Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll for isolering og dyrking av primære cochleære hårceller fra mus. I utgangspunktet ble organet til Corti dissekert fra neonatal (alder 3-5 dager) murine cochleae under et mikroskop. Deretter ble cellene enzymatisk fordøyd til en enkeltcellesuspensjon og identifisert ved hjelp av immunfluorescens etter flere dager i kultur.
Abstract
Cochleære hårceller er sensoriske reseptorer i hørselssystemet. Disse cellene befinner seg i Corti-organet, det sensoriske organet som er ansvarlig for hørsel, i den øseøse labyrinten i det indre øret. Cochleære hårceller består av to anatomisk og funksjonelt distinkte typer: ytre og indre hårceller. Skader på en av dem resulterer i hørselstap. Spesielt ettersom indre hårceller ikke kan regenerere, og skade på dem er permanent. Derfor er in vitro-dyrking av primære hårceller uunnværlig for å undersøke den beskyttende eller regenerative effekten av cochleære hårceller. Denne studien hadde som mål å oppdage en metode for å isolere og dyrke musehårceller.
Etter manuell fjerning av cochleær sidevegg ble det auditive epitelet omhyggelig dissekert fra cochlear modiolus under et mikroskop, inkubert i en blanding bestående av 0,25 % trypsin-EDTA i 10 minutter ved 37 °C, og forsiktig suspendert i dyrkningsmedium ved hjelp av en 200 μL pipettespiss. Cellesuspensjonen ble ført gjennom et cellefilter, filtratet ble sentrifugert, og celler ble dyrket i 24-brønnsplater. Hårceller ble identifisert basert på deres evne til å uttrykke et mekanotransduksjonskompleks, myosin-VIIa, som er involvert i motoriske spenninger, og via selektiv merking av F-aktin ved bruk av falloidin. Celler nådde >90% sammenløp etter 4 d i kultur. Denne metoden kan forbedre vår forståelse av de biologiske egenskapene til in vitro-dyrkede hårceller og demonstrere effektiviteten til cochleære hårcellekulturer, og etablere et solid metodologisk grunnlag for videre auditiv forskning.
Introduction
Cochleære hårceller spiller viktige roller i lyddeteksjon og signaloverføring til hørselsnerven. Hårceller er mekanistiske celler som fungerer som primære sensoriske reseptorer og konverterer lydvibrasjoner til elektriske signaler hos virveldyr. Det sensoriske epitelet i det pattedyrs indre øre består av en enkelt rad med indre hårceller og tre rader med ytre hårceller. I forskjellige grunnleggende membranområder oppfatter hårceller lyder ved forskjellige frekvenser (mellom 20 og 2000 Hz)1. Funksjonen til ytre hårceller er en aktiv mekanisk forsterkningsprosess som hjelper til med å finjustere pattedyrets indre øre, noe som gir høy følsomhet for lyd. Indre hårceller er ansvarlige for å oppdage lyder. Etter gradert depolarisering overføres akustisk informasjon til hjernen gjennom hørselsnervefibrene2.
Hørselstap kan være forårsaket av genetiske defekter, aldring, støytraumer eller overdreven bruk av ototoksiske stoffer, som utgjør et stort helseproblem over hele verden 3,4. Hørselstap skyldes hovedsakelig irreversibel skade på hårceller5. Når det gjelder støyindusert hørselstap, selv om forskere har nådd enighet om flere detaljer i etiologien, mangler en omfattende forståelse av de mange underliggende mekanismene. Ytre hårceller er spesielt utsatt for akustisk overeksponering6. Mekanosensitive cochleahårceller er involvert i aldersrelatert hørselstap; Imidlertid forblir de molekylære og cellulære mekanismene som ligger til grunn for hårcelledegenerasjon ukjente. Flere endringer i molekylære prosesser fører til hårcellenes aldring, oksidativt stress, DNA-skaderespons, autofagi og dysregulering av uttrykk og transkripsjon av gener relatert til hårcellespesialisering7.
