Summary
यहां, हम चूहों से प्राथमिक कॉक्लियर बाल कोशिकाओं को अलग करने और संवर्धन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रारंभ में, कोर्टी के अंग को एक माइक्रोस्कोप के तहत नवजात (3-5 दिनों की आयु) मुराइन कोचली से विच्छेदित किया गया था। इसके बाद, कोशिकाओं को एंजाइमेटिक रूप से एकल-कोशिका निलंबन में पचाया गया और संस्कृति में कई दिनों के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके पहचाना गया।
Abstract
कॉक्लियर हेयर कोशिकाएं श्रवण प्रणाली के संवेदी रिसेप्टर्स हैं। ये कोशिकाएं कोर्टी के अंग में स्थित होती हैं, जो सुनने के लिए जिम्मेदार संवेदी अंग है, आंतरिक कान की भूलभुलैया के भीतर। कॉक्लियर हेयर कोशिकाओं में दो शारीरिक और कार्यात्मक रूप से अलग-अलग प्रकार होते हैं: बाहरी और आंतरिक बाल कोशिकाएं। दोनों में से किसी को भी नुकसान होने से सुनने की क्षमता कम हो जाती है। विशेष रूप से, क्योंकि आंतरिक बाल कोशिकाएं पुनर्जीवित नहीं हो सकती हैं, और उन्हें नुकसान स्थायी है। इसलिए, प्राथमिक बाल कोशिकाओं की इन विट्रो खेती कॉक्लियर हेयर कोशिकाओं के सुरक्षात्मक या पुनर्योजी प्रभावों की जांच के लिए अपरिहार्य है। इस अध्ययन का उद्देश्य माउस बाल कोशिकाओं को अलग करने और खेती करने के लिए एक विधि की खोज करना था।
कॉक्लियर लेटरल वॉल को मैन्युअल रूप से हटाने के बाद, श्रवण उपकला को माइक्रोस्कोप के तहत कॉक्लियर मोडियोलस से सावधानीपूर्वक विच्छेदित किया गया था, 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए से युक्त मिश्रण में इनक्यूबेट किया गया था, और 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके संस्कृति माध्यम में धीरे से निलंबित कर दिया गया था। सेल निलंबन को एक सेल फिल्टर के माध्यम से पारित किया गया था, छानना सेंट्रीफ्यूज किया गया था, और कोशिकाओं को 24-वेल प्लेटों में सुसंस्कृत किया गया था। बालों की कोशिकाओं की पहचान एक मेकेनोट्रांसडक्शन कॉम्प्लेक्स, मायोसिन-वीआईआईए को व्यक्त करने की उनकी क्षमता के आधार पर की गई थी, जो मोटर तनाव में शामिल है, और फेलोइडिन का उपयोग करके एफ-एक्टिन के चयनात्मक लेबलिंग के माध्यम से। संस्कृति में 4 डी के बाद कोशिकाएं >90% संगम तक पहुंच गईं। यह विधि इन विट्रो सुसंस्कृत बाल कोशिकाओं की जैविक विशेषताओं की हमारी समझ को बढ़ा सकती है और कॉक्लियर हेयर सेल संस्कृतियों की दक्षता का प्रदर्शन कर सकती है, आगे के श्रवण अनुसंधान के लिए एक ठोस पद्धतिगत आधार स्थापित कर सकती है।
Introduction
कॉक्लियर हेयर कोशिकाएं ध्वनि का पता लगाने और श्रवण तंत्रिका को सिग्नल ट्रांसमिशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। बाल कोशिकाएं यांत्रिक कोशिकाएं होती हैं जो प्राथमिक संवेदी रिसेप्टर्स के रूप में कार्य करती हैं और कशेरुक में ध्वनि कंपन को विद्युत संकेतों में परिवर्तित करती हैं। स्तनधारी आंतरिक कान के संवेदी उपकला में आंतरिक बाल कोशिकाओं की एक पंक्ति और बाहरी बाल कोशिकाओं की तीन पंक्तियां शामिल हैं। विभिन्न बुनियादी झिल्ली क्षेत्रों में, बाल कोशिकाएं विभिन्न आवृत्तियों (20 और 2,000 हर्ट्ज के बीच) पर ध्वनियों का अनुभव करती हैं। बाहरी बाल कोशिकाओं का कार्य एक सक्रिय यांत्रिक प्रवर्धन प्रक्रिया है जो स्तनधारी आंतरिक कान को ठीक करने में मदद करती है, ध्वनि के लिए उच्च संवेदनशीलता प्रदान करती है। आंतरिक बाल कोशिकाएं ध्वनियों का पता लगाने के लिए जिम्मेदार होती हैं। वर्गीकृत विध्रुवण के बाद, ध्वनिक जानकारी श्रवण तंत्रिका तंतुओं के माध्यम से मस्तिष्क को प्रेषित कीजाती है।
