Summary
Heri præsenterer vi en detaljeret protokol til isolering og dyrkning af primære cochlear hårceller fra mus. Indledningsvis blev Corti-organet dissekeret fra neonatal (i alderen 3-5 dage) murin cochleae under et mikroskop. Derefter blev cellerne enzymatisk fordøjet i en enkeltcellesuspension og identificeret ved anvendelse af immunofluorescens efter flere dage i kultur.
Abstract
Cochlear hårceller er de sensoriske receptorer i det auditive system. Disse celler er placeret i Corti-organet, det sensoriske organ, der er ansvarlig for hørelsen, inden for det indre øres osseøse labyrint. Cochlear hårceller består af to anatomisk og funktionelt forskellige typer: ydre og indre hårceller. Skader på en af dem resulterer i høretab. Især da indre hårceller ikke kan regenerere, og skader på dem er permanente. Derfor er in vitro-dyrkning af primære hårceller uundværlig for at undersøge de beskyttende eller regenerative virkninger af cochlear hårceller. Denne undersøgelse havde til formål at opdage en metode til isolering og dyrkning af musehårceller.
Efter manuel fjernelse af cochlear sidevæggen blev det auditive epitel omhyggeligt dissekeret fra cochlear modiolus under et mikroskop, inkuberet i en blanding bestående af 0,25% trypsin-EDTA i 10 minutter ved 37 °C og forsigtigt suspenderet i dyrkningsmedium ved hjælp af en 200 μL pipettespids. Cellesuspensionen blev ført gennem et cellefilter, filtratet blev centrifugeret, og celler blev dyrket i plader med 24 brønde. Hårceller blev identificeret baseret på deres evne til at udtrykke et mekanotransduktionskompleks, myosin-VIIa, som er involveret i motoriske spændinger, og via selektiv mærkning af F-actin ved hjælp af phalloidin. Celler nåede >90% sammenløb efter 4 d i kultur. Denne metode kan øge vores forståelse af de biologiske egenskaber ved in vitro-dyrkede hårceller og demonstrere effektiviteten af cochlear hårcellekulturer og etablere et solidt metodologisk fundament for yderligere auditiv forskning.
Introduction
Cochlear hårceller spiller vigtige roller i lyddetektering og signaloverførsel til hørenerven. Hårceller er mekanistiske celler, der fungerer som primære sensoriske receptorer og omdanner lydvibrationer til elektriske signaler hos hvirveldyr. Det sensoriske epitel i pattedyrs indre øre består af en enkelt række indre hårceller og tre rækker ydre hårceller. I forskellige grundlæggende membranområder opfatter hårceller lyde ved forskellige frekvenser (mellem 20 og 2.000 Hz)1. Funktionen af ydre hårceller er en aktiv mekanisk forstærkningsproces, der hjælper med at finjustere pattedyrets indre øre, hvilket giver høj følsomhed over for lyd. Indre hårceller er ansvarlige for at detektere lyde. Efter gradueret depolarisering overføres akustisk information til hjernen gennem de auditive nervefibre2.
Høretab kan skyldes genetiske defekter, aldring, støjtraumer eller overdreven brug af ototoksiske lægemidler, som udgør et stort sundhedsproblem på verdensplan 3,4. Høretab skyldes hovedsageligt irreversibel skade på hårceller5. Med hensyn til støjinduceret høretab, selvom forskere er nået til enighed om flere detaljer i dets ætiologi, mangler der en omfattende forståelse af de mange underliggende mekanismer. Ydre hårceller er særligt sårbare over for akustisk overeksponering6. Mekanofølsomme cochlear hårceller er involveret i aldersrelateret høretab; Imidlertid forbliver de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for hårcelledegeneration, ukendte. Flere ændringer i de molekylære processer fører til hårcellers aldring, oxidativ stress, DNA-skaderespons, autofagi og dysregulering af ekspression og transkription af gener relateret til hårcellespecialisering7.
