise do valor de cinza da miosina-VIIa e faloidina; as diferenças estatísticas são indicadas por letras. (D) Comparação da razão celular positiva para faloidina entre amostras celulares do dia 1 ao dia 6 e miosina-VII nos mesmos dias. Letras maiúsculas representam resultados estatísticos para faloidina, enquanto letras minúsculas representam resultados estatísticos para miosina-VIIa. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 5; barra de escala = 50 μm. A análise de variância (ANOVA) two-way seguida do teste post hoc de Tukey foi realizada para análise dos valores de cinza da miosina-VIIa e faloidina. ANOVA one-way foi realizada para comparação da relação celular positiva para faloidina e miosina VII entre amostras celulares de d 1 a d 6. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas na coloração da faloidina, enquanto letras pequenas indicam diferenças estatísticas na coloração da miosina-VIIa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar S1: Detecção por imunofluorescência de marcadores de superfície de células ciliadas em cultura orgânica. A coloração por imunofluorescência de miosina-VIIa (verde), faloidina (verde) e DAPI (azul) foi realizada em d 2 de cultura orgânica. Barra de escala = 10 μm. Abreviações: IHC, célula ciliada interna; CCE, células ciliadas externas; DAPI, 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S2: Detecção por imunofluorescência de marcadores de superfície em células ciliadas passadas. (A) A coloração por imunofluorescência de miosina-VIIa (vermelho), faloidina (verde) e DAPI (azul) foi realizada em culturas orgânicas nas passagens 2 e 3. (B) Comparação do número de células positivas para faloidina, células positivas para miosina VIIa e células totais de células primárias até a passagem 3. N = 3; barra de escala = 100 μm. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Em comparação com a linhagem celular HEI-OC1, culturas primárias de células ciliadas replicaram com mais precisão o estado fisiológico das células in vivo. Portanto, o método de cultura primária auditiva estabelecido pelo isolamento de células vivas dos órgãos cocleares e sua cultura imediata parece ser uma ferramenta valiosa para uma extensa pesquisa sobre sistemas auditivos. Certas técnicas são cruciais para uma cultura de sucesso. Primeiro, minimizar a duração da separação do órgão de Corti do osso temporal aumenta a probabilidade de atividade sustentada das células ciliadas. Consequentemente, é imperativo que os pesquisadores minimizem o intervalo de tempo entre a dissecção e a imersão dos órgãos em PBS. Com base em nossas observações experimentais, uma duração de aproximadamente 2-3 h é suficiente para dissecar 10 camundongos e obter as 20 orelhas internas de cada vez. Durante o processo de desagregação enzimática, é aconselhável restringir a duração a 12 min e transferir os órgãos cocleares para pipetas após um período de incubação de 8 min. Os órgãos foram observados ao microscópio após aproximadamente 10 ciclos de pipetagem, e a desagregação enzimática foi interrompida quando quase todas as células se desprenderam da membrana basilar. Caso contrário, os órgãos foram devolvidos à incubadora por mais 4 min. A escolha do antibiótico também é importante. Recomendamos o uso de 10 mg/mL de penicilina/estreptomicina para prevenir possíveis problemas de contaminação, pois alguns antibióticos aminoglicosídeos podem ser ototóxicos e levar à morte das células ciliadas.