सुनवाई हानि आनुवंशिक दोषों, उम्र बढ़ने, शोर आघात, या ओटोटॉक्सिक दवाओं के अत्यधिक उपयोग के कारण हो सकती है,जो दुनिया भर में एक प्रमुख स्वास्थ्य चिंता का गठन करती है। सुनवाई हानि मुख्य रूप से बालों की कोशिकाओं को अपरिवर्तनीय क्षति के परिणामस्वरूपहोती है। शोर-प्रेरित सुनवाई हानि के बारे में, हालांकि शोधकर्ता इसके एटियलजि के कई विवरणों पर आम सहमति पर पहुंच गए हैं, कई अंतर्निहित तंत्रों की व्यापक समझ की कमी है। बाहरी बाल कोशिकाएं विशेष रूप से ध्वनिक ओवरएक्सपोजर6 के लिए कमजोर होती हैं। मेकेनोसेंसेटिव कॉक्लियर हेयर कोशिकाएं उम्र से संबंधित सुनवाई हानि में शामिल हैं; हालांकि, बाल कोशिका अध: पतन के अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र अज्ञात रहते हैं। आणविक प्रक्रियाओं में कई बदलाव बालों की कोशिका की उम्र बढ़ने, ऑक्सीडेटिव तनाव, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया, ऑटोफैगी और बाल कोशिका विशेषज्ञता से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति और प्रतिलेखन की विकृति का कारणबनते हैं।
चूंकि आंतरिक कान अस्थायी हड्डी में घिरा हुआ है, शरीर की सबसे कठिन हड्डी में गहरा है, यह प्रयोगात्मक रूप से दुर्गम है, जो बाल कोशिका की मरम्मत और पुनर्जनन के तंत्र में जांच के लिए एक चुनौती पेश करता है। इसलिए, बालों की कोशिकाओं के कार्य की जांच के लिए इन विट्रो संस्कृतियों की स्थापना आंतरिक कान के पुनर्जनन और चोट तंत्र पर शोध के लिए एक आदर्श तरीका बन गया है। कॉक्लियर ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों को तैयार करने की प्रक्रियाओं को पहलेके अध्ययनों 8,9,10 में वर्णित किया गया है। दुनिया भर में जांचकर्ताओं ने विभिन्न कॉक्लियर माइक्रोडिसेक्शन और सतह तैयार करने की तकनीकों को नियोजित किया है। लगातार चुनौतियों के बावजूद, विभिन्न प्राथमिक हेयर सेल कल्चर सिस्टम सफलतापूर्वक विट्रो में स्थापित किए गए हैं। कॉक्लियर ऑर्गन कल्चर में विभिन्न सेल प्रकार होते हैं, जिनमें बाल कोशिकाएं, डीटर्स कोशिकाएं, हेंसेन की कोशिकाएं, स्तंभ कोशिकाएं और श्रवण तंत्रिका फाइबर शामिल हैं। चोट के बाद सेलुलर और आणविक स्तरों पर बालों की कोशिकाओं में परिवर्तन की गहन समझ अधिक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरणों के विकास को सक्षम करेगी। इस अध्ययन का उद्देश्य नवजात चूहों से कॉक्लियर अंगों को अलग करने और इन विट्रो अध्ययनों के लिए प्रचुर मात्रा में बालों की कोशिकाओं को एंजाइमेटिक रूप से अलग करने के कदमों का प्रदर्शन करना था। इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग का उपयोग करके सुसंस्कृत कोशिकाओं की प्रकृति की पुष्टि की गई थी।
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Protocol
जानवरों के उपयोग और देखभाल पर शीआन जियाओतोंग विश्वविद्यालय समिति द्वारा सभी पशु प्रयोगों को (संख्या 2021-847) अनुमोदित किया गया था।
1. नसबंदी और सामग्री तैयार करना
- उच्च तापमान और उच्च दबाव वाले भाप कीटाणुशोधन का उपयोग करके विच्छेदन उपकरणों को निष्फल करें और उन्हें रात भर 50 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सुखाएं।