Da det indre øre er indkapslet i tindingeknoglen, dybt inde i kroppens hårdeste knogle, er det eksperimentelt utilgængeligt, hvilket udgør en udfordring for undersøgelser af mekanismerne for reparation og regenerering af hårceller. Derfor er etablering af in vitro-kulturer til undersøgelse af hårcellers funktion blevet en ideel metode til forskning i det indre øres regenererings- og skademekanismer. Procedurerne til fremstilling af cochlear organotypiske kulturer er blevet beskrevet i tidligere studier 8,9,10. Forskere over hele verden har anvendt forskellige cochlear mikrodissektion og overfladebehandlingsteknikker. På trods af de vedvarende udfordringer er forskellige primære hårcellekultursystemer med succes blevet etableret in vitro. Cochlear organkulturer indeholder forskellige celletyper, herunder hårceller, Deiters-celler, Hensens celler, søjleceller og auditive nervefibre. En dybdegående forståelse af ændringerne i hårceller på cellulært og molekylært niveau efter skade vil muliggøre udviklingen af mere kraftfulde forskningsværktøjer. Denne undersøgelse havde til formål at demonstrere trinene til isolering af cochlear organer fra neonatale mus og enzymatisk løsrivelse af de rigelige hårceller til in vitro-undersøgelser. Arten af de dyrkede celler blev bekræftet ved anvendelse af immunofluorescensfarvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt (nr. 2021-847) af Xi'an Jiaotong University Committee on the Use and Care of Animals.
1. Sterilisering og materialeforberedelse
- Dissektionsværktøjerne steriliseres ved hjælp af desinfektion af højtemperatur- og højtryksdamp, og de tørres i en 50 °C inkubator natten over.
- Der fremstilles på forhånd 100 ml af dyrkningsmediet indeholdende 10 % føtalt bovint serum (FBS) og 10 mg/ml penicillin/streptomycin (der tilsættes 10 ml FBS og 10 μL penicillinstamopløsning til 90 ml Dulbeccos modificerede ørnemedium (EMEM) og opbevares ved 4 °C.
2. Dissektion og fjernelse af den tidlige knogle til indsamling af auditiv epitel
- Aflive i alt 10 nyfødte mus (i alderen mellem P3 og P5) ved halshugning på is. Brug om nødvendigt en alternativ, etisk godkendt metode.
- Hold hovedet på plads, åbn hovedbunden langs sagittalsuturen ved hjælp af mikrooperativ saks, og adskil og fastgør hovedbunden bilateralt med fingrene, som vist i figur 1A.
- Fjern hjernen ved hjælp af en lille periosteal elevator og skær basalkraniet. Skær kraniet med en saks og vend fremad for at åbne kraniet; Brug spidsen af saksen til at skrabe hjernen og udsætte bunden af kraniet.
- Overhold de bilaterale tidsmæssige knogler i bunden af kraniet (figur 1C). Brug en saks til at klippe bunden af kraniet langs midterlinjen, skrab huden væk og fjern unødvendig knogle (figur 1D, D ').
- De temporale knogler opbevares og overføres til 35 mm sterile petriskåle, der indeholder frisk Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) (figur 1E).
- Brug to #5-spidsede tang til at fjerne bulla og omgivende væv fra den petroøse del af den tidlige knogle (figur 1E).
BEMÆRK: På dette stadium ville den benede labyrint i musenes temporale knogle ikke blive fuldstændig forkalket og ville let blive dissekeret ved hjælp af tang. - Hold tangen med den ene hånd for at fastgøre den halvcirkelformede del af den tidlige knogle og stik tangens nederste fod ind i den runde vinduesniche med den anden hånd for at adskille cochleas laterale knogle fra scala vestibulen. Fjern forsigtigt den petrous del af den tidlige knogle uden at røre OC-epitelet. Derefter adskilles og fjernes den benede labyrint af cochlea fra basalenden til den apikale ende (figur 1F).
- Mikroisoler forsigtigt organet i Corti sensoriske epitel fra modiolus ved hjælp af # 5-spidse tang (figur 1G).
- Hold spiralledbåndet, adskil det forsigtigt fra stria vascularis med mikrooperative pincet, og overfør det rene auditive epitel til en 3 mm steril kulturskål indeholdende HBSS ved hjælp af en 200 μL pipette (figur 1H).
- Der indsamles 20 prøver fra hvert dyr, og de overføres hurtigt til en 100 mm steril petriskål indeholdende HBSS til næste tilberedningstrin (figur 1).
3. Enzymatisk disaggregering til opnåelse af auditive hårceller
- Det auditive epitel overføres til 10 ml frisk DMEM indeholdende 0,25% trypsin og inkuberes ved 37 °C i 12 minutter.
- Brug en 200 μL pipettespids til forsigtigt at adskille hårcellerne fra basallamina og andre celler under et operationsmikroskop.
- Tilsæt yderligere 10 ml dyrkningsmedium for at hæmme disaggregeringen.
- De suspenderede celler i dyrkningsmediet filtreres gennem et 70 μm filter, filtratet opsamles i et rent 50 ml rør, og centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter.
- Resuspender hårcellerne i mindst 5 ml dyrkningsmedium ved forsigtigt at pipettere dem op og ned med en 1.000 μL pipettespids. Undgå at indføre bobler.