Siden det indre øret er innkapslet i tinningbenet, dypt i kroppens hardeste bein, er det eksperimentelt utilgjengelig, noe som utgjør en utfordring for undersøkelser av mekanismene for reparasjon og regenerering av hårceller. Derfor har etablering av in vitro-kulturer for å undersøke funksjonen til hårceller blitt en ideell metode for forskning på regenererings- og skademekanismer i det indre øret. Prosedyrene for fremstilling av cochleære organotypiske kulturer er beskrevet i tidligere studier 8,9,10. Forskere over hele verden har benyttet ulike cochleamikrodisseksjons- og overflatebehandlingsteknikker. Til tross for vedvarende utfordringer, har ulike primære hårcellekultursystemer blitt vellykket etablert in vitro. Cochleære organkulturer inneholder forskjellige celletyper, inkludert hårceller, Deiters-celler, Hensens celler, søyleceller og auditive nervefibre. En grundig forståelse av endringene i hårceller på cellulært og molekylært nivå etter skade vil muliggjøre utvikling av kraftigere forskningsverktøy. Denne studien hadde som mål å demonstrere trinnene for å isolere cochleaorganer fra nyfødte mus og enzymatisk løsne de rikelige hårcellene for in vitro-studier. Naturen til de dyrkede cellene ble bekreftet ved hjelp av immunfluorescensfarging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent (nr. 2021-847) av Xi'an Jiaotong University Committee on the Use and Care of Animals.
1. Sterilisering og materialforberedelse
- Steriliser disseksjonsverktøyene med desinfeksjon med høy temperatur og høytrykksdamp og tørk dem i en 50 °C inkubator over natten.
- Tilbered 100 ml av dyrkningsmediet som inneholder 10 % fosterbovint serum (FBS) og 10 mg/ml penicillin/streptomycin (tilsett 10 ml FBS og 10 μL penicillinoppløsning til 90 ml Dulbeccos modifiserte ørnemedium (EMEM)) på forhånd og oppbevar ved 4 °C.
2. Disseksjon og fjerning av tinningbenet for innsamling av auditiv epitel
- Avlive totalt 10 nyfødte mus (i alderen mellom P3 og P5) ved halshugging på is. Bruk en alternativ, etisk godkjent metodikk, om nødvendig.
- Hold hodet på plass, åpne hodebunnen langs sagittalsuturen med mikrooperasjonssaks, og separer og fest hodebunnen bilateralt med fingrene, som vist i figur 1A.
- Fjern hjernen ved hjelp av en liten periosteal heis og kryss basalskallen. Klipp kraniet med saks og vipp fremover for å åpne skallen; Bruk spissen av saksen til å skrape hjernen og avsløre bunnen av skallen.
- Observer de bilaterale temporale beinene ved skallebunnen (figur 1C). Bruk saks til å kutte bunnen av skallen langs midtlinjen, skrape bort huden og fjerne unødvendig bein (figur 1D, D ').
- Behold og overfør tinningbenene til 35 mm sterile petriskåler som inneholder fersk Hanks balanserte saltløsning (HBSS) (figur 1E).
- Bruk to #5-spisse tanger for å fjerne bulla og omkringliggende vev fra petrousdelen av tinningbeinet (figur 1E).
MERK: På dette stadiet ville den benete labyrinten i musens temporale bein ikke være fullstendig forkalket og ville lett bli dissekert ved hjelp av tang. - Hold tangen med den ene hånden for å feste den halvcirkelformede delen av tinningbenet og stikk tangens nedre fot inn i den runde vindusnisjen med den andre hånden for å skille sidebenet i sneglehuset fra scala vestibylen. Fjern forsiktig petrousdelen av tinningbenet uten å berøre OC-epitelet. Deretter separeres og fjernes den benete labyrinten av cochlea forsiktig fra den basale enden til den apikale enden (figur 1F).
- Mikroisoler organet til Corti sensorisk epitel forsiktig fra modiolusen ved hjelp av #5-spiss tang (figur 1G).
- Hold spiralligamentet, skill det forsiktig fra stria vascularis med mikrobetjeningstang, og overfør det rene øreepitelet til en 3 mm steril dyrkningsfat inneholdende HBSS ved hjelp av en 200 μL pipette (figur 1H).
- Samle 20 prøver fra hvert dyr og overfør dem raskt til en 100 mm steril petriskål inneholdende HBSS for neste tilberedningstrinn (figur 1).
3. Enzymatisk disaggregering for å oppnå auditive hårceller
- Overfør hørselsepitelet til 10 ml fersk DMEM inneholdende 0,25 % trypsin og inkuber ved 37 °C i 12 minutter.
- Bruk en 200 μL pipettespiss til å skille hårcellene forsiktig fra lamina basal lamina og andre celler under et operasjonsmikroskop.
- Tilsett ytterligere 10 ml kulturmedium for å hemme disaggregeringen.
- Filtrer de suspenderte cellene i kulturmediet gjennom et 70 μm filter, samle filtratet i et rent 50 ml rør og sentrifuge det ved 300 × g i 5 minutter.