- 100 एमएल कल्चर माध्यम तैयार करें जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 10 मिलीग्राम / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (10 एमएल एफबीएस और 10 μ एल पेनिसिलिन स्टॉक समाधान को 90 एमएल डलबेकको के संशोधित ईगल मीडियम (ईएमईएम) में जोड़ें) और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
2. श्रवण एपिथेलिया के संग्रह के लिए अस्थायी हड्डी का विच्छेदन और निकालना।
- बर्फ पर सिर काटकर कुल 10 नवजात चूहों (पी 3 और पी 5 के बीच की आयु) की कुल संख्या को इच्छामृत्यु दें। यदि आवश्यक हो, तो एक वैकल्पिक, नैतिक रूप से अनुमोदित पद्धति का उपयोग करें।
- सिर को जगह पर रखें, माइक्रो-ऑपरेटिंग कैंची का उपयोग करके खोपड़ी को खोलें, और उंगलियों के साथ द्विपक्षीय रूप से खोपड़ी को अलग करें और ठीक करें, जैसा कि चित्र 1 ए में दिखाया गया है।
- एक छोटे पेरीओस्टोल लिफ्ट का उपयोग करके मस्तिष्क को हटा दें और बेसल खोपड़ी को विभाजित करें। कैंची से क्रैनियम काटें और खोपड़ी खोलने के लिए आगे की ओर मुड़ें; मस्तिष्क को खुरचने और खोपड़ी के आधार को उजागर करने के लिए कैंची की नोक का उपयोग करें।
- खोपड़ी के आधार पर द्विपक्षीय लौकिक हड्डियों का निरीक्षण करें (चित्रा 1 सी)। मध्य रेखा के साथ खोपड़ी के आधार को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें, त्वचा को खुरचें, और किसी भी अनावश्यक हड्डी को हटा दें (चित्रा 1 डी, डी')।
- अस्थायी हड्डियों को 35 मिमी बाँझ पेट्री व्यंजनों में बनाए रखें और स्थानांतरित करें जिसमें ताजा हैंक का संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) (चित्रा 1 ई) शामिल है।
- अस्थायी हड्डी के पेट्रोस हिस्से से बुल्ला और आसपास के ऊतक को हटाने के लिए दो # 5-नुकीले बल का उपयोग करें (चित्रा 1 ई)।
नोट: इस स्तर पर, चूहों की अस्थायी हड्डी में बोनी भूलभुलैया पूरी तरह से कैल्सीफाइड नहीं होगी और बल का उपयोग करके आसानी से विच्छेदित किया जाएगा। - अस्थायी हड्डी के अर्धवृत्ताकार भाग को ठीक करने के लिए एक हाथ से बल पकड़ें और दूसरे हाथ से बल के निचले पैर को गोल खिड़की के आला में चिपका दें ताकि कोक्लेया की पार्श्व हड्डी को स्काला वेस्टिब्यूल से अलग किया जा सके। ओसी एपिथेलियम को छूने के बिना अस्थायी हड्डी के पेट्रोस हिस्से को सावधानीपूर्वक हटा दें। इसके बाद, कोक्लेया के बोनी भूलभुलैया को बेसल छोर से एपिकल छोर तक सावधानीपूर्वक अलग करें और हटा दें (चित्रा 1 एफ)।
- #5-नुकीले बल (चित्रा 1 जी) का उपयोग करके कोर्टी संवेदी उपकला के अंग को मोडियोलस से सावधानीपूर्वक सूक्ष्म रूप से अलग करें।
- सर्पिल लिगामेंट को पकड़ें, इसे माइक्रो-ऑपरेटिंग फोर्स के साथ स्ट्रिया संवहनी से सावधानीपूर्वक अलग करें, और स्वच्छ श्रवण उपकला को 200 μL पिपेट (चित्रा 1 एच) का उपयोग करके एचबीएसएस युक्त 3 मिमी बाँझ संस्कृति डिश में स्थानांतरित करें।
- प्रत्येक जानवर से 20 नमूने एकत्र करें और जल्दी से उन्हें अगले तैयारी चरण के लिए एचबीएसएस युक्त 100 मिमी बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें (चित्रा 1)।
3. श्रवण बाल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक विघटन।
- श्रवण उपकला को 0.25% ट्रिप्सिन युक्त ताजा डीएमईएम के 10 एमएल में स्थानांतरित करें और 12 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके, धीरे से एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत बेसल लैमिना और अन्य कोशिकाओं से बालों की कोशिकाओं को अलग करें।
- विघटन को रोकने के लिए संस्कृति माध्यम के एक और 10 एमएल जोड़ें।
