Yenidoğan Farelerden Primer Koklear Saç Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü
Summary
Burada, farelerden birincil koklear saç hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta, Corti’nin organı yenidoğan (3-5 günlük) murin koklealarından mikroskop altında diseke edildi. Daha sonra, hücreler enzimatik olarak tek hücreli bir süspansiyona sindirildi ve kültürde birkaç gün sonra immünofloresan kullanılarak tanımlandı.
Abstract
Koklear tüy hücreleri, işitsel sistemin duyusal reseptörleridir. Bu hücreler, iç kulağın kemik labirenti içinde, işitmeden sorumlu duyu organı olan Corti’nin organında bulunur. Koklear saç hücreleri, anatomik ve fonksiyonel olarak farklı iki tipten oluşur: dış ve iç tüy hücreleri. Bunlardan herhangi birinin hasar görmesi işitme kaybına neden olur. Özellikle, iç saç hücreleri yenilenemediğinden ve onlara verilen hasar kalıcıdır. Bu nedenle, birincil saç hücrelerinin in vitro olarak yetiştirilmesi, koklear saç hücrelerinin koruyucu veya yenileyici etkilerini araştırmak için vazgeçilmezdir. Bu çalışma, fare kılı hücrelerini izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem keşfetmeyi amaçladı.
Koklear lateral duvarın manuel olarak çıkarılmasından sonra, işitsel epitel koklear modiolden mikroskop altında titizlikle diseke edildi, 37 °C’de 10 dakika boyunca %0.25 tripsin-EDTA’dan oluşan bir karışım içinde inkübe edildi ve 200 μL’lik bir pipet ucu kullanılarak kültür ortamında hafifçe süspanse edildi. Hücre süspansiyonu bir hücre filtresinden geçirildi, süzüntü santrifüj edildi ve hücreler 24 oyuklu plakalarda kültürlendi. Saç hücreleri, motor gerilimlerde yer alan bir mekanotransdüksiyon kompleksi olan miyozin-VIIa’yı eksprese etme kapasitelerine ve falloidin kullanılarak F-aktinin seçici etiketlenmesine dayalı olarak tanımlandı. Hücreler kültürde 4 gün sonra% >90 birleşmeye ulaştı. Bu yöntem, in vitro kültürlenmiş saç hücrelerinin biyolojik özellikleri hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir ve koklear saç hücresi kültürlerinin etkinliğini göstererek daha ileri işitsel araştırmalar için sağlam bir metodolojik temel oluşturabilir.
Introduction
Koklear tüy hücreleri, sesin algılanmasında ve işitme sinirine sinyal iletiminde önemli rol oynar. Saç hücreleri, omurgalılarda birincil duyu reseptörleri olarak işlev gören ve ses titreşimlerini elektrik sinyallerine dönüştüren mekanik hücrelerdir. Memeli iç kulağının duyusal epiteli, tek sıra iç tüy hücresi ve üç sıra dış tüy hücresi içerir. Farklı bazik zar bölgelerinde, tüy hücreleri sesleri farklı frekanslarda (20 ila 2.000 Hz arasında) algılar1. Dış tüy hücrelerinin işlevi, memeli iç kulağına ince ayar yapmaya yardımcı olan ve sese karşı yüksek hassasiyet sağlayan aktif bir mekanik amplifikasyon işlemidir. İç tüy hücreleri sesleri algılamaktan sorumludur. Dereceli depolarizasyondan sonra, akustik bilgi işitsel sinir lifleri yoluyla beyne iletilir2.
İşitme kaybı, dünya çapında önemli bir sağlık sorunu oluşturan genetik kusurlar, yaşlanma, gürültü travması veya ototoksik ilaçların aşırı kullanımından kaynaklanabilir 3,4. İşitme kaybı esas olarak saç hücrelerinde geri dönüşü olmayan hasardan kaynaklanır5. Gürültüye bağlı işitme kaybı ile ilgili olarak, araştırmacılar etiyolojisinin çeşitli ayrıntıları üzerinde fikir birliğine varmış olsalar da, altta yatan çok sayıda mekanizmanın kapsamlı bir şekilde anlaşılması eksiktir. Dış tüy hücreleri, akustik aşırı maruz kalmaya karşı özellikle savunmasızdır6. Mekanosensitif koklear tüy hücreleri yaşa bağlı işitme kaybında rol oynar; Bununla birlikte, saç hücresi dejenerasyonunun altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmalar bilinmemektedir. Moleküler süreçlerdeki çeşitli değişiklikler, saç hücresi yaşlanmasına, oksidatif strese, DNA hasar tepkisine, otofajiye ve saç hücresi uzmanlığı ile ilgili genlerin ekspresyonunun ve transkripsiyonunun düzensizliğine yol açar7.
İç kulak, vücudun en sert kemiğinin derinliklerinde, temporal kemikle kaplı olduğundan, deneysel olarak erişilemez ve tüylü hücre onarımı ve rejenerasyonu mekanizmalarına ilişkin araştırmalara meydan okur. Bu nedenle, saç hücrelerinin işlevini araştırmak için in vitro kültürlerin oluşturulması, iç kulağın yenilenme ve yaralanma mekanizmalarının araştırılması için ideal bir yöntem haline gelmiştir. Koklear organotipik kültürlerin hazırlanmasına yönelik prosedürler daha önceki çalışmalardatanımlanmıştır 8,9,10. Dünya çapındaki araştırmacılar çeşitli koklear mikrodiseksiyon ve yüzey hazırlama teknikleri kullanmışlardır. Kalıcı zorluklara rağmen, çeşitli birincil saç hücresi kültürü sistemleri in vitro olarak başarıyla kurulmuştur. Koklear organ kültürleri, tüy hücreleri, Deiter hücreleri, Hensen hücreleri, sütun hücreleri ve işitsel sinir lifleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri içerir. Yaralanma sonrası hücresel ve moleküler seviyelerde saç hücrelerindeki değişikliklerin derinlemesine anlaşılması, daha güçlü araştırma araçlarının geliştirilmesini sağlayacaktır. Bu çalışma, in vitro çalışmalar için yenidoğan farelerden koklear organları izole etme ve bol miktarda tüy hücrelerini enzimatik olarak ayırma adımlarını göstermeyi amaçladı. Kültürlenen hücrelerin doğası, immünofloresan boyama kullanılarak doğrulandı.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEI-OC1 hücre hattı ile karşılaştırıldığında, saç hücrelerinin birincil kültürleri, hücrelerin fizyolojik durumunu in vivo olarak daha doğru bir şekilde kopyaladı. Bu nedenle, canlı hücrelerin koklear organlardan izole edilmesi ve hemen kültüre edilmesiyle oluşturulan işitsel birincil kültür yöntemi, işitsel sistemler üzerine kapsamlı araştırmalar için değerli bir araç gibi görünmektedir. Başarılı bir kültür için belirli teknikler çok önemlidir. İlk olarak, Corti organının …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NFSC 82101224 to YG) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
- Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
- Nieman, C. L., Oh, E. S. Hearing Loss. Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).
- Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).
- Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
- Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).
- Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
- Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).
- Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).
- Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
- Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046 (2017).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
- Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
