Summary
このプロトコルは、EVの凝固能力の指標として細胞外小胞(EV)が豊富な血漿の使用を調査します。EVに富む血漿は、差動遠心分離とその後の再石灰化のプロセスによって得られます。
Abstract
さまざまな疾患における細胞外小胞(EV)の役割は、特に強力な凝固促進活性により、ますます注目を集めています。しかし、臨床現場でのEVの凝固促進活性を評価するためのベッドサイドテストが緊急に必要とされています。この研究は、EVの凝固促進活性の尺度として、EVリッチ血漿のトロンビン活性化時間の使用を提案しています。標準化された手順を使用してナトリウムクエン酸全血を採取し、続いて差動遠心分離を行ってEVに富む血漿を得ました。EVリッチ血漿と塩化カルシウムをテストカップに加え、分析装置を使用して粘弾性の変化をリアルタイムで監視しました。EV-ACTと呼ばれるEVリッチプラズマの自然凝固時間を決定しました。その結果、健康なボランティアから得られた血漿からEVを除去するとEV-ACTが有意に増加し、EVを濃縮すると有意に減少することが明らかになりました。さらに、子癇前症、大腿骨頸部骨折、肺がんのヒト検体ではEV-ACTが有意に短縮され、血漿EV濃度の上昇と血液凝固亢進の促進が示された。EV-ACTは、その簡単で迅速な手順により、血漿EVレベルが高い患者の凝固機能を評価するためのベッドサイドテストとして有望です。
Introduction
凝固亢進によって引き起こされる血栓症は、脳外傷1、子癇前症2、腫瘍3、骨折患者4など、さまざまな疾患で重要な役割を果たしています。凝固亢進のメカニズムは複雑であり、近年、凝固障害における細胞外小胞(EV)の役割が注目されています。EVは、直径10nmから1000nmの範囲で、細胞膜から剥離する二重層構造を持つ小胞状の物体です。それらはさまざまな疾患プロセス、特に凝固障害に関連しています5。いくつかの研究により、EVが血栓症リスクの有望な予測因子であることが確認されています6,7。EVの凝固促進活性は、凝固因子、主に組織因子(TF)とホスファチジルセリン(PS)の発現に依存します。強力な凝固促進活性を持つEVは、テナーゼとプロトロンビン複合体の触媒効率を大幅に高め、それによってトロンビン媒介性フィブリノーゲンと局所血栓症を促進します8。EVのレベルの上昇と凝固亢進との因果関係は、多くの疾患で観察されています9。したがって、EVの検出を標準化し、その凝固促進活性を報告することは、重要な調査分野です10。
現在まで、EVの凝固促進活性を検出するための市販キットはごくわずかです。MP-ActivityアッセイおよびMP-TFアッセイは、営利企業によって製造され、血漿中のEVの凝固促進活性を測定するために使用される機能アッセイです11。これらのアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイと同様の原理を採用して、EVのPSおよびTFを検出します。しかし、これらのキットは高価であり、少数の高レベルの研究機関に限定されています。このプロセスは複雑で時間がかかるため、臨床現場での実装は困難です。さらに、市販の凝固促進剤リン脂質(PPL)アッセイは、PSフリー血漿と試験血漿を混合し、凝固時間を測定してPS陽性EVのレベルを定量的に検出します12。しかし、これらのアッセイは、主にEVのPSとTFに焦点を当てており、循環するEVが関与している可能性のある他の凝固経路を見落としています12。
血漿凝固システムは複雑で、凝固剤、抗凝固剤、線溶系、血漿中に懸濁したEVなど、「目に見えない」成分と「見える」成分の両方で構成されています。生理学的には、これらの成分は動的なバランスを維持しています。病理学的状態では、循環中のEVの有意な増加は、特に脳外傷、子癇前症、骨折、およびさまざまな種類の癌の患者において、凝固亢進に寄与します13。現在、臨床検査室における凝固状態の評価は、主に凝固系、抗凝固系、および線溶系の評価を含む14,15,16,17。プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、トロンビン時間、および国際正規化比は、凝固システム18における凝固因子レベルを評価するために一般的に使用される。しかし、最近の研究では、これらの検査が特定の疾患の凝固亢進を完全には反映していないことが明らかになっています19。血栓エラストメトリー(TEG)、回転TEG、ソノクロット分析などの他のアッセイ法では、全血の粘弾性変化を測定します20,21。全血検体には多数の血球と血小板が含まれているため、これらの検査は検体全体の凝固状態を示す可能性が高くなります。一部の研究者は、凝固促進活性における血球と血小板の役割について報告しています22,23。最近の研究では、以前の凝固機能検査では、微粒子の凝固促進活性の変化を検出するのが困難であることも発見されました24。そこで、EVリッチ血漿中の活性化凝固時間(ACT)の粘弾性測定により、EVの凝固促進機能を評価できるという仮説が提唱されている。