- 70 μm फ़िल्टर के माध्यम से संस्कृति माध्यम में निलंबित कोशिकाओं को फ़िल्टर करें, छानना को एक साफ 50 mL ट्यूब में इकट्ठा करें, और इसे 5 मिनट के लिए 300 × g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- 1,000 μL पिपेट टिप का उपयोग करके धीरे-धीरे उन्हें ऊपर और नीचे करके संस्कृति माध्यम के कम से कम 5 मिलीलीटर में बालों की कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। बुलबुले पेश करने से बचें।
- पहले से छह-अच्छी प्लेट के नीचे एक कवरस्लिप रखें। कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें छह-वेल प्लेटों में 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर कल्चर करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर डीएमईएम के2 एमएल (एफबीएस के 10%, पेनिसिलिन के 100 यूनिट / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg / mL युक्त) में अनुयायी कोशिकाओं को विकसित करें। हर दिन संस्कृति माध्यम को बदलें।
नोट: यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से शुद्ध बाल कोशिकाएं प्राप्त नहीं होती हैं। इस प्राथमिक सेल कल्चर विधि के आधार पर, हम आगे के अध्ययन के लिए डी 2 या डी 3 कोशिकाओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं, क्योंकि बाल कोशिकाएं संस्कृति में लगभग 70% कोशिकाओं का गठन कर सकती हैं और अच्छी स्थिति में हो सकती हैं।
4. इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला
- सुसंस्कृत कोशिकाओं को डी 1 से डी 6 (प्रति दिन एक कुआं) से काटें। कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें और फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को 2 x कुल्ला करें।
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
- पीबीएस के साथ 3 x 3 मिनट के लिए फिक्सेटिव और कुल्ला कोशिकाओं को हटा दें।
- आरटी पर 10 मिनट के लिए 0.2% ट्राइटन एक्स -100 युक्त पीबीएस के साथ कोशिकाओं को परमेबिलाइज करें।
- आरटी पर 20 मिनट के लिए पीबीएस में 10% एफबीएस से युक्त ब्लॉकिंग समाधान के साथ परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
- एंटी-मायोसिन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (पीबीएस में 1:200 पर पतला) के साथ कोशिकाओं को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर दाग दें।
- कोशिकाओं को बाँझ पीबीएस के साथ 3x धोएं और उन्हें द्वितीयक एंटीबॉडी (एलेक्सा फ्लुर 594 बकरी विरोधी खरगोश MYO7A, पीबीएस में पतला 1:500) और फ्लोरेसिन-लेबल वाले फैलोइडिन (एलेक्सा फ्लुर 488, सेल संरचना की पहचान करने के लिए) के साथ आरटी पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- द्वितीयक एंटीबॉडी को हटाने के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 3x कुल्ला करें।
- स्लाइड्स पर DAPI के साथ माउंटिंग माध्यम की 1-2 बूंदें जोड़ें, कवरलिप्स माउंट करें, और कोशिकाओं की तस्वीरें कैप्चर करने के लिए उन्हें लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
5. सांख्यिकीय विश्लेषण
- समय के साथ मायोसिन-वीआईआईए और फेलोइडिन के ग्रे मूल्यों में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए ट्यूकी के पोस्ट-हॉक परीक्षणों के बाद विचरण (एनोवा) का दो-तरफा विश्लेषण करें। सांख्यिकीय अंतर ों को चिह्नित करने के लिए अक्षर अंकन विधि का उपयोग करें।