- Placer en dæksel i bunden af en plade med seks brønde på forhånd. Tæl cellerne og dyrk dem med en densitet på 106 celler / ml i plader med seks brønde.
- De vedhængende celler dyrkes i 2 ml DMEM (indeholdende 10 % FBS, 100 enheder/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin) ved 37 °C og 5 % CO2. Skift kulturmediet hver dag.
BEMÆRK: Det skal nævnes, at brug af denne protokol ikke resulterer i opnåelse af rene hårceller. Baseret på denne primære cellekulturmetode anbefaler vi at bruge d2- eller d3-celler til yderligere undersøgelser, da hårceller kan udgøre ca. 70% af cellerne i kultur og være i god tilstand.
4. Immunofluorescerende farvning
- Høst de dyrkede celler fra d1 til d6 (en brønd om dagen). Opsug dyrkningsmediet og skyl cellerne 2x med fosfatbufret saltvand (PBS).
- Fastgør celler med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Fjern fikseringsmidlet og skyl cellerne i 3 x 3 min med PBS.
- Permeabiliser cellerne med PBS indeholdende 0,2% Triton X-100 i 10 minutter ved RT.
- De permeabiliserede celler inkuberes med en blokerende opløsning bestående af 10% FBS i PBS i 20 minutter ved RT.
- Plet cellerne med antimyosin monoklonalt antistof (fortyndet ved 1:200 i PBS) ved 4 °C natten over.
- Vask cellerne 3x med steril PBS og inkuber dem med sekundært antistof (Alexa Fluor 594 ged anti-kanin MYO7A, fortyndet 1:500 i PBS) og fluorescein-mærket phalloidin (Alexa Fluor 488, for at identificere cellestruktur) i 2 timer ved RT.
- Skyl cellerne 3x med PBS for at fjerne de sekundære antistoffer.
- Tilsæt 1-2 dråber monteringsmedium med DAPI på diasene, monter dækslerne, og læg dem under et laserscanningskonfokalmikroskop for at tage fotos af cellerne.
5. Statistisk analyse
- Udfør tovejsanalyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Tukeys post hoc-tests for at analysere ændringerne i de grå værdier af myosin-VIIa og phalloidin over tid. Brug bogstavmarkeringsmetoden til at markere statistiske forskelle.
- Udfør yderligere envejs ANOVA'er efterfulgt af Tukeys post-hoc-tests for at sammenligne phalloidin-positive celleforhold mellem celleprøver fra dag 1 til dag 6 og myosin-VII-positivt celleforhold på de samme dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter denne protokol podede vi de isolerede celler. Primære cochlear hårcellefrø blev betragtet som vellykkede, hvis cellerne ikke flød i dyrkningsmediet og spredte sig inden for 24 timer. Vi bestemte antallet af hårceller, efter at de klæbede og spredte sig til flade aggregater i bunden af skålen. Efter 1 dag blev levende hårceller tæt klæbet til bunden af kulturskålen, og ikke-klæbende celler blev fjernet ved skylning med PBS. Antallet af celler fordobledes typisk efter 3 d kultur (figur 2).
Immunofluorescens (IF) afslørede ekspressionen af myosin-VIIa og phalloidin indtil d6 (figur 3A). Vi observerede, at myosin-VIIa grå værdi og positivt celleforhold faldt med tiden, mens phalloidin grå værdi og positivt celleforhold forblev det samme sammenlignet med dem ved d1 efter dyrkning (figur 3B-D). Vi brugte en organisk kultur som en positiv kontrol for at verificere, at de myosin-VIIa-positive celler faktisk var hårceller. Supplerende figur S1 viser immunofluorescensfarvning af myosin-VIIa (grøn), phalloidin (grøn) og 4′6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, blå) i det auditive epitel efter 2 dages kultur.
Ved hjælp af IF bekræftede vi, at de opnåede celler var hårceller. Især observerede vi, at de fleste dyrkede celler viste positiv farvning for den auditive cellemarkør myosin-VIIa (rød) protein, der også udviser et langstrakt udseende under et fluorescensmikroskop (figur 3A). Disse resultater antydede, at de dyrkede celler hovedsageligt var hårceller.