- Resuspender hårcellene i minst 5 ml kulturmedium ved å pipette dem forsiktig opp og ned med en 1000 μL pipettespiss. Unngå å introdusere bobler.
- Plasser en dekselslip i bunnen av en seks-brønnplate på forhånd. Telle cellene og dyrke dem med en tetthet på 106 celler / ml i seks brønnplater.
- Dyrk de adherente cellene i 2 ml DMEM (inneholdende 10% FBS, 100 enheter / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin) ved 37 ° C og 5% CO2. Endre kulturmediet hver dag.
MERK: Det bør nevnes at bruk av denne protokollen ikke resulterer i å skaffe rene hårceller. Basert på denne primære cellekulturmetoden anbefaler vi å bruke d2- eller d3-celler for videre studier, da hårceller kan utgjøre omtrent 70% av cellene i kultur og være i god tilstand.
4. Immunfluorescerende farging
- Høst de dyrkede cellene fra d1 til d6 (en brønn per dag). Aspirer kulturmediet og skyll cellene 2x med fosfatbufret saltvann (PBS).
- Fest celler med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur (RT).
- Fjern fikseringsmiddelet og skyll cellene i 3 x 3 min med PBS.
- Permeabiliser cellene med PBS som inneholder 0,2% Triton X-100 i 10 minutter ved RT.
- Inkuber de permeabiliserte cellene med en blokkeringsløsning bestående av 10% FBS i PBS i 20 minutter ved RT.
- Flekk cellene med anti-myosin monoklonalt antistoff (fortynnet ved 1:200 i PBS) ved 4 °C over natten.
- Vask cellene 3x med steril PBS og inkuber dem med sekundært antistoff (Alexa Fluor 594 geit antikanin MYO7A, fortynnet 1:500 i PBS) og fluoresceinmerket falloidin (Alexa Fluor 488, for å identifisere cellestruktur) i 2 timer ved RT.
- Skyll cellene 3x med PBS for å fjerne sekundære antistoffer.
- Legg 1-2 dråper monteringsmedium med DAPI på lysbildene, monter dekslene og plasser dem under et laserskanning konfokalmikroskop for å ta bilder av cellene.
5. Statistisk analyse
- Utfør toveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukeys post hoc-tester for å analysere endringene i de grå verdiene til myosin-VIIa og falloidin over tid. Bruk bokstavmerkingsmetoden til å markere statistiske forskjeller.
- Utfør ytterligere enveis ANOVAer etterfulgt av Tukeys post-hoc-tester for å sammenligne det falloidin-positive celleforholdet mellom celleprøver fra dag 1 til dag 6 og myosin-VII-positive celleforhold på de samme dagene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter denne protokollen sådde vi de isolerte cellene. Primære cochleære hårcellefrø ble ansett som vellykkede hvis cellene ikke fløt i kulturmediet og spredte seg innen 24 timer. Vi bestemte antall hårceller etter at de festet seg og spredte seg til flate aggregater i bunnen av fatet. Etter 1 dag ble levende hårceller tett festet til bunnen av dyrkningsskålen og ikke-adherente celler ble fjernet ved skylling med PBS. Vanligvis doblet antall celler etter 3 d kultur (figur 2).
Immunfluorescens (IF) viste uttrykk av myosin-VIIa og falloidin frem til d6 (figur 3A). Vi observerte at grå myosin-VIIa-verdi og positiv celleratio sank med tiden, mens falloidingrå verdi og positiv celleratio var den samme sammenliknet med d1 etter dyrkning (figur 3B-D). Vi brukte en organisk kultur som en positiv kontroll for å verifisere at myosin-VIIa-positive celler faktisk var hårceller. Tilleggsfigur S1 viser immunfluorescensfargingen av myosin-VIIa (grønn), falloidin (grønn) og 4′6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, blå) i hørselsepitelet etter 2 dagers dyrkning.
Ved hjelp av IF, bekreftet vi at de oppnådde cellene var hårceller. Spesielt observerte vi at de fleste dyrkede celler viste positiv farging for hørselscellemarkøren myosin-VIIa (rødt) protein, som også viste et langstrakt utseende under et fluorescensmikroskop (figur 3A). Disse resultatene antydet at de dyrkede cellene hovedsakelig var hårceller.