- दिन 1 से दिन 6 तक सेल नमूनों के बीच फेलोइडिन-पॉजिटिव सेल अनुपात और उसी दिन मायोसिन-VII-पॉजिटिव सेल अनुपात की तुलना करने के लिए टुकी के पोस्ट-हॉक परीक्षणों के बाद अतिरिक्त एक-तरफ़ा एनोवा करें।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हमने पृथक कोशिकाओं को बीज दिया। प्राथमिक कॉक्लियर हेयर सेल बीज को सफल माना जाता था यदि कोशिकाएं संस्कृति माध्यम में तैरती नहीं थीं और 24 घंटे के भीतर फैल जाती थीं। हमने बालों की कोशिकाओं की संख्या निर्धारित की जब वे पकवान के निचले भाग में सपाट समुच्चय में फैल गए। 1 दिन के बाद, जीवित बाल कोशिकाओं को कल्चर डिश के निचले हिस्से में कसकर पालन किया गया और पीबीएस के साथ कुल्ला करके गैर-अनुयायी कोशिकाओं को हटा दिया गया। आमतौर पर, संस्कृति के 3 डी के बाद कोशिकाओं की संख्या दोगुनी हो जाती है (चित्रा 2)।
इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) ने डी 6 (चित्रा 3 ए) तक मायोसिन-वीआईए और फैलोइडिन की अभिव्यक्ति का खुलासा किया। हमने देखा कि मायोसिन-वीआईआईए ग्रे वैल्यू और पॉजिटिव सेल अनुपात समय के साथ कम हो गया, जबकि फैलोइडिन ग्रे वैल्यू और पॉजिटिव सेल अनुपात कल्चर के बाद डी 1 की तुलना में समान रहा (चित्रा 3 बी-डी)। हमने यह सत्यापित करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक कार्बनिक संस्कृति का उपयोग किया कि मायोसिन-वीआईए-पॉजिटिव कोशिकाएं वास्तव में बाल कोशिकाएं थीं। पूरक चित्रा एस 1 2 दिनों की संस्कृति के बाद श्रवण उपकला में मायोसिन-वीआईए (हरा), फैलोइडिन (हरा), और 4'6-डायमिडिनो-2-फेनिलिडोल (डीएपीआई, नीला) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन को दर्शाता है।
आईएफ का उपयोग करते हुए, हमने पुष्टि की कि प्राप्त कोशिकाएं बाल कोशिकाएं थीं। विशेष रूप से, हमने देखा कि अधिकांश सुसंस्कृत कोशिकाओं ने श्रवण सेल मार्कर मायोसिन-वीआईआईए (लाल) प्रोटीन के लिए सकारात्मक धुंधलापन दिखाया, जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 ए) के तहत एक लम्बी उपस्थिति भी प्रदर्शित करता है। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि सुसंस्कृत कोशिकाएं मुख्य रूप से बाल कोशिकाएं थीं।
चित्रा 1: श्रवण एपिथेलिया के संग्रह के लिए अस्थायी हड्डी का विच्छेदन और निकालना। (ए) सीवन के साथ क्रैनियम को हटाना और खोलना; (बी) मस्तिष्क को हटाना। (सी) खोपड़ी के आधार में स्थित द्विपक्षीय लौकिक हड्डियों का दृश्य। ओसी और पीएसडी के साथ चिह्नित अस्थायी हड्डी (डी') के आसपास की हड्डियों और टिफर को हटाने के बाद दाईं अस्थायी हड्डियां (डी)। (ई) अस्थायी हड्डियों को ताजा हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में स्थानांतरित करना, स्टेप्स को हटा दें और अंडाकार खिड़की के साथ रखें। (एफ) कोक्लेया के बोनी भूलभुलैया को बेसल से एपिकल छोर तक सावधानीपूर्वक अलग और हटा दें। कोर्टी संवेदी उपकला (जी) का अंग स्ट्रिया संवहनी का पालन करता है, (एच) स्ट्रिया संवहनी से अलग होता है। स्केल सलाखों = 1,000 μm (C-H)। संक्षेप: ओसी = कोर्टी का अंग; पीएसडी = पश्चवर्ती अर्धवृत्ताकार नहर; एसवी = स्ट्रिया संवहनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: संवर्धन के 4 दिन बाद बालों की कोशिकाएं। संवर्धन के 4 दिन बाद हल्की सूक्ष्म परीक्षा। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके बाल कोशिका सतह मार्करों का पता लगाना । (ए) मायोसिन-वीआईए (लाल), फेलोइडिन (हरा), और डीएपीआई (नीला) इम्यूनोफ्लोरेसेंस सेल कल्चर के बाद दिन 1 से दिन 6 तक धुंधला हो जाता है। (बी, सी) मायोसिन-वीआईए और फेलोइडिन का ग्रे मूल्य विश्लेषण; सांख्यिकीय अंतर अक्षरों द्वारा इंगित किए जाते हैं। (डी) दिन 1 से दिन 6 तक सेल नमूनों और उसी दिन मायोसिन-VII के बीच फेलोइडिन-पॉजिटिव सेल अनुपात की तुलना। बड़े अक्षर फेलोइडिन के लिए सांख्यिकीय परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि छोटे अक्षर मायोसिन-वीआईआईए के लिए सांख्यिकीय परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा को माध्य ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। एन = 5; स्केल बार = 50 μm। मायोसिन-वीआईआईए और फेलोइडिन के ग्रे वैल्यू विश्लेषण के लिए ट्यूकी के पोस्ट हॉक परीक्षण के बाद विचरण (एनोवा) का दो-तरफा विश्लेषण किया गया था। डी 1 से डी 6 तक सेल नमूनों के बीच फेलोइडिन और मायोसिन-VII-पॉजिटिव सेल अनुपात की तुलना के लिए वन-वे एनोवा का प्रदर्शन किया गया था। विभिन्न अक्षर फैलोइडिन धुंधला होने में सांख्यिकीय अंतर का संकेत देते हैं, जबकि छोटे अक्षर मायोसिन-वीआईआईए धुंधला होने में सांख्यिकीय अंतर का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा एस 1: कार्बनिक संस्कृति में बाल कोशिका सतह मार्करों का इम्यूनोफ्लोरेसेंस पता लगाना। मायोसिन-वीआईए (हरा), फैलोइडिन (हरा), और डीएपीआई (नीला) का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना कार्बनिक संस्कृति के डी 2 पर किया गया था। स्केल बार = 10 μm। संक्षेप: आईएचसी, आंतरिक बाल कोशिका; ओएचसी, बाहरी बाल कोशिका; DAPI, 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा एस 2: पारित बाल कोशिकाओं में सतह मार्करों का इम्यूनोफ्लोरेसेंस पता लगाना। (ए) मायोसिन-वीआईआईए (लाल), फेलोइडिन (हरा), और डीएपीआई (नीला) का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन मार्ग 2 और 3 में कार्बनिक संस्कृतियों पर किया गया था। (बी) फैलोइडिन-पॉजिटिव कोशिकाओं, मायोसिन-वीआईआईए-पॉजिटिव कोशिकाओं और प्राथमिक कोशिकाओं से कुल कोशिकाओं की संख्या की तुलना 3। एन = 3; स्केल बार = 100 μm। डेटा को मानक विचलन के औसत ± रूप में दिखाया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
एचईआई-ओसी 1 सेल लाइन की तुलना में, बाल कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृतियों ने विवो में कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति को अधिक सटीक रूप से दोहराया। इसलिए, कोक्लियर अंगों से जीवित कोशिकाओं को अलग करके स्थापित श्रवण प्राथमिक संस्कृति विधि और तुरंत उन्हें संवर्धन श्रवण प्रणालियों पर व्यापक शोध के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रतीत होता है। एक सफल संस्कृति के लिए कुछ तकनीकें महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, अस्थायी हड्डी से कोर्टी के अंग के पृथक्करण की अवधि को कम करने से बाल कोशिकाओं की निरंतर गतिविधि की संभावना बढ़ जाती है। नतीजतन, शोधकर्ताओं के लिए पीबीएस में अंगों के विच्छेदन और विसर्जन के बीच समय अंतराल को कम करना अनिवार्य है। हमारे प्रयोगात्मक अवलोकनों के आधार पर, लगभग 2-3 घंटे की अवधि 10 चूहों को विच्छेदित करने और एक समय में 20 आंतरिक कान प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है। एंजाइमेटिक विघटन प्रक्रिया के दौरान, अवधि को 12 मिनट तक सीमित करने और 8 मिनट की इनक्यूबेशन अवधि के बाद कॉक्लियर अंगों को पिपेट में स्थानांतरित करने की सलाह दी जाती