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Protocol
ヒト検体の収集は、天津医科大学総合病院の医療倫理委員会によって承認されました。ヒト静脈血の採取は、中国国家衛生健康委員会が発行したガイドライン、すなわちWS / T 661-2020静脈血検体の収集に関するガイドラインに厳密に従いました。簡単に説明すると、前上腕静脈からインフォームドコンセントを得て健康な人から血液を採取し、サンプルを3.2%クエン酸ナトリウム抗凝固剤を使用して1:9の比率で混合しました。クエン酸ナトリウム抗凝固剤検体のみを採取した場合、最初の採取容器は廃棄した。処理フローは、サンプル採取から 0.5 時間以内に開始されました。成人の健康な被験者は、インフォームドコンセントを得た後、サンプル収集のために募集されました。患者の除外基準は、(1)最近の血管内血栓症、(2)肝および腎機能障害、(3)高血圧、高脂血症、糖尿病、およびその他の慢性疾患、(4)アスピリンまたは抗凝固剤治療、(5)月経および妊娠でした。.
1. EVリッチプラズマの分離
- サンプルを室温で120 x g で20分間遠心分離し、血球を除去します。上清は多血小板血漿です。次に、上清の上部1/2をピペットで新しい遠心チューブに移します。
- 多血小板血漿を室温で1500 x g で20分間遠心分離し、血小板を除去します。上清は血小板に乏しい血漿です。次に、上清の上部1/2を新しい遠心チューブに移します。
- 血小板に乏しい血漿を13000 x g で室温で2分間遠心分離し、細胞破片を除去します。上清はEVリッチ血漿です。次に、上清の上部1/2を新しい遠心分離管に移し、その後の検査を行います。
2. 分析装置による試料のEV-ACTの検出
- 血栓分析装置( 材料表を参照)の電源を入れ、装置を37°Cに予熱します。 使い捨てプローブとテストカップを取り付けてから、機械の品質管理手順を開始します。
注:画面上の粘性抵抗信号値が直線で表示されている場合は、検出が妨げられず、分析器の状態の品質管理が認定されていることを意味します。テスト手順は、セルフテストが認定された後に開始できます。 - サンプル情報をシステムに入力します。次に、200 μL の EV リッチ血漿をテストカップに移し、続いて 20 mM 170 μL の塩化カルシウムを移します。スタートボタンをクリックします。テストカップの磁気攪拌棒は、サンプルと塩化カルシウムを完全に混合します。カバーを閉じると、プローブはサンプル抵抗の変化を検出し始めます。
注:テストが終了すると、アナライザーは自動的に「テストが完了しました」というプロンプトを表示します。EV-ACTの時刻は、システムによって表示および記録されます。結果は時間「秒」という単位で表されます。プローブを廃棄し、カップをテストします。
3. フローサイトメトリーによるEVリッチ血漿サンプルの品質管理
- EVはまず、そのサイズ(0.1-1μm)で識別されました。あらかじめフローサイトメーターのパラメータを調整し、市販のポリスチレンビーズ(0.5、0.9、3.0μm)を用いてEVの「ゲート」をセットします( 材料表参照)。
注:ビーズ混合物は、マイクロベシクル(0.5および0.9μm)および血小板(0.9μmおよび3μm)のサイズ範囲をカバーする異なる直径の蛍光球で構成されています。 - 前方散乱光と側方散乱光の電圧を調整し、0.9 μmの微小球が適切な領域に収まるようにします。EV領域は、微小球の直径に応じて描くことができます。
- 50 μL の EV リッチ血漿をフローチューブに移し、続いて 450 μL のろ過済みリン酸緩衝生理食塩水を移します。フローチューブ内の液体を完全に混合します。最後に、フローサイトメトリー25を用いてサンプルを検出します。
- Ultra Rainbow Fluorescent Particles( 材料表を参照)を使用して、EVs.In ブリーフの数を定量し、フロー検出前に10 μLの粒子をサンプルに添加し、サンプル検出完了後に次の式を使用してEV濃度を計算します:10,120 * EV(#)/(マイクロビーズ*容量)*希釈係数26。
