Summary
Ce protocole étudie l’utilisation d’un plasma riche en vésicules extracellulaires (VE) comme indicateur de la capacité de coagulation de l’EV. Le plasma riche en VE est obtenu par un processus de centrifugation différentielle et de recalcification ultérieure.
Abstract
Le rôle des vésicules extracellulaires (VE) dans diverses maladies fait l’objet d’une attention accrue, notamment en raison de leur puissante activité procoagulante. Cependant, il y a un besoin urgent d’un test au chevet du patient pour évaluer l’activité procoagulante de la VE en milieu clinique. Cette étude propose l’utilisation du temps d’activation de la thrombine du plasma riche en VE comme mesure de l’activité procoagulante des VE. Des procédures normalisées ont été utilisées pour obtenir du sang total contenant du sodium et du sang total, suivies d’une centrifugation différentielle pour obtenir du plasma riche en VE. Le plasma riche en VE et le chlorure de calcium ont été ajoutés à la coupelle d’essai, et les changements de viscoélasticité ont été surveillés en temps réel à l’aide d’un analyseur. Le temps de coagulation naturel du plasma riche en VE, APPELÉ EV-ACT, a été déterminé. Les résultats ont révélé une augmentation significative de l’EV-ACT lorsque l’EV a été retiré du plasma obtenu à partir de volontaires sains, tandis qu’elle a considérablement diminué lorsque l’EV a été enrichie. De plus, l’EV-ACT a été considérablement raccourci dans les échantillons humains de prééclampsie, de fracture de la hanche et de cancer du poumon, ce qui indique des niveaux élevés d’EV plasmatique et une promotion de l’hypercoagulation sanguine. Grâce à sa procédure simple et rapide, EV-ACT est prometteur en tant que test de chevet pour évaluer la fonction de coagulation chez les patients présentant des taux plasmatiques élevés d’EV.
Introduction
La thrombose, qui est causée par l’hypercoagulabilité, joue un rôle important dans diverses maladies, notamment les traumatismes cérébraux1, la pré-éclampsie2, les tumeurs3 et les patients fracturés4. Le mécanisme sous-jacent à l’hypercoagulabilité est complexe, et l’accent a récemment été mis sur le rôle des vésicules extracellulaires (VE) dans les troubles de la coagulation. Les VE sont des corps en forme de vésicule avec une structure bicouche qui se détache de la membrane cellulaire, dont le diamètre varie de 10 nm à 1000 nm. Ils sont associés à divers processus pathologiques, en particulier les troubles de la coagulation5. Plusieurs études ont identifié les VE comme un prédicteur prometteur du risque de thrombose 6,7. L’activité procoagulante des VE dépend de l’expression des facteurs de coagulation, principalement le facteur tissulaire (TF) et la phosphatidylsérine (PS). Les VE ayant une activité procoagulante robuste améliorent considérablement l’efficacité catalytique du complexe ténase et prothrombine, favorisant ainsi le fibrinogène médié par la thrombine et la thrombose locale8. Des niveaux élevés de VE et leur relation causale avec l’hypercoagulabilité ont été observés dans de nombreuses maladies9. Par conséquent, la normalisation de la détection des VE et de la déclaration de leur activité procoagulante est un domaine d’investigation important10.
À ce jour, seuls quelques kits commerciaux sont disponibles pour détecter l’activité procoagulante des VE. Le test MP-Activity et le test MP-TF, produits par une société commerciale, sont des tests fonctionnels utilisés pour mesurer l’activité procoagulante de l’EV dans le plasma11. Ces tests utilisent un principe similaire à celui des tests immuno-enzymatiques pour détecter le PS et le TF sur les VE. Cependant, ces kits sont coûteux et limités à quelques institutions de recherche de haut niveau. Le processus est complexe et prend beaucoup de temps, ce qui rend difficile leur mise en œuvre en milieu clinique. De plus, un test de phospholipides procoagulants (PPL) mis au point dans le commerce mélange du plasma sans PS avec du plasma d’essai, mesurant le temps de coagulation pour détecter quantitativement les niveaux de VE PS-positifs12. Cependant, ces essais se concentrent principalement sur le PS et le TF sur les VE, en négligeant d’autres voies de coagulation dans lesquelles les VE circulants peuvent être impliqués dans12.