Embora as miosinas classe VII sejam amplamente expressas em tecidos animais, a miosina-VIIa é expressa apenas nas células ciliadas dos órgãos vestibulares e cocleares da orelha interna. As miosinas de classe VIIa desempenham um papel importante na manutenção da estrutura dos estereocílios, pois ajudam a interligar os estereocílios na região do elo do tornozelo nas células ciliadas11. Após um aumento na duração da cultura celular primária e no número de passagens celulares, a degradação da miosina-VIIa também aumentou ao longo do tempo, enquanto a faloidina permaneceu estável, indicando que a função das células auditivas diminuiu com o tempo. A principal limitação deste protocolo é que as células auditivas só podem ser utilizadas dentro de 6-7 dias e levam mais tempo para crescer do que as células HEI-OC12. Além disso, é inevitável que as células primárias eventualmente senescam e morram, exibindo um potencial de crescimento limitado. Além disso, o tempo e os custos econômicos do isolamento e cultivo de células ciliadas são frequentemente altos e exigem ampla experiência. O órgão de Corti contém uma variedade de células neurossensoriais, incluindo cabelo interno, cabelo externo, e células de suporte. Este protocolo introduziu um método para separar e cultivar essas células in vitro. As células primárias podem ser distinguidas entre as células ciliadas e de suporte pela coloração para miosina-VIIa e Sox2, respectivamente13,14. As células ciliadas externas e internas desempenham diferentes funções. As células ciliadas externas alteram rapidamente seu comprimento e rigidez em resposta a mudanças no potencial de membrana e são transduzidas para as células ciliadas internas. A prestatina é uma proteína motora das células ciliadas externas, enquanto a Slc17a8 (vGlut3) é expressa especificamente em IHQ e pode ser utilizada para distinguir células ciliadas internas in vitro15,16,17,18.
Em comparação com culturas orgânicas, a morfologia das células ciliadas muda significativamente nas culturas primárias de células ciliadas, resultando em diferentes morfologias e funções de mecanotransdução. Culturas orgânicas são culturas de células primárias tridimensionais que exibem padrões celulares estereotipados, polaridade, formação de feixes de cabelo e conexões neurais dentro dos órgãos de Corti. Em contraste, as células primárias do HEI-OC1 têm uma forma poligonal típica e crescem planas através da aderência estática em um ambiente de cultura bidimensional19. Culturas orgânicas e células primárias são diretamente isoladas dos tecidos e exibem morfologia celular normal e importantes marcadores relacionados à função. No entanto, ao contrário das células HEI-OC1, que geralmente são altamente proliferativas, mais fáceis de cultivar e transfectar, e podem ser mantidas por décadas, essas células têm uma vida útil finita e capacidade de expansão limitada.
As células primárias têm muitas vantagens em cultura celular. Como as células primárias são obtidas de tecidos do corpo e cultivadas sob condições ideais de crescimento, elas imitam de perto o ambiente de tecido in vivo . O uso de células primárias evita muitas objeções éticas levantadas sobre a experimentação animal e fornece resultados mais relevantes do que as linhagens celulares. Células primárias pré-selecionadas são modelos adequados que representam de perto a sinalização molecular in vivo. Células de diferentes doadores respondem diferentemente às citocinas pró-inflamatórias. Os custos do isolamento e da cultura são frequentemente elevados, embora sejam mais baratos do que os dos modelos animais. Os materiais e animais utilizados na cultura primária de células ciliadas aqui descrita eram simples, seu custo era relativamente baixo e o sistema era de fácil operação. Se as condições ideais de cultura não forem mantidas, as características das células primárias podem mudar com as passagens subsequentes. À medida que o número de passagens aumentava, o estado celular também se enfraqueceu (Figura Suplementar S2). Por serem derivadas diretamente dos tecidos do corpo nativo, sem modificações, as células ciliadas auditivas obtidas mimetizavam de perto seu estado e fisiologia in vivo. Portanto, as células ciliadas primárias fornecem um excelente sistema modelo para o estudo da fisiologia e bioquímica das células ciliadas, incluindo o metabolismo celular e a toxicidade de drogas. Embora as células primárias só possam ser mantidas por alguns dias in vitro, elas podem ser imortalizadas e divididas indefinidamente após a transformação genética para obter linhagens celulares secundárias.
Em conclusão, o protocolo atual descreveu o isolamento das células ciliadas auditivas do osso temporal utilizando microdissecção e desagregação enzimática. Todo o protocolo durou aproximadamente 3 h, desde a dissecção do camundongo até a plaqueamento celular. As células cultivadas foram mantidas em alta pureza e permaneceram saudáveis por 6-7 dias. Apesar das limitações inerentes às culturas primárias de células ciliadas, que se limitam a apenas duas passagens, este protocolo empregou metodologias e materiais simples, apresentando assim um novo caminho para a realização de pesquisas altamente eficientes em células ciliadas cocleares.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 à YG)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
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