है। अंगों को लगभग 10 पाइपिंग चक्रों के बाद एक माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था, और एंजाइमेटिक विघटन को रोक दिया गया था जब लगभग सभी कोशिकाएं बेसिलर झिल्ली से अलग हो गई थीं। अन्यथा, अंगों को एक और 4 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस कर दिया गया था। एंटीबायोटिक का चुनाव भी महत्वपूर्ण है। हम संभावित संदूषण समस्याओं को रोकने के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन का उपयोग करने की सलाह देते हैं क्योंकि कुछ एमिनोग्लाइकोसाइड एंटीबायोटिक्स ओटोटॉक्सिक हो सकते हैं और बाल कोशिका मृत्यु का कारण बन सकते हैं।
यद्यपि कक्षा VII मायोसिन व्यापक रूप से जानवरों के ऊतकों में व्यक्त किए जाते हैं, मायोसिन-VIIA केवल आंतरिक कान के वेस्टिबुलर और कॉक्लियर अंगों की बाल कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। वर्ग VIIA मायोसिन स्टीरियोसिलिया संरचना को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, क्योंकि वेबाल कोशिकाओं में टखने के लिंक क्षेत्र में स्टीरियोसिलिया को इंटरकनेक्ट करने में मदद करते हैं। प्राथमिक सेल संस्कृति की अवधि और सेल मार्ग की संख्या में वृद्धि के बाद, मायोसिन-वीआईआईए का क्षरण भी समय के साथ बढ़ गया, जबकि फेलोइडिन स्थिर रहा, यह दर्शाता है कि श्रवण कोशिकाओं का कार्य समय के साथ कम हो गया। इस प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमा यह है कि श्रवण कोशिकाओं का उपयोग केवल 6-7 दिनों के भीतर किया जा सकता है और एचईआई-ओसी 1 कोशिकाओं12 की तुलना में बढ़ने में अधिक समय लगता है। इसके अलावा, यह अपरिहार्य है कि प्राथमिक कोशिकाएं अंततः कमजोर हो जाती हैं और मर जाती हैं, सीमित विकास क्षमता का प्रदर्शन करती हैं। इसके अलावा, बाल कोशिका अलगाव और संवर्धन की समय और आर्थिक लागत अक्सर अधिक होती है और व्यापक विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। कोर्टी के अंग में विभिन्न प्रकार की न्यूरोसेंसरी कोशिकाएं होती हैं, जिनमें आंतरिक बाल, बाहरी बाल और सहायक कोशिकाएं शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल ने इन कोशिकाओं को विट्रो में अलग करने और संवर्धन करने के लिए एक विधि पेश की। प्राथमिक कोशिकाओं को क्रमशः13,14 मायोसिन-वीआईआईए और एसओएक्स 2 के लिए धुंधला करके बालों और सहायक कोशिकाओं के बीच अलग किया जा सकता है। बाहरी और आंतरिक बाल कोशिकाएं अलग-अलग कार्य करती हैं। बाहरी बाल कोशिकाएं झिल्ली क्षमता में परिवर्तन के जवाब में अपनी लंबाई और कठोरता को तेजी से बदलती हैं और आंतरिक बाल कोशिकाओं में स्थानांतरित हो जाती हैं। प्रेस्टिन बाहरी बाल कोशिकाओं का एक मोटर प्रोटीन है, जबकि एसएलसी 17 ए 8 (vGlut3) विशेष रूप से IHCs में व्यक्त किया जाता है और इसका उपयोग विट्रो15,16,17,18 में आंतरिक बाल कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जा सकता है।
कार्बनिक संस्कृतियों की तुलना में, प्राथमिक बाल कोशिका संस्कृतियों में बाल कोशिकाओं की आकृति विज्ञान में काफी बदलाव होता है, जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न आकृति विज्ञान और मेकेनोट्रांसडक्शन कार्य होते हैं। कार्बनिक संस्कृतियां त्रि-आयामी प्राथमिक कोशिका संस्कृतियां हैं जो कोर्टी के अंगों के भीतर रूढ़िवादी सेलुलर पैटर्निंग, ध्रुवीयता, बाल बंडल गठन और तंत्रिका कनेक्शन प्रदर्शित करती हैं। इसके विपरीत, प्राथमिक एचईआई-ओसी 1 कोशिकाओं