Le système de coagulation plasmatique est complexe et comprend à la fois des composants « invisibles » et « visibles », notamment des coagulants, des anticoagulants, des systèmes fibrinolytiques et des VE en suspension dans le plasma. Physiologiquement, ces composants maintiennent un équilibre dynamique. Dans des conditions pathologiques, une augmentation significative des VE dans la circulation contribue à l’hypercoagulabilité, en particulier chez les patients souffrant de traumatismes crâniens, de prééclampsie, de fractures et de divers types de cancer13. Actuellement, l’évaluation de l’état de la coagulation dans les laboratoires cliniques implique principalement l’évaluation du système de coagulation, du système d’anticoagulation et de la fibrinolyse 14,15,16,17. Le temps de prothrombine, le temps de thromboplastine partielle activée, le temps de thrombine et le rapport normalisé international sont couramment utilisés pour évaluer les niveaux de facteurs de coagulation dans le système de coagulation18. Cependant, des études récentes ont révélé que ces tests ne reflètent pas entièrement l’hypercoagulabilité de certaines maladies19. D’autres méthodes de dosage, telles que la thromboélastométrie (TEG), la TEG rotationnelle et l’analyse Sonocolot, mesurent les changements viscoélastiques du sang total20,21. Étant donné que les échantillons de sang total contiennent de nombreuses cellules sanguines et plaquettes, ces tests sont plus susceptibles d’indiquer l’état de coagulation de l’échantillon dans son ensemble. Certains chercheurs ont fait état du rôle des cellules sanguines et des plaquettes dans l’activité procoagulante22,23. Une étude récente a également révélé que les tests de fonction de coagulation antérieurs ont des difficultés à détecter les changements dans l’activité procoagulante des microparticules24. Par conséquent, une hypothèse a été proposée selon laquelle la fonction procoagulante des VE peut être évaluée par des mesures viscoélastiques du temps de coagulation activée (ACT) dans le plasma riche en VE.
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Protocol
La collecte d’échantillons humains a été approuvée par le Comité d’éthique médicale de l’hôpital général de l’Université médicale de Tianjin. La collecte de sang veineux humain a strictement suivi les directives émises par la Commission nationale de la santé de Chine, à savoir WS/T 661-2020 Directive pour la collecte d’échantillons de sang veineux. Brièvement, du sang a été prélevé sur des personnes en bonne santé avec le consentement éclairé de la veine brachiale antérieure, et les échantillons ont été mélangés à l’aide d’un anticoagulant à 3,2% de citrate de sodium dans un rapport de 1 :9. Lorsque seuls des échantillons d’anticoagulant à base de citrate de sodium ont été prélevés, le premier récipient de collecte a été jeté. Le flux de traitement a été initié dans les 0,5 h suivant le prélèvement de l’échantillon. Des sujets adultes en bonne santé ont été recrutés pour le prélèvement d’échantillons après avoir obtenu un consentement éclairé. Les critères d’exclusion des patients étaient : (1) une thrombose intravasculaire récente, (2) une altération de la fonction hépatique et rénale, (3) une hypertension, une hyperlipidémie, un diabète et d’autres maladies chroniques, (4) un traitement à l’aspirine ou à l’anticoagulant, (5) des menstruations et une grossesse.
1. Isolement du plasma riche en VE
- Centrifuger les échantillons à 120 x g pendant 20 min à température ambiante pour éliminer les cellules sanguines. Le surnageant est un plasma riche en plaquettes. Ensuite, transférez la moitié supérieure du surnageant dans un nouveau tube à centrifuger à l’aide d’une pipette.
- Centrifuger le plasma riche en plaquettes à 1500 x g pendant 20 min à température ambiante pour éliminer les plaquettes. Le surnageant est un plasma pauvre en plaquettes. Transférez ensuite la moitié supérieure du surnageant dans un nouveau tube à centrifuger.
- Centrifuger le plasma pauvre en plaquettes à 13000 x g pendant 2 min à température ambiante pour éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est un plasma riche en VE. Ensuite, transférez la moitié supérieure du surnageant dans un nouveau tube à centrifuger pour des tests ultérieurs.