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Representative Results
EVリッチ血漿のトロンビン活性化時間は、プラズマ凝固時間測定用粘弾性法分析装置を用いて測定した。この機械は、電子信号変換器、プローブ、検出タンク、発熱体の4つの主要コンポーネントで構成されています(図1A、B)。このプローブは、高周波および低振幅の振動を利用して、プラズマ粘度の変化を検出します。日常の品質管理には、主にテストプラットフォームの安定性を評価し、プローブの物理的な障害を特定するための空気品質管理が含まれます。性能品質管理では、プローブによって検出された抵抗値が設定範囲内に収まることを確認するために、標準粘度オイルでテストします。
EVリッチ血漿を取得した後、サンプルの品質管理のためにフローサイトメトリーを使用してEVを測定しました。不適格なサンプルは、EVの「ゲート」付近にわずかに大きい粒子径の明瞭なクラスターを示します(図2A)。対照的に、EVリッチなサンプルは、ほとんどの信号が単一のグループとしてEVの「ゲート」内にあることを示しています(図2B)。
健康なボランティアからの EV に富む血漿サンプル中の EV 濃度を評価するために、超高速遠心分離 (1,00,000 x g、70 分) を実施しました。その結果、EV濃度の上昇はEV-ACTを短縮し、EV濃度の低下はEV-ACTを延長することが明らかになりました(図3A)。EV-ACT時間は、EVレベルと負の相関を示す可能性があります。臨床患者からのいくつかのサンプルを調べたところ、子癇前症、大腿骨頸部骨折、および肺がんの患者からのEVリッチ血漿サンプル(左から右へ)は、健康なボランティアと比較してEV-ACT時間が有意に短いことが実証されました(図3B)。
結論として、EV凝固促進剤活性を検出するための迅速で費用対効果の高い実験法が予備的に確立され、ベッドサイド検査での臨床応用が期待されています。
図1:血栓分析装置の概略図と物理イメージ。 (A)と(B)は、それぞれ分析装置の主要コンポーネントと動作設定を表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:EVリッチ血漿中のEVの代表的なフローサイトメトリー。 (A)不適格なEVリッチ血漿サンプル。(B)適格なEVリッチ血漿サンプル。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:サンプルのEV-ACTの代表的な結果。 (A)EV除去後のEV-ACT結果と、健康なボランティアのEVリッチサンプル中のEV濃度(左から右へ、超遠心分離後の沈殿物の懸濁、EVリッチ血漿、超遠心分離後の上清)。(B)健康なボランティアと患者(左から右へ、子癇前症、大腿骨頸部骨折、肺がん、健康なボランティア)からのEVリッチサンプルのEV-ACT結果。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、EVリッチ血漿の調製について記述し、フローサイトメトリーを用いてその方法の合理性を検証した。続いて、再石灰化した血漿試料を、粘弾性原理24に基づく血栓分析装置を用いてACT時間で分析した。図3Aに示すように、超遠心分離で得られたEVの濃度はEV-ACT時間を短縮する一方で、EVレベルを低下させた超遠心分離後の上清はEV-ACT時間を長くすることがわかりました。これらの知見は、EV-ACTの結果とEVレベルの間に密接な関係があることを示唆しています。図3Bでは、子癇前症、大腿骨頸部骨折、および肺がんの患者の血漿サンプルのEV-ACTを健康なボランティアと比較したところ、疾患群ではEV-ACT時間が有意に短いことが明らかになりました。以前の報告では、これらの疾患の血漿中の凝固促進EVのレベルの上昇が示されています27,28,29。ただし、血漿中に存在する他の要因がEV-ACTの結果に影響を与える可能性があり、これらの影響要因のさらなる調査が必要であることに注意する必要があります。このアッセイは、特定の疾患の凝固亢進状態におけるEVの重要な役割を認識することを提案し、EV凝固促進活性の低コストで迅速な検出方法の欠如に対処します。