Figur 1: Dissektion og fjernelse af den tidlige knogle til indsamling af auditiv epitel. (A) Halshugning og åbning af kraniet langs sagittal sutur; (B) fjernelse af hjernen. (C) Udsigt over de bilaterale temporale knogler placeret i kraniebasen. De højre temporale knogler (D) efter fjernelse af knogler og tissurer omkring tindingeknoglen (D') markeret med OC og PSD. E) Overførsel af tidsmæssige knogler til frisk Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS), fjern båndene og læg dem med den ovale vinduesside opad. (F) Adskil forsigtigt og fjern cochleas knoglelabyrint fra basalen til den apikale ende. Organet af Corti sensorisk epitel (G) klæbede til stria vascularis, (H) adskilt fra stria vascularis. Skalastænger = 1.000 μm (C-H). Forkortelser: OC = Cortis organ; PSD = bageste halvcirkelformede kanal; SV = stria vaskularis. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Hårceller 4 dage efter dyrkning. Let mikroskopisk undersøgelse 4 dage efter dyrkning. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Påvisning af hårcelleoverflademarkører ved hjælp af immunfluorescens . (A) Myosin-VIIa (rød), phalloidin (grøn) og DAPI (blå) immunofluorescensfarvning fra dag 1 til dag 6 efter cellekultur. (B, C) Grå værdianalyse af myosin-VIIa og phalloidin; Statistiske forskelle er angivet med bogstaver. (D) Sammenligning af phalloidin-positivt celleforhold mellem celleprøver fra dag 1 til dag 6 og myosin-VII på de samme dage. Store bogstaver repræsenterer statistiske resultater for phalloidin, mens små bogstaver repræsenterer statistiske resultater for myosin-VIIa. Data præsenteres som middelværdiens gennemsnitlige ± standardfejl. N = 5; skalabjælke = 50 μm. Tovejsanalyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Tukeys post hoc-test blev udført til gråværdianalyse af myosin-VIIa og phalloidin. Envejs ANOVA blev udført til sammenligning af phalloidin og myosin-VII-positivt celleforhold mellem celleprøver fra d 1 til d 6. Forskellige bogstaver angiver statistiske forskelle i phalloidinfarvning, mens små bogstaver angiver statistiske forskelle i myosin-VIIa-farvning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Immunofluorescensdetektion af hårcelleoverflademarkører i organisk kultur. Immunofluorescensfarvning af myosin-VIIa (grøn), phalloidin (grøn) og DAPI (blå) blev udført på d 2 af organisk kultur. Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: IHC, indre hårcelle; OHC, ydre hårcelle; DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Immunofluorescensdetektion af overflademarkører i gennemborede hårceller. (A) Immunofluorescensfarvning af myosin-VIIa (rød), phalloidin (grøn) og DAPI (blå) blev udført på organiske kulturer ved passager 2 og 3. (B) Sammenligning af antallet af phalloidin-positive celler, myosin-VIIa-positive celler og samlede celler fra primære celler til passage 3. N = 3; skalabjælke = 100 μm. Data vises som gennemsnittet ± standardafvigelsen. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med HEI-OC1-cellelinjen replikerede primære kulturer af hårceller mere præcist den fysiologiske tilstand af celler in vivo. Derfor synes den auditive primære kulturmetode, der er etableret ved at isolere levende celler fra cochlear organer og straks dyrke dem, at være et værdifuldt værktøj til omfattende forskning i auditive systemer. Visse teknikker er afgørende for en vellykket kultur. For det første øger minimering af varigheden af adskillelsen af Corti-organet fra den tidlige knogle sandsynligheden for vedvarende aktivitet af hårceller. Derfor er det bydende nødvendigt for forskere at minimere tidsintervallet mellem dissektion og nedsænkning af organer i PBS. Baseret på vores eksperimentelle observationer er en varighed på ca. 2-3 timer tilstrækkelig til at dissekere 10 mus og opnå de 20 indre ører ad gangen. Under den enzymatiske disaggregeringsproces anbefales det at begrænse varigheden til 12 min og overføre cochlear organerne til pipetter efter en inkubationsperiode på 8 min. Organerne blev observeret under et mikroskop efter ca. 10 pipetteringscyklusser, og den enzymatiske disaggregering blev stoppet, da næsten alle cellerne havde løsnet sig fra basilarmembranen. Ellers blev organerne returneret til inkubatoren i yderligere 4 minutter. Valget af antibiotika er også vigtigt. Vi anbefaler at bruge 10 mg / ml penicillin / streptomycin for at forhindre potentielle forureningsproblemer, fordi nogle aminoglycosidantibiotika kan være ototoksiske og føre til hårcelledød.