2. Détection de l’EV-ACT de l’échantillon par l’analyseur
- Mettez l’analyseur de caillots en marche (voir tableau des matériaux) et préchauffez l’appareil à 37 °C. Installez la sonde jetable et le gobelet de test, puis lancez la procédure de contrôle qualité de la machine.
REMARQUE : Lorsque la valeur du signal de résistance visqueuse à l’écran est affichée en ligne droite, cela signifie que la détection n’est pas perturbée et que le contrôle qualité de l’état de l’analyseur est qualifié. La procédure de test peut être lancée une fois l’autotest qualifié. - Entrez les informations de l’échantillon dans le système. Ensuite, transférez 200 μL de plasma riche en VE dans le godet d’essai, suivis de 20 mM 170 μL de chlorure de calcium. Cliquez sur le bouton Démarrer. La tige d’agitation magnétique dans la tasse d’essai mélangera complètement l’échantillon et le chlorure de calcium. Fermez le couvercle et la sonde commencera à détecter le changement de résistance de l’échantillon.
REMARQUE : Une fois le test terminé, l’analyseur affichera automatiquement « test terminé ». L’heure de l’EV-ACT est affichée et enregistrée par le système. Le résultat est exprimé dans l’unité de temps « seconde ». Jetez la sonde et testez la coupe.
3. Contrôle de la qualité basé sur la cytométrie en flux de l’échantillon de plasma riche en VE
- Les VE ont d’abord été identifiés par leur taille (0,1 à 1 μm). Ajustez les paramètres du cytomètre en flux à l’avance et réglez la « porte » de l’EV à l’aide de billes de polystyrène disponibles dans le commerce (0,5, 0,9 et 3,0 μm) (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE : Le mélange de billes est constitué de sphères fluorescentes de différents diamètres couvrant la gamme de tailles des microvésicules (0,5 et 0,9 μm) et des plaquettes (0,9 μm et 3 μm). - Ajustez la tension de la diffusion directe et de la diffusion latérale et assurez-vous que les microsphères de 0,9 μm tombent dans la région appropriée. La région EV peut être dessinée en fonction du diamètre de la microsphère.
- Transférez 50 μL de plasma riche en VE dans le tube d’écoulement, suivis de 450 μL de solution saline tampon phosphate filtrée. Mélangez soigneusement le liquide dans le tube d’écoulement. Enfin, détecter les échantillons à l’aide de la cytométrie en flux25.
- Utilisez les particules fluorescentes Ultra Rainbow (voir le tableau des matériaux) pour quantifier le nombre de EVs.In bref, ajoutez 10 μL de particules à l’échantillon avant la détection de l’écoulement et calculez la concentration EV à l’aide de la formule suivante une fois la détection de l’échantillon terminée : 10 120 * IL (#) / (microbilles * volume) * facteur de dilution26.
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Representative Results
Le temps d’activation de la thrombine du plasma riche en VE a été mesuré à l’aide d’un analyseur viscoélastique pour la mesure du temps de coagulation plasmatique. La machine se compose de quatre composants principaux : un convertisseur de signal électronique, une sonde, un réservoir de détection et un élément chauffant (Figure 1A,B). La sonde utilise des oscillations à haute fréquence et à faible amplitude pour détecter les changements de viscosité du plasma. Le contrôle de la qualité quotidien consiste principalement à contrôler la qualité de l’air afin d’évaluer la stabilité de la plate-forme d’essai et d’identifier toute perturbation physique de la sonde. Le contrôle de la qualité des performances implique des tests avec de l’huile de viscosité standard pour s’assurer que la valeur de résistance détectée par la sonde se situe dans la plage définie.
Après avoir obtenu du plasma riche en VE, les VE ont été mesurés à l’aide de la cytométrie en flux pour le contrôle de la qualité des échantillons. Les échantillons non qualifiés présentent un amas distinct avec une taille de particule légèrement plus grande près de la « porte » de l’EV (figure 2A). En revanche, les échantillons qualifiés riches en VE montrent que la plupart des signaux se situent à l’intérieur de la « porte » des VE en tant que groupe unique (Figure 2B).