単離された血液サンプルシステム内では、凝固関連物質は、血球、血小板、細胞代謝物(主にEV)、およびその他の「目に見えない」成分(凝固因子や抗凝固因子など)に分けることができます30,31,32。凝固メカニズムの複雑さを考慮して、検出システムはEVリッチプラズマに簡素化され、他の要因からの干渉が最小限に抑えられました。このプロセスの重要なステップには、サンプル処理中の人工EVの生成の防止と血小板汚染の最小化が含まれます。したがって、0.5時間以内に差動遠心分離手順を開始し、サンプル収集後2時間以内に検出を完了する必要があります。これまでの研究で、十分に高い遠心力を使用し、上清の上半分を保持することで、血小板汚染を効果的に減らすことができることが実証されている33。フローサイトメトリーを使用して、EVリッチ血漿中の残留血小板を検出し、その存在が非常に少ないことを確認しました。不適格なサンプルは、主に取り扱いプロセスによって引き起こされる血小板汚染と細胞断片化に起因します。血小板汚染は、EVの「ゲート」の外側に粒子が存在することを特徴とし、細胞の断片化はEVの「ゲート」内に明確なクラスターとして現れます。
最近の研究では、特定の疾患におけるプラズマEVのレベルが有意に上昇していることが確認されています34,35。これらのEVは、主に表面にホスファチジルセリン(PS)と組織因子(TF)が存在することで凝固を促進します。したがって、EVリッチ血漿のACT時間は、凝固剤EVのレベルに大きく依存します。この試験の限界の1つは、凝固因子のレベルがEV-ACT分析中に凝固時間に影響を与える程度に大きく変化しないことを確認する必要があることです。しかし、疾患発症後の凝固因子レベルの変化に関する研究は比較的少なく、EV-ACTへの影響はさらなる研究で評価する必要があります。さらに、抗凝固薬の過剰使用はEV-ACTの結果に大きな影響を与える可能性があるため、そのような治療中にこの方法を使用すべきではありません。
凝固促進剤のEVを決定するにはいくつかの方法があり、それぞれに長所と短所があります。Piwkhamらは、EV懸濁液を正常血漿と混合し、37°C36の水浴中で血栓形成の時間を観察することにより、EV凝固促進剤活性を評価した。この方法は簡単ですが、血栓形成時間の主観的な観察は、異なる観察者間で結果のばらつきにつながる可能性があります。Patilらは、半自動凝固計でラッセル毒蛇毒を用いた凝固促進剤微粒子試験のために、社内で標準化された凝固アッセイを採用した37。この検出方法は半自動装置を利用しており、高効率でシンプルです。しかし、第X因子を活性化するためにラッセル毒蛇毒を添加すると、血漿中のラクタドヘリンタンパク質などの他の抗凝固剤の存在が見落とされます。この方法では、血漿中の凝固促進剤EVと抗凝固成分のバランスに基づいて結果を評価し、血漿サンプルの凝固機能をより正確に反映します。
既存の凝固機能検査は、主に全血または多血小板血中のトロンビン活性化時間に焦点を当てているか、凝固因子の欠乏を検出している24。EVの凝固促進作用の試験法の開発は、疾患や将来の治療におけるEVの役割の解明に役立ちます。CaCl2のみを添加するシンプルなサンプル調製プロセスにより、臨床医が患者の凝固機能の状態を迅速に判断するのに便利なアッセイになります。EV-ACT検査は、10〜15分以内に結果が得られるため、ベッドサイドテストとしての開発に適しています。以前の研究では、子癇前症、腫瘍、および骨折におけるEV-ACTの適用が暫定的に特定されています。今後の研究では、EV-ACTの臨床応用の可能性を探っていきます。
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Disclosures
すべての著者は、潜在的な利益相反はないと宣言しました。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(81901525年)の助成金第81930031号の助成金によって支援されました。さらに、機械と技術指導を提供してくれたTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co.、Ltd.に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
| Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
| Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
| Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
| LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
| Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |
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