Selvom myosiner i klasse VII udtrykkes bredt i dyrevæv, udtrykkes myosin-VIIa kun i hårcellerne i det indre øres vestibulære og cochleære organer alene. Klasse VIIa myosiner spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af stereociliastrukturen, da de hjælper med at forbinde stereocilia ved ankelforbindelsesområdet i hårceller11. Efter en stigning i varigheden af den primære cellekultur og antallet af cellepassager steg nedbrydningen af myosin-VIIa også over tid, mens phalloidin forblev stabil, hvilket indikerer, at de auditive cellers funktion faldt med tiden. Den største begrænsning ved denne protokol er, at auditive celler kun kan bruges inden for 6-7 dage og tager længere tid at vokse end HEI-OC1-celler12. Desuden er det uundgåeligt, at primære celler til sidst senescerer og dør og udviser begrænset vækstpotentiale. Desuden er tids- og økonomiomkostningerne ved isolering og dyrkning af hårceller ofte høje og kræver omfattende ekspertise. Corti-organet indeholder en række neurosensoriske celler, herunder indre hår, ydre hår og støtteceller. Denne protokol introducerede en metode til adskillelse og dyrkning af disse celler in vitro. Primære celler kan skelnes mellem hår og støtteceller ved farvning for myosin-VIIa og Sox2, henholdsvis13,14. Ydre og indre hårceller udfører forskellige funktioner. Ydre hårceller ændrer hurtigt deres længde og stivhed som reaktion på ændringer i membranpotentiale og transduceres til indre hårceller. Prestin er et motorisk protein i de ydre hårceller, mens Slc17a8 (vGlut3) udtrykkes specifikt i IHC'er og kan bruges til at skelne indre hårceller in vitro15,16,17,18.
Sammenlignet med organiske kulturer ændres hårcellernes morfologi signifikant i primære hårcellekulturer, hvilket resulterer i forskellige morfologier og mekanotransduktionsfunktioner. Organiske kulturer er tredimensionelle primære cellekulturer, der udviser stereotype cellulære mønstre, polaritet, hårbundtdannelse og neurale forbindelser inden for Corti-organerne. I modsætning hertil har primære HEI-OC1-celler en typisk polygonal form og vokser fladt gennem statisk vedhæftning i et todimensionelt kulturmiljø19. Organiske kulturer og primære celler isoleres direkte fra væv og udviser normal cellemorfologi og vigtige funktionsrelaterede markører. Men i modsætning til HEI-OC1-celler, som generelt er meget proliferative, lettere at dyrke og transfektere og kan opretholdes i årtier, har disse celler en begrænset levetid og begrænset ekspansionskapacitet.
Primære celler har mange fordele i cellekultur. Da primære celler opnås fra kropsvæv og dyrkes under optimale vækstbetingelser, efterligner de nøje in vivo-vævsmiljøet. Brugen af primære celler undgår mange etiske indvendinger om dyreforsøg og giver mere relevante resultater end cellelinjer. Forudvalgte primære celler er passende modeller, der nøje repræsenterer molekylær signalering in vivo. Celler fra forskellige donorer reagerer forskelligt på proinflammatoriske cytokiner. Omkostningerne ved isolation og kultur er ofte høje, selv om de er billigere end dyremodeller. De materialer og dyr, der blev anvendt i den primære hårcellekultur, der er beskrevet her, var enkle, deres omkostninger var relativt lave, og systemet var let at betjene. Hvis optimale dyrkningsbetingelser ikke opretholdes, kan de primære cellers egenskaber ændre sig med efterfølgende passager. Da antallet af passager steg, svækkedes celletilstanden også (supplerende figur S2). Da de blev afledt direkte fra indfødte kropsvæv uden modifikation, efterlignede de opnåede auditive hårceller nøje deres in vivo-tilstand og fysiologi. Derfor giver primære hårceller et fremragende modelsystem til at studere hårcellernes fysiologi og biokemi, herunder cellemetabolisme og lægemiddeltoksicitet. Selvom primære celler kun kan opretholdes i et par dage in vitro, kan de udødeliggøres og opdeles på ubestemt tid efter genetisk transformation for at opnå sekundære cellelinjer.
Afslutningsvis beskrev den nuværende protokol isoleringen af auditive hårceller fra den tidlige knogle ved hjælp af mikrodissektion og enzymatisk disaggregering. Hele protokollen tog ca. 3 timer, fra musedissektion til celleplettering. Dyrkede celler blev opretholdt ved høj renhed og forblev sunde i 6-7 dage. På trods af de iboende begrænsninger ved primære hårcellekulturer, som er begrænset til blot to passager, anvendte denne protokol enkle metoder og materialer, hvilket præsenterede en ny vej til at udføre højeffektiv forskning i cochlear hårceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 til YG)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
- Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
- Nieman, C. L., Oh, E. S.
- Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).
- Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
- Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).
- Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
- Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).
- Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).
- Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
- Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046 (2017).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
- Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