Pour évaluer la concentration de VE dans des échantillons de plasma riche en VE provenant de volontaires sains, une centrifugation à grande vitesse (1 00 000 x g, 70 min) a été effectuée. Les résultats ont révélé qu’une augmentation de la concentration de VE raccourcissait l’EV-ACT, tandis qu’une diminution de la concentration de VE prolongeait l’EV-ACT (Figure 3A). Le temps EV-ACT peut présenter une corrélation négative avec les niveaux de EV. Plusieurs échantillons de patients cliniques ont été examinés, et les résultats ont démontré que les échantillons de plasma riche en VE provenant de patients atteints de prééclampsie, de fractures de la hanche et de cancer du poumon (de gauche à droite) avaient des temps d’EV-ACT significativement plus courts que les volontaires sains (Figure 3B).
En conclusion, une méthode expérimentale rapide et rentable pour détecter l’activité procoagulante des VE a été établie de manière préliminaire, prometteuse pour des applications cliniques dans les examens au chevet du patient.
Figure 1 : Le diagramme schématique et l’image physique de l’analyseur de caillots. (A) et (B) représentent respectivement les principaux composants de l’analyseur et les paramètres de fonctionnement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Cytométrie en flux représentative de l’EV dans le plasma riche en EV. (A) Échantillons de plasma riches en EV non qualifiés. (B) Échantillons de plasma qualifiés riches en VE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Résultats représentatifs de l’EV-ACT de l’échantillon. (A) Résultats de l’EV-ACT après élimination des VE et concentration de VE dans des échantillons riches en VE provenant de volontaires sains (de gauche à droite, suspension des sédiments après supercentrifugation, plasma riche en VE et surnageant après ultracentrifugation). (B) Résultats EV-ACT d’échantillons riches en EV provenant de volontaires et de patients sains (de gauche à droite, prééclampsie, fracture de la hanche, cancer du poumon et volontaire sain). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, la préparation de plasma riche en VE a été décrite, et la rationalité de la méthode a été vérifiée à l’aide de la cytométrie en flux. Par la suite, les échantillons de plasma recalcifié ont été analysés pour le temps d’ACT à l’aide d’un analyseur de caillots basé sur les principes de viscoélasticité24. Comme le montre la figure 3A, on a constaté que la concentration de VE obtenue par ultracentrifugation raccourcissait le temps d’EV-ACT, tandis que le surnageant après l’ultracentrifugation, qui avait réduit les niveaux de VE, présentait des temps d’EV-ACT prolongés. Ces résultats suggèrent une relation étroite entre les résultats de l’EV-ACT et les niveaux de VE. Dans la figure 3B, l’EV-ACT d’échantillons de plasma de patients atteints de prééclampsie, de fractures de la hanche et de cancer du poumon a été comparé à celui de volontaires sains, révélant des temps d’EV-ACT significativement plus courts dans les groupes pathologiques. Des rapports antérieurs ont indiqué des niveaux élevés de VE favorisant la coagulation dans le plasma pour ces maladies 27,28,29. Cependant, il convient de noter que d’autres facteurs présents dans le plasma peuvent influencer les résultats de l’EV-ACT, et qu’une exploration plus approfondie de ces facteurs d’influence est justifiée. Ce test propose de reconnaître le rôle crucial des VE dans l’état d’hypercoagulabilité de certaines maladies et de remédier à l’absence d’une méthode de détection rapide et peu coûteuse de l’activité procoagulante des VE.