में एक विशिष्ट बहुभुज आकार होता है और दो-आयामीसंस्कृति वातावरण में स्थिर पालन के माध्यम से सपाट बढ़ता है। कार्बनिक संस्कृतियों और प्राथमिक कोशिकाओं को सीधे ऊतकों से अलग किया जाता है और सामान्य कोशिका आकृति विज्ञान और महत्वपूर्ण कार्य-संबंधित मार्करों का प्रदर्शन किया जाता है। हालांकि, एचईआई-ओसी 1 कोशिकाओं के विपरीत, जो आम तौर पर अत्यधिक प्रोलिफ़ेरेटिव, संस्कृति और ट्रांसफ़ेक्ट करने में आसान होते हैं, और दशकों तक बनाए रखे जा सकते हैं, इन कोशिकाओं में एक सीमित जीवनकाल और सीमित विस्तार क्षमता होती है।
सेल कल्चर में प्राथमिक कोशिकाओं के कई फायदे हैं। चूंकि प्राथमिक कोशिकाओं को शरीर के ऊतकों से प्राप्त किया जाता है और इष्टतम विकास स्थितियों के तहत सुसंस्कृत किया जाता है, वे विवो ऊतक वातावरण में बारीकी से नकल करते हैं। प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग पशु प्रयोग के बारे में उठाए गए कई नैतिक आपत्तियों से बचता है और सेल लाइनों की तुलना में अधिक प्रासंगिक परिणाम प्रदान करता है। पूर्वचयनित प्राथमिक कोशिकाएं पर्याप्त मॉडल हैं जो विवो में आणविक सिग्नलिंग का बारीकी से प्रतिनिधित्व करती हैं। विभिन्न दाताओं की कोशिकाएं प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स के लिए अलग-अलग प्रतिक्रिया देती हैं। अलगाव और संस्कृति की लागत अक्सर अधिक होती है, हालांकि वे पशु मॉडल की तुलना में कम महंगे होते हैं। यहां वर्णित प्राथमिक बाल कोशिका संस्कृति में उपयोग की जाने वाली सामग्री और जानवर सरल थे, उनकी लागत अपेक्षाकृत कम थी, और सिस्टम को संचालित करना आसान था। यदि इष्टतम संस्कृति की स्थिति बनाए नहीं रखी जाती है, तो प्राथमिक कोशिकाओं की विशेषताएं बाद के अंशों के साथ बदल सकती हैं। जैसे-जैसे मार्ग की संख्या में वृद्धि हुई, कोशिका अवस्था भी कमजोर हो गई (पूरक चित्रा एस 2)। चूंकि वे संशोधन के बिना सीधे देशी शरीर के ऊतकों से प्राप्त किए गए थे, प्राप्त श्रवण बाल कोशिकाओं ने विवो अवस्था और शरीर विज्ञान में बारीकी से नकल की। इसलिए, प्राथमिक बाल कोशिकाएं कोशिका चयापचय और दवा विषाक्तता सहित बाल कोशिकाओं के शरीर विज्ञान और जैव रसायन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली प्रदान करती हैं। यद्यपि प्राथमिक कोशिकाओं को विट्रो में केवल कुछ दिनों के लिए बनाए रखा जा सकता है, लेकिन द्वितीयक सेल लाइनों को प्राप्त करने के लिए आनुवंशिक परिवर्तन के बाद उन्हें अमर और अनिश्चित काल तक विभाजित किया जा सकता है।
निष्कर्ष में, वर्तमान प्रोटोकॉल ने माइक्रोडिसेक्शन और एंजाइमेटिक विघटन का उपयोग करके अस्थायी हड्डी से श्रवण बाल कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन किया। माउस विच्छेदन से सेल प्लेटिंग तक पूरे प्रोटोकॉल में लगभग 3 घंटे लगे। सुसंस्कृत कोशिकाओं को उच्च शुद्धता पर बनाए रखा गया और 6-7 दिनों तक स्वस्थ रखा गया। प्राथमिक बाल कोशिका संस्कृतियों की अंतर्निहित सीमाओं के बावजूद, जो केवल दो अंशों तक ही सीमित हैं, इस प्रोटोकॉल ने सरल पद्धतियों और सामग्रियों को नियोजित किया, जिससे कॉक्लियर हेयर कोशिकाओं पर अत्यधिक कुशल अनुसंधान करने के लिए एक नया अवसर प्रस्तुत किया गया।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (वाईजी के 82101224 एनएफएससी द्वारा समर्थित किया गया था)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
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