Figur 1 Disseksjon og fjerning av tinningbenet for innsamling av auditivt epitel. (A) Halshugging og åpning av kraniet langs sagittal sutur; (B) fjerne hjernen. (C) Utsikt over de bilaterale temporale beinene som ligger i skallebasen. Høyre tinningbein (D) etter fjerning av bein og tissurer rundt tinningbenet (D') merket med OC og PSD. (E) Overføring av temporale bein til fersk Hanks balanserte saltløsning (HBSS), fjern stiftene og sett med den ovale vindussiden opp. (F) Separer forsiktig og fjern den benete labyrinten i sneglehuset fra den basale til den apikale enden. Corti sensorisk epitel (G) festet seg til stria vascularis, (H) skilt fra stria vascularis. Skalastenger = 1000 μm (C-H). Forkortelser: OC = organ av Corti; PSD = bakre halvcirkelformede kanal; SV = stria vascularis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Hårceller 4 dager etter dyrking. Lysmikroskopisk undersøkelse 4 dager etter dyrking. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Påvisning av hårcelleoverflatemarkører ved hjelp av immunfluorescens. (A) Myosin-VIIa (rød), falloidin (grønn) og DAPI (blå) immunfluorescensfarging fra dag 1 til dag 6 etter cellekultur. (B, C) Gråverdianalyse av myosin-VIIa og falloidin; Statistiske forskjeller er angitt med bokstaver. (D) Sammenligning av falloidin-positiv celleratio mellom celleprøver fra dag 1 til dag 6, og myosin-VII på samme dager. Store bokstaver representerer statistiske resultater for falloidin, mens små bokstaver representerer statistiske resultater for myosin-VIIa. Data presenteres som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet. N = 5; skala bar = 50 μm. Toveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukeys post hoc-test ble utført for gråverdianalyse av myosin-VIIa og falloidin. Enveis ANOVA ble utført for sammenligning av falloidin og myosin-VII-positiv celleratio mellom celleprøver fra d 1 til d 6. Ulike bokstaver indikerer statistiske forskjeller i falloidinfarging, mens små bokstaver indikerer statistiske forskjeller i myosin-VIIa-farging. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: Immunfluorescensdeteksjon av hårcelleoverflatemarkører i organisk kultur. Immunfluorescensfarging av myosin-VIIa (grønn), falloidin (grønn) og DAPI (blå) ble utført på d 2 i organisk kultur. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: IHC, indre hårcelle; OHC, ytre hårcelle; DAPI, 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Påvisning av immunfluorescens av overflatemarkører i passasjerte hårceller. (A) Immunfluorescensfarging av myosin-VIIa (rød), falloidin (grønn) og DAPI (blå) ble utført på organisk kultur i passasje 2 og 3. (B) Sammenligning av antall falloidin-positive celler, myosin-VIIa-positive celler og totale celler fra primære celler til passasje 3. N = 3; skala bar = 100 μm. Data vises som gjennomsnitt ± standardavvik. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med HEI-OC1-cellelinjen, replikerte primære kulturer av hårceller mer nøyaktig den fysiologiske tilstanden til celler in vivo. Derfor synes den auditive primærkulturmetoden etablert ved å isolere levende celler fra cochleaorganer og umiddelbart dyrke dem, å være et verdifullt verktøy for omfattende forskning på hørselssystemer. Visse teknikker er avgjørende for en vellykket kultur. For det første øker minimeringen av separasjonen av Corti-organet fra det tidlige beinet sannsynligheten for vedvarende aktivitet av hårceller. Derfor er det viktig for forskere å minimere tidsintervallet mellom disseksjon og nedsenking av organer i PBS. Basert på våre eksperimentelle observasjoner er en varighet på ca. 2-3 timer tilstrekkelig for å dissekere 10 mus og oppnå de 20 indre ørene om gangen. Under den enzymatiske disaggregeringsprosessen anbefales det å begrense varigheten til 12 minutter og overføre cochleaorganene til pipetter etter en inkubasjonsperiode på 8 minutter. Organene ble observert i mikroskop etter ca. 10 pipetteringssykluser, og den enzymatiske disaggregeringen ble stoppet da nesten alle cellene hadde løsnet fra basilarmembranen. Ellers ble organene returnert til inkubatoren i ytterligere 4 minutter. Valget av antibiotika er også viktig. Vi anbefaler å bruke 10 mg / ml penicillin / streptomycin for å forhindre potensielle forurensningsproblemer fordi noen aminoglykosidantibiotika kan være ototoksiske og føre til hårcelledød.