Dans le système d’échantillons de sang isolés, les substances liées à la coagulation peuvent être divisées en cellules sanguines, plaquettes, métabolites cellulaires (principalement les VE) et autres composants « invisibles » (tels que les facteurs de coagulation et les facteurs anticoagulants)30,31,32. Compte tenu de la complexité du mécanisme de coagulation, le système de détection a été simplifié pour utiliser du plasma riche en VE afin de minimiser les interférences dues à d’autres facteurs. Les étapes clés de ce processus comprennent la prévention de la génération de VE artificielles pendant le traitement des échantillons et la minimisation de la contamination plaquettaire. Par conséquent, il est nécessaire de lancer la procédure de centrifugation différentielle dans les 0,5 h et de terminer la détection dans les 2 heures suivant le prélèvement de l’échantillon. Des études antérieures ont démontré que l’utilisation d’une force centrifuge suffisamment élevée et le maintien de la moitié supérieure du surnageant peuvent réduire efficacement la contamination plaquettaire33. La cytométrie en flux a été utilisée pour détecter les plaquettes résiduelles dans le plasma riche en VE, confirmant leur très faible présence. Les échantillons non qualifiés résultent principalement d’une contamination plaquettaire et d’une fragmentation cellulaire provoquée par le processus de manipulation. La contamination plaquettaire est caractérisée par la présence de particules à l’extérieur de la « porte » des VE, tandis que la fragmentation cellulaire apparaît comme un groupe distinct à l’intérieur de la « porte » des VE.
Des études récentes ont confirmé des niveaux significativement élevés de VE plasmatiques dans certaines maladies34,35. Ces VE favorisent principalement la coagulation par la présence de phosphatidylsérine (PS) et de facteur tissulaire (TF) à leur surface. Par conséquent, le temps d’ACT du plasma riche en VE dépend en grande partie du niveau de VE coagulant. L’une des limites de ce test est la nécessité de s’assurer que les niveaux de facteurs de coagulation ne changent pas de manière significative dans la mesure où ils ont un impact sur le temps de coagulation pendant l’analyse EV-ACT. Cependant, les études sur les changements dans les niveaux de facteurs de coagulation après l’apparition de la maladie sont relativement rares, et leur effet sur l’EV-ACT doit être évalué dans le cadre de recherches ultérieures. De plus, l’utilisation excessive de médicaments anticoagulants peut affecter de manière significative les résultats de l’EV-ACT, de sorte que cette méthode ne doit pas être utilisée pendant un tel traitement.
Il existe plusieurs méthodes pour déterminer les VE procoagulantes, chacune ayant ses avantages et ses inconvénients. Piwkham et al. ont évalué l’activité procoagulante des VE en mélangeant la suspension des VE avec du plasma normal et en observant le moment de la formation des caillots sanguins dans un bain-marie à 37 °C36. Bien que cette méthode soit simple, l’observation subjective du temps de formation des caillots peut entraîner des variations de résultats entre différents observateurs. Patil et al. ont utilisé un test de coagulation standardisé interne pour les tests de microparticules procoagulantes en utilisant du venin de vipère Russell sur un coagulomètre semi-automatisé37. Cette méthode de détection utilise un équipement semi-automatique, offrant une efficacité et une simplicité élevées. Cependant, l’ajout de venin de vipère de Russell pour activer le facteur X ne tient pas compte de la présence d’autres anticoagulants dans le plasma, tels que la protéine lactadherine. Cette méthode évalue les résultats en fonction de l’équilibre entre les VE procoagulants et les composants anticoagulants dans le plasma, ce qui permet de refléter plus précisément la fonction de coagulation de l’échantillon de plasma.
Les tests de la fonction coagulante existants se concentrent principalement sur le temps d’activation de la thrombine dans le sang total ou le sang riche en plaquettes, ou détectent les carences en facteurs de coagulation24. La mise au point d’une méthode d’essai de l’activité procoagulante des VE aidera à élucider le rôle des VE dans la maladie et les traitements futurs. Le processus simple de préparation de l’échantillon, impliquant l’ajout de CaCl2 uniquement, permet aux cliniciens de déterminer rapidement l’état de la fonction de coagulation des patients. Le test EV-ACT est facile à réaliser, avec des résultats disponibles en 10 à 15 minutes, ce qui le rend bien adapté au développement en tant que test de chevet du patient. Des études antérieures ont provisoirement identifié des applications de l’EV-ACT dans la prééclampsie, les tumeurs et les fractures. Les recherches futures continueront d’explorer les perspectives d’application clinique de l’EV-ACT.
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Disclosures
Tous les auteurs ont déclaré qu’il n’y avait pas de conflits d’intérêts potentiels.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, subvention n° 81930031, 81901525. De plus, nous remercions Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. pour nous avoir fourni des machines et des conseils techniques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
| Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
| Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
| Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
| LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
| Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |
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