Selv om klasse VII myosiner er mye uttrykt i animalsk vev, er myosin-VIIa bare uttrykt i hårcellene i vestibulære og cochlear organer i det indre øret alene. Klasse VIIa myosiner spiller en viktig rolle i å opprettholde stereocilia-strukturen, da de bidrar til å koble sammen stereocilia i ankelforbindelsesområdet i hårceller11. Etter en økning i varigheten av den primære cellekulturen og antall cellepassasjer, økte nedbrytningen av myosin-VIIa også over tid, mens falloidin forble stabil, noe som indikerer at hørselscellenes funksjon ble redusert med tiden. Den største begrensningen i denne protokollen er at hørselsceller bare kan brukes innen 6-7 dager og tar lengre tid å vokse enn HEI-OC1-celler12. Videre er det uunngåelig at primære celler til slutt senesce og dø, viser begrenset vekstpotensial. Videre er tiden og de økonomiske kostnadene ved isolering og dyrking av hårceller ofte høye og krever omfattende kompetanse. Cortis organ inneholder en rekke nevrosensoriske celler, inkludert indre hår, ytre hår og støtteceller. Denne protokollen introduserte en metode for separering og dyrking av disse cellene in vitro. Primærceller kan skilles mellom hår og støtteceller ved å farge for myosin-VIIa og Sox2, henholdsvis13,14. Ytre og indre hårceller utfører forskjellige funksjoner. Ytre hårceller endrer raskt lengden og stivheten som respons på endringer i membranpotensialet og blir transdusert til indre hårceller. Prestin er et motorisk protein i de ytre hårcellene, mens Slc17a8 (vGlut3) uttrykkes spesifikt i IHC og kan brukes til å skille indre hårceller in vitro15,16,17,18.
Sammenlignet med organiske kulturer endres morfologien til hårceller betydelig i primære hårcellekulturer, noe som resulterer i forskjellige morfologier og mekanotransduksjonsfunksjoner. Organiske kulturer er tredimensjonale primære cellekulturer som viser stereotyp cellulær mønster, polaritet, hårbuntdannelse og nevrale forbindelser i organene til Corti. I motsetning til dette har primære HEI-OC1-celler en typisk polygonal form og vokser flatt gjennom statisk adherens i et todimensjonalt kulturmiljø19. Organiske kulturer og primære celler er direkte isolert fra vev og utviser normal cellemorfologi og viktige funksjonsrelaterte markører. Imidlertid, i motsetning til HEI-OC1-celler, som generelt er svært proliferative, lettere å dyrke og transfektere, og kan opprettholdes i flere tiår, har disse cellene en endelig levetid og begrenset ekspansjonskapasitet.
Primærceller har mange fordeler i cellekultur. Som primære celler er hentet fra kroppsvev og dyrket under optimale vekstforhold, etterligner de nært in vivo vevsmiljøet. Bruk av primærceller unngår mange etiske innvendinger som reises om dyreforsøk og gir mer relevante resultater enn cellelinjer. Forhåndsvalgte primærceller er tilstrekkelige modeller som nært representerer molekylær signalering in vivo. Celler fra forskjellige donorer reagerer forskjellig på proinflammatoriske cytokiner. Kostnadene ved isolasjon og kultur er ofte høye, selv om de er billigere enn dyremodeller. Materialene og dyrene som ble brukt i den primære hårcellekulturen beskrevet her var enkle, kostnadene var relativt lave, og systemet var enkelt å betjene. Hvis optimale kulturforhold ikke opprettholdes, kan egenskapene til primærcellene endres med etterfølgende passasjer. Etter hvert som antall passeringer økte, ble også celletilstanden svekket (tilleggsfigur S2). Da de ble avledet direkte fra innfødte kroppsvev uten modifikasjon, etterlignet de oppnådde auditive hårcellene deres in vivo tilstand og fysiologi. Derfor gir primære hårceller et utmerket modellsystem for å studere fysiologi og biokjemi av hårceller, inkludert cellemetabolisme og legemiddeltoksisitet. Selv om primære celler bare kan opprettholdes i noen dager in vitro, kan de bli udødeliggjort og delt på ubestemt tid etter genetisk transformasjon for å oppnå sekundære cellelinjer.
Avslutningsvis beskrev den nåværende protokollen isoleringen av auditive hårceller fra tinningbenet ved hjelp av mikrodisseksjon og enzymatisk disaggregering. Hele protokollen tok omtrent 3 timer, fra musedisseksjon til cellebelegg. Dyrket celler ble opprettholdt ved høy renhet og forble sunne i 6-7 dager. Til tross for de iboende begrensningene i primære hårcellekulturer, som er begrenset til bare to passasjer, benyttet denne protokollen enkle metoder og materialer, og presenterte dermed en ny vei for å utføre svært effektiv forskning på cochleære hårceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 til YG)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
- Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
- Nieman, C. L., Oh, E. S.
- Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).
- Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
- Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).
- Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
- Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).
- Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).
- Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
- Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046 (2017).